GC-MS 法測定不同地區(qū)生鮮牛乳中的脂肪酸組成及含量

劉 兵

（商丘職業(yè)技術學院，河南 商丘 476000）

生鮮牛乳中的主要固體成分為脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖， 其中， 脂肪含量最高， 一般在3%～5%（W/V），包括甘油三酯、甘油二酯、磷脂、鞘脂、非酯化脂肪酸以及膽固醇等［1］。 牛乳中的脂肪酸可以分為三大類， 即飽和脂肪酸 （saturated fatty acid，SFA）、 單不飽和脂肪酸 （monounsaturated fatty acid，MUFA） 和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），其中，長鏈飽和脂肪酸的含量普遍較高［2］。 脂肪酸的組成以及比例是牛乳質(zhì)量與營養(yǎng)價值的重要衡量指標， 而脂肪酸分子的高度結(jié)構多樣性增加了鑒定和定量的復雜性。 近年來有許多研究注重于測定生鮮牛乳中的脂肪酸的組成及含量，常見的方法有氣相色譜-氫火焰離子檢測 （gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID）、氣相色譜與質(zhì)譜連用（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）、直接進樣質(zhì)譜、液相色譜與質(zhì)譜連用 （liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）等。 GC-MS 法借助氣相色譜法的高效分析能力和質(zhì)譜的準確鑒定能力， 在脂肪酸的檢測乳品上具有一定優(yōu)勢，且定量限較低，可以達到0.001 g/100 g［3］。 GC-MS 法是一種簡單易行、 準確可靠的方法， 適用于牛乳脂肪酸的檢測。有研究結(jié)果顯示，生鮮牛乳中脂肪酸主要以飽和脂肪酸為主，其含量達到了62.43%［4］。

脂肪酸的組成和比例對牛乳質(zhì)量與營養(yǎng)價值具有重要指示和評價作用。本研究采用GC-MS 方法對3 個地區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的生鮮牛乳樣品進行檢測， 重點分析河南省牧場生鮮牛乳的脂肪酸組成特征， 并與相鄰省份河北省和山西省采集的乳樣進行比較， 以期為河南省乳業(yè)資源的合理開發(fā)和利用， 以及解析不同地區(qū)生鮮牛乳質(zhì)量差異提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

于2019 年5 月至2020 年3 月，從河南省、河北省、山西省各選取1 個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場，按照四個季節(jié)采集健康奶牛乳樣，每個季節(jié)采集1 次，每次采樣設3 個平行，每次采集的乳樣由10 頭奶牛的乳樣混合， 即每個地區(qū)采集乳樣12 份，3 個地區(qū)共36 份乳樣。采集牛乳后及時進行樣品處理和分析測定。

1.1.2 主要試劑

鹽酸、二氯甲烷、無水碳酸鈉均為分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公司；乙酰氯、無水甲醇均為色譜純， 美國默克公司產(chǎn)品；37 種脂肪酸甲酯混標品，美國Sigma 公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器與設備

6890-5975 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀，美國Agilent Technologies 公司產(chǎn)品；7683B 型自動進樣器， 美國Agilent Technologies 公司產(chǎn)品；XW-80A 型渦旋混合器， 寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；BSA124S-CW 型電子分析天平， 德國Sartorius 公司產(chǎn)品；Sorvall ST 8 低速離心機，美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；DC-0515 恒溫水浴鍋，上海衡平儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 脂肪酸的提取及甲酯化

準確量取30 mL 牛乳置于50 mL 離心管，加入5 mL 的二氯甲烷/甲醇溶液（2∶1，V/V），并加入3 mL 的鹽酸溶液（0.1 mol/L），劇烈振搖60 min 使離心管內(nèi)液體明顯分層；收集下層有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后將有機相倒入離心管，4 000 r/min離心10 min；吸取1 mL 上層有機油相進行甲酯化操作。

將以上1 mL 脂肪提取液置于10 mL 離心管，加入10%的乙酰氯甲醇溶液5 mL，氮氣保護及70℃水浴條件下振蕩60 min；隨后取出冷卻至室溫，加入6%的碳酸鈉溶液3 mL 混勻，4 000 r/min 離心10 min，取甲酯上清液進行氣相色譜分析。

1.2.2 分析條件

氣相色譜條件： 使用CP-WAX 52 CB 毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm），載氣：高純氦氣，壓力設置為95 kPa，流量為1 mL/min，以不分流模式進行注射。 程序升溫：GC 柱溫箱以10 ℃/min 的速率從50 ℃程序升溫至175 ℃，保持15 min，然后以5 ℃/min 的速率升溫至240 ℃，在240 ℃下保持10 min， 最后以90 ℃/min 的速率升溫至250 ℃并保持5 min。 總運行時間為60 min， 進樣溫度為250 ℃，進樣量為1 μL，吹掃流速為10 mL/min，吹掃時間為2 min［5］。

質(zhì)譜條件：70 eV 的電子轟擊離子源， 質(zhì)量掃描范圍為45～700 m/z。 掃描時間為1.00 s，掃描間延遲時間為0.50 s。 質(zhì)譜儀的分辨率調(diào)整為2 000。 離子源溫度設置為250 ℃，傳輸線保持在250 ℃。

1.2.3 定性與定量方法

定性分析方法為將生鮮牛乳樣品待測組分的出峰保留時間與37 種脂肪酸甲酯混合標準品的保留時間進行比對，同時使用NIST05 譜庫進行脂肪酸的定性結(jié)構分析，確定其脂肪酸組成成分。采用面積歸一化法計算各脂肪酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有樣品按照上述處理方法進行脂肪酸分析，結(jié)果以每個地區(qū)乳樣脂肪酸含量的“平均值±標準偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸甲酯混合標準品定性

通過比較生鮮牛乳中脂肪酸甲酯的化學結(jié)構GC 保留時間與37 種脂肪酸甲酯混合標準品的保留時間，以及通過比較質(zhì)譜與NIST05 數(shù)據(jù)庫中可用的圖譜進行定性分析。 37 種混合標準品的色譜圖如圖1 所示，相對應的脂肪酸甲酯組成、出峰順序以及每種成分占比如表1 所示。 生鮮牛乳中脂肪酸甲酯的檢測結(jié)果如圖2 所示。 與標準混標圖譜相比， 生鮮牛乳樣本的脂肪酸甲酯圖譜存在少量的雜質(zhì)基線干擾， 但是各種脂肪酸甲酯的峰形和分離度均良好， 證明該分析方法適合牛乳中脂肪酸含量的測定。

表1 脂肪酸甲酯混合標準品的組成及洗脫順序 單位：%

圖1 脂肪酸甲酯混合標準品總離子流圖

圖2 生鮮牛乳中脂肪酸對應的脂肪酸甲酯隨時間變化的相對離子豐度

2.2 不同地區(qū)生鮮牛乳中脂肪酸組成及含量檢測結(jié)果

根據(jù)色譜圖中保留時間對比以及NIST05 數(shù)據(jù)庫檢索， 可以確定生鮮牛乳樣品中含量較高的脂肪酸甲酯有癸酸甲酯、月桂酸甲酯、十三烷酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸/反油酸甲酯、花生酸甲酯、木蠟酸甲酯等，通過面積歸一化法對各脂肪酸含量進行計算， 結(jié)果如表2 所示。 3 個地區(qū)的生鮮牛乳中都未檢測到反亞油酸甲酯、γ-亞麻酸甲酯、 順-15-碳烯酸甲酯、芥酸甲酯、順-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸甲酯， 原因可能是牛乳中這些不飽和脂肪酸含量本身就很低，達不到GC-MS 分析條件的檢測限。

表2 不同地區(qū)采集的生鮮牛乳中脂肪酸甲酯組成及含量（n=12） 單位：%

從河南省采集的生鮮牛乳中檢測出的脂肪酸甲酯結(jié)果來看，共檢出28 種脂肪酸；飽和脂肪酸種類有15 種，其中，癸酸甲酯［（6.66±1.45）%］、月桂酸甲酯［（4.18±0.96）%］、肉豆蔻酸甲酯［（9.01±1.76）%］、硬脂酸甲酯［（17.15±1.98）%］、棕櫚酸甲酯［（20.03±2.34）%］5 種飽和脂肪酸含量較高，占檢出脂肪酸總含量的57.03%；不飽和脂肪酸種類有13 種，多數(shù)含量較低，只有油酸/反油酸甲酯含量較高，占檢出脂肪酸總含量的32.26%。 從河北省以及山西省采集的生鮮牛乳中均檢出30 種脂肪酸，但其組成有所不同：河北省乳樣中未檢出花生酸甲酯， 山西省乳樣中未檢出順-11-二十碳一烯酸甲酯；2 個省份生鮮牛乳的脂肪酸含量檢測結(jié)果與河南省生鮮牛乳的檢測結(jié)果相似， 飽和脂肪酸含量占檢出脂肪酸總含量的比例均在60%左右。 河北省生鮮牛乳中的油酸/反油酸含量為39.80%，在3 個地區(qū)中最高。

3 討論

3.1 樣品中脂肪酸的提取

該研究使用GC-MS 法進行生鮮牛乳中的脂肪酸含量測定，該方法要求脂質(zhì)樣品經(jīng)過水解、脂肪提取、脂肪酸甲酯化等處理步驟之后，才可進樣分析。 由于牛乳中的許多脂肪是以游離態(tài)而非結(jié)合態(tài)的形式存在，所以一般不需要經(jīng)過水解過程，直接從牛乳中提取脂質(zhì)即可［6］。 脂肪酸的提取方法 常 參 考Folch 等［7］和Bligh 等［8］報 道 的 通 用 方法，前者使用氯仿/甲醇（2∶1，V/V）作為萃取溶劑，后者使用氯仿/甲醇（1∶2，V/V）加1 體積的氯仿/水（1∶1，V/V）作為提取溶劑。 近年來有許多基于上述2 種方法的脂質(zhì)提取方法改進，例如，有研究使用甲基叔丁基醚作為提取溶劑， 體系分層后有機相位于上層， 避免了傳統(tǒng)方法中收集提取液時將移液槍頭穿過上層溶液進入下層而造成的提取物污染［9］。 有研究發(fā)現(xiàn)在使用氯仿甲醇溶劑提取脂質(zhì)時加入0.1 mol/L 的鹽酸溶液可以提高樣品中的脂質(zhì)回收率［10］。在該研究中，考慮到氯仿的毒性較強且具有揮發(fā)性，因此，選擇使用二氯甲烷代替氯仿進行脂質(zhì)提取， 同時在提取溶劑中加入了0.1 mol/L 的鹽酸以提高提取效率。

3.2 脂肪酸的甲酯化

脂肪酸含有羧基的極性基團， 極性大、 沸點高，因此，不能直接進行氣相分析，需要進行脂肪酸甲酯化處理， 變成極性低且易揮發(fā)的甲酯化衍生物。常見的脂肪酸甲酯化方法有酯交換法［11］、酸堿酯化法［12］、乙酰氯-甲醇化法［13］等。 酸酯化法能夠甲基化所有脂肪酸， 但過程相當耗時并且可能導致共軛亞油酸發(fā)生結(jié)構的改變［14］。 堿酯化法反應速度快， 但存在部分脂肪酸不能被甲基化的問題。乙酰氯-甲醇化法操作簡單、結(jié)果可靠，特別適合大批量樣品的處理，因此，該研究選擇乙酰氯-甲醇法進行甲酯化處理。 從生鮮牛乳樣品中的色譜圖結(jié)果可以看出， 該研究應用的GC-MS 法檢測靈敏度高， 脂肪酸甲酯的峰形對稱與混合標準品沒有區(qū)別， 也證明了脂肪酸甲酯化的處理是成功的。

3.3 牛乳樣品中的脂肪酸含量

牛乳中存在400 余種脂肪酸［15］，然而由于檢測技術的限制，截至目前，已有的研究報道中對牛奶中脂肪酸含量的分析測定不超過50 種。牛乳中常被檢測到的脂肪酸包括丁酸（C4:0）、己酸（C6:0）、辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）、月桂酸（C12:0）、肉豆蔻酸（C14:0）、肉豆蔻油酸（C14:1）、十五烷酸（C15:0）、棕櫚酸（C16:0）、棕櫚油酸（C16:1）、十七烷酸（C17:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）和亞油酸（C18:2），以及大量低豐度脂肪酸， 包括花生四烯酸（C20:4）、二十碳五烯酸（C20:5）和二十二碳六烯酸（C22:6，DHA）。 文獻報道，牛乳中最豐富的脂肪酸有棕櫚酸、油酸、肉豆蔻酸和硬脂酸［16］，該研究中3 個地區(qū)的生鮮牛乳脂肪酸含量檢測結(jié)果與文獻報道相似。 中國荷斯坦奶牛乳中的部分營養(yǎng)成分和礦物質(zhì)元素含量接近或優(yōu)于荷斯坦奶牛和西門塔爾牛。同時，中國荷斯坦奶牛乳的脂肪酸含量和組成與荷斯坦奶牛相近， 但脂肪酸組成優(yōu)于西門塔爾牛［17］。 冷季牛乳粉的MUFA、PUFA、必需脂肪酸（essential fatty acid，EFA）含量和占比均高于暖季；而冷季牛乳粉的USFA 與SFA 比值為44.79%，暖季為38.55%［18］。 值得一提的是，該研究使用的毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）不能使油酸和反油酸的峰分離，據(jù)文獻報道，長度為100 m 的色譜柱也無法充分分離這對雙鍵異構體， 理想的分離措施是氣相進樣前先使用薄層色譜法進行預分餾［19］。

該研究選取3 個地區(qū)的生鮮牛乳進行脂肪酸含量的測定，結(jié)果表明，3 個地區(qū)生鮮牛乳的脂肪酸組成和含量都沒有明顯區(qū)別， 唯一有所差異的是它們的油酸/反油酸含量。 河北省生鮮牛乳中的油酸/反油酸含量最高，接近檢出脂肪酸總含量的40%。 3 個地區(qū)生鮮牛乳的脂肪酸中，肉豆蔻酸甲酯占比為7.11%～9.01%， 棕櫚酸甲酯占比為19.3%～20.16%， 硬脂酸甲酯占比為16.53%～17.50%，油酸/反油酸甲酯含量在脂肪酸中比例最高（32.26%～39.80%）。 據(jù)郭艷霞等［20］的研究顯示，廣西地區(qū)水牛乳中的脂肪酸含量具有明顯的季節(jié)性變化， 在夏季的飽和脂肪酸含量要明顯下降且長鏈脂肪酸占比增加，中鏈脂肪酸占比降低，而多不飽和脂肪酸含量基本不隨季節(jié)而變化。

4 結(jié)論

對從河南省、河北省、山西省規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場采集的生鮮牛乳樣品進行了脂肪酸組成及含量分析，結(jié)果表明，3 個地區(qū)生鮮牛乳中的脂肪酸含量都比較豐富，以飽和脂肪酸為主，所有脂肪酸中以油酸/反油酸甲酯含量最高，但脂肪酸組成及含量也存在一定差異。 研究結(jié)果為解析不同地區(qū)生鮮牛乳質(zhì)量差異提供了參考。