巨菌草分子研究及生態(tài)修復應用的進展

史志丹，郭呈宇，房永雨，伊風艷，劉思博，皇甫海燕，孫紅霞，丁海君

（內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010031）

巨菌草（Cenchrus fungigraminus）是單子葉綱禾本科狼尾草屬多年生直立叢生型植物，2006 年由福建農林大學菌草研究所從南非夸祖魯奈塔爾省引入我國進行培育［1］，是適宜在熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)生長的高產優(yōu)質飼草［2］。 在前人的不斷探索下引種至北方， 但是由于溫度等因素只能是一年生［3］。 目前，在海南、福建、浙江、寧夏、陜西、甘肅、新疆、內蒙古等地均有栽培種植［4］。 巨菌草產量大，且含有豐富的粗蛋白和粗纖維。處在幼嫩期的巨菌草營養(yǎng)豐富，適口性好，是飼草的優(yōu)良選擇。巨菌草植株高大直立、叢生，根系發(fā)達，在較深土層中仍發(fā)育良好［5］，因其吸附雨水和對土壤的防沖能力要強于森林和農作物， 而成為環(huán)境保護和修復的最好植物之一［6］。 目前已在生態(tài)脆弱的砒砂巖地、灘涂鹽堿地、洪積扇等地成功試種，且生物量顯著高于當?shù)貎?yōu)勢草種［7］。 巨菌草還能吸附土壤重金屬，具有修復鎘污染土壤的能力，成為一種快速、有效的土壤修復方法［8］。 另有研究表明，巨菌草體內具有豐富的內生菌，可以起到促生作用［9］。 巨菌草作為C4植物，在能源方面也有應用，可以用于發(fā)酵，其產生的沼氣用于燃燒釋放能量，產生的沼渣還可以用于制備乙醇，具有廣闊的發(fā)展?jié)摿Γ?0］。 隨著不可再生資源的減少以及人們環(huán)保意識的提升， 清潔生物質資源利用研究和關注度持續(xù)增加，由于巨菌草產熱高、灰分少、碳元素殘留少，巨菌草也被認為是一種新能源作物［9］。巨菌草作為優(yōu)質飼草、 生態(tài)治理材料和能源作物等獲得廣泛的栽培應用， 并創(chuàng)造了巨大的經濟和生態(tài)效益。本文從巨菌草遺傳分子標記開發(fā)，轉錄組研究及抗逆基因等方面對相關研究及其在生態(tài)治理修復方面的應用進行綜述， 以期為牧草種質資源的開發(fā)與利用、 優(yōu)異基因的挖掘和牧草分子育種及后續(xù)在生態(tài)治理中的應用提供參考。

1 遺傳分子標記

遺傳分子標記是能夠明確反映遺傳多態(tài)性的生物學特征的研究方法，包括形態(tài)學標記、生化標記、細胞學標記和分子標記。 形態(tài)學標記、細胞學標記、生化標記是基因表達后的標記，屬于間接標記， 而分子標記是直接對基因進行標記的一種方法，廣泛應用于生物分類和遺傳多樣性分析。近年來， 一些分子標記技術， 如簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）檢測技術、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP） 檢測技術、相關序列擴增多態(tài)性 （sequence-related amplified polymorphism，SRAP）檢測技術等被應用在苜蓿［11］、蘇 丹 草［12］、狼 尾 草 屬［13］等 禾 本 科 牧 草 的 分 類 和 鑒定中。 由于分子標記對個體來說擴增出的特異性DNA 片段具有高度特異性和穩(wěn)定性的特點，因此可以來評估種質資源、鑒定種質及新品種。簡單重復序列間標記（inter-simple sequence repeat，ISSR）技術由于具有簡單、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性、分辨率及重復性好等特點已經被廣泛應用于植物種質資源遺傳多樣性評估和親緣關系鑒定的研究［14］。 朱丹丹［15］對狼尾草屬中常用的24 種菌草ISSR 遺傳多樣性進行研究及采用傳統(tǒng)壓片法對象草（Pemisetum purpureum）和巨菌草的細胞染色體核型進行分析。 隨機擴增多態(tài)性DNA 標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD） 分子標記也是植物遺傳多樣性研究的主要技術手段之一， 它是以PCR 為基礎的DNA 檢測技術，實驗易于操作、程序簡單快速、花費較少、不受物種限制、具有通用性、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，被廣泛用于種質資源鑒定、遺傳圖譜構建、物種分類等研究領域。 馮喜［14］利用形態(tài)學、 細胞學、RAPD 和內源轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS） 分子標記研究10種禾本科菌草的親緣關系， 最終確定巨菌草的分類地位。 從分子水平上探討了狼尾草屬植物間的親緣關系。 根據(jù)RPAD 標記改進后的分子標記方法特定序列擴增（sequence characterized amplified regions，SCAR）克服了RAPD 的不穩(wěn)定性，其重復性好、對實驗要求低，操作簡單，成為較理想的分子標記工具之一， 尤其適合大量樣品的快速檢測和分析。 羅宗志［13］對狼尾草屬包括巨菌草在內的牧草品種（系）進行核型分析，并成功將RAPD 標記轉化為更加穩(wěn)定可靠的SCAR 標記， 不僅能夠鑒定生產實踐中的狼尾草屬品種（系），還能夠從分子水平上對狼尾草屬品種（系）種質資源的遺傳多樣性進行系統(tǒng)分析。 常用的分子標記如表1所示。

表1 常用分子標記特點

2 轉錄組學研究

轉錄組測序在牧草種質資源評價、 重要性狀形成機制以及優(yōu)異基因資源挖掘、 分子標記開發(fā)等方面取得了一系列重要進展。 轉錄組學可以提供全部基因的表達情況， 又可以反映基因蛋白互作的信息情況［24］。通過轉錄組測序得到的RNA 轉錄本信息完整，準確度又高，使得它在生物學、醫(yī)學、 農學等多個領域都具有十分廣泛的應用。 而RNA-Seq 技術可以直接對大多數(shù)生物體的轉錄本進行分析， 不需要了解所測物種的基因組信息背景，表現(xiàn)出很好的優(yōu)勢。 RNA-Seq 技術是目前深入研究轉錄組復雜性的強大工具， 該技術在作物抗逆、抗病基因發(fā)掘、種質資源評價中具有廣泛的應用前景。 在高丹草 （Sorghum bicolor × sudanense）［25］、黃花苜蓿（Medicago falcata）［26］、紫花苜蓿 （Medicago sativa）［27］、 高羊茅 （Festuca arundinacea）［28］、羊 草（Leymus chinensis）［29］等 重 要 牧 草中，均有利用轉錄組測序技術進行植物生長發(fā)育、抗性等相關研究。 此前研究中缺乏巨菌草的轉錄組信息。 周晶等［30］采用高通量測序技術對巨菌草幼葉和根進行轉錄組測序， 對獲得的單基因簇和差異表達基因開展功能注釋、代謝通路、轉錄因子等方面的分析及研究。 鑒定到的上調差異基因主要富集在電子傳遞、碳水化合物代謝過程、離子結合等功能； 下調差異基因主要富集在代謝過程和催化活性等過程。 其中，巨菌草幼葉、根差異表達基因最主要的轉錄因子家族是bHLH 和WRKY。該研究極大地豐富了巨菌草不同組織中的轉錄組信息， 為今后其分子生物學研究提供了寶貴的數(shù)據(jù)基礎。

實時熒光定量PCR 技術常被用于檢測基因表達與轉錄分析等研究［31］。 內參基因是內源性參照基因， 由于時空的變化，RNA 的表達水平并不恒定， 不同階段內以及不同類型的細胞或組織都可能存在差異。 使用合適的內參基因是獲得準確試驗數(shù)據(jù)的前提，因此需要根據(jù)實際實驗情況，從多種內參基因中篩選出適合自己實驗的穩(wěn)定表達的內參基因對目的基因的相對表達量進行校正和標準化［32］。 李蘇濤等［33］對巨菌草內參基因進行篩選，以巨菌草的葉片、莖、根為試驗材料，通過分析8 個基因18S rDNA、Actin、GAPDH、ACTB、EF-1α、UBQ、CYP、TUB 在正常生長、 干旱以及鹽堿脅迫下熒光定量PCR 中穩(wěn)定性表達情況，最終篩選出ACTB 為巨菌草的穩(wěn)定內參基因，為進一步開展巨菌草功能基因挖掘和功能基因表達分析奠定了基礎。

3 巨菌草抗逆基因研究

植物在生長過程中常常會受到多種逆境脅迫，而對于巨菌草來說，不耐寒的特性和對干旱有限的耐受性很大程度地限制了其推廣應用，因此，提高巨菌草對寒冷和干旱等非生物脅迫的抵抗能力對畜牧業(yè)和地球生態(tài)具有重要意義。 想要改良巨菌草的抗逆性， 最有效的辦法就是培育抗逆品種［34］，而解析巨菌草基因組信息及挖掘抗逆基因是培育抗逆品種亟待研究的問題。 2023 年，福建農林大學國家菌草工程技術研究中心林占熺團隊構建近乎完整的異源四倍體基因組， 解析了巨菌草兩套亞基因組的起源和演化過程， 并揭示了巨菌草高光合效率的機制。目前，關于巨菌草基因調控機理的研究也有少量的報道［35］。 Zhou 等［36］首次在轉錄組水平上研究了不同干旱和復水條件下巨菌草基因與干旱脅迫的關系， 為揭示巨菌草抗旱的分子機制提供新的思路， 并為抗旱研究提供了豐富的遺傳資源。 李明珠等［37］采用轉錄組測序技術對鹽脅迫下的巨菌草及鹽脅迫下外源鈣處理的巨菌草進行轉錄組測序， 發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下響應外源鈣基因顯著富集在碳水化合物代謝過程、 脂質代謝過程與光合作用過程， 外源鈣處理能通過上調這三個過程中的基因表達， 以緩解鹽脅迫對巨菌草造成的傷害。 該試驗從分子水平上研究了鹽脅迫下巨菌草響應鈣離子的差異基因表達情況，解析了鈣離子對鹽脅迫下巨菌草的影響， 為提高巨菌草的耐鹽性提供了科學參考， 對巨菌草今后在鹽堿地的種植以及鹽堿地的有效利用具有重大意義。 姜曉夢等［34］對CAMTA 轉錄因子家族進行了全基因組范圍的系統(tǒng)性鑒定和分析， 在巨菌草全基因組中總共鑒定出15 個CAMTA 轉錄因子家族成員， 鑒定到7 個CfuCAMTA 轉錄因子的啟動子上游含有響應低溫的順式作用元件，CfuCAMTA7 與模式植物擬南芥中參與正調控低溫響應的AtCAMTA3 有相似的序列特征。 研究基于巨菌草基因組序列， 探討了巨菌草CAMTA 家族成員在干旱脅迫下轉錄水平的變化， 以及CfuCAMTA 轉錄因子響應干旱脅迫的影響。

4 巨菌草在生態(tài)修復治理中的應用

4.1 調節(jié)土壤微生物

土壤微生物與地上植物的生長有密切關系，植物可以通過改變土壤微生物群落特征影響土壤環(huán)境［38］，而土壤微生物在土壤有機質分解和生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)的過程中又發(fā)揮著關鍵作用， 影響植被的發(fā)育與演替［39］。 不同生長時期的巨菌草均具有豐富的內生菌， 不僅能夠提供具有多種價值的菌種資源， 還可通過與體內和根系微生物的互作，提高種植地土壤的養(yǎng)分含量和微生物多樣性，改良荒漠化土地。 關于巨菌草在改良土壤理化特性方面已有報道。 王利蒙等［40］選擇內蒙古達拉特旗、奈曼旗、土默特左旗進行巨菌草引種實驗，發(fā)現(xiàn)種植巨菌草可有效改善土壤物理性質、 土壤透氣狀況與水分保持等性能，使土壤結構趨于穩(wěn)定。林興生等［1］研究發(fā)現(xiàn)不同生長年限的巨菌草土壤微生物對不同碳源的利用隨培養(yǎng)時間延長而增大， 種植巨菌草于荒坡地可增加其土壤微生物群落功能多樣性，在一定程度上提高土壤肥力，產生一定的生態(tài)正效應。 崔綰彤等［41］對包括巨菌草在內的6 個菌草品種種植前后的土壤養(yǎng)分、 土壤酶活性進行檢測， 采用Illumina-MiSeq 高通量測序技術對微生物群落和多樣性進行分析， 種植菌草與未種植菌草的土壤相比，速效氮、磷、全氮和有機碳等養(yǎng)分含量、 土壤脲酶活性以及土壤微生物多樣性均顯著升高。 劉鳳山等［42］收集了黃河上中下游不同地區(qū)種植巨菌草和裸地的土壤， 系統(tǒng)地分析了巨菌草對土壤肥力、 微生物和酶活性的影響。結果表明，巨菌草能降低土壤pH 值和全鉀、增加有機質、全氮、全磷、細菌、真菌、放線菌、過氧化氫酶、 多酚氧化酶和脲酶等作用， 消除裸地的影響，表明巨菌草具有改善土壤生態(tài)環(huán)境的作用。

4.2 修復土壤重金屬污染

對生態(tài)環(huán)境具有危害的重金屬污染物主要指鎘、鉛、銅、鋅、汞、鉻、鎳、類重金屬砷等。天然來源的各種重金屬對生態(tài)環(huán)境危害較小， 而人為活動包括工業(yè)污染源、 生活污染源以及農業(yè)污染源產生的各種重金屬是土壤重金屬污染的主要來源［43］。 2014 年的《全國土壤污染狀況調查公報》中顯示我國土壤環(huán)境狀況總體不容樂觀， 耕地土壤環(huán)境質量堪憂。 一些典型地塊重污染物點位超標率甚至高達36.9%［44］。 目前已有多種土壤修復技術， 而巨菌草改善土壤生態(tài)環(huán)境的同時對土壤重金屬還具有一定的富集作用， 因此被用來與鈍化劑聯(lián)合進行綜合調理。 李杰［45］以甘肅省某重金屬復合污染農田土壤為研究對象， 評估掌握了研究區(qū)土壤重金屬污染現(xiàn)狀并確立了以羥基磷灰石配施腐殖酸聯(lián)合巨菌草的處理方案進行實地土壤調理措施，可有效治理白銀復合重金屬污染農田。巨菌草促進了重金屬從土壤向植物轉移從而使土壤中活性重金屬富集，實現(xiàn)重金屬的部分去除，還能改善土壤微生物群落結構，優(yōu)化土壤微環(huán)境。宋戰(zhàn)旺［46］以膨潤土、磷酸二氫鉀、氫氧化鈣為改性劑，土壤上種植巨菌草進行聯(lián)合修復， 結果發(fā)現(xiàn)土壤中不同重金屬的降低能力為鉛＞鋅＞銅＞汞＞鎘。 隨著時間的增加， 土壤中重金屬下降幅度先增加后降低，最終確定60 d 的修復時間為最佳值，且巨菌草不同部位對重金屬吸附能力表現(xiàn)為根＞莖＞葉。 王璽洋等［47］在野外小區(qū)試驗施加不同用量稻稈炭與巨菌草聯(lián)合對銅鎘污染土壤進行修復，發(fā)現(xiàn)施加稻稈生物炭可以促進巨菌草在Cu-Cd 污染土壤中存活，提高其地上部生物量。稻稈炭在固化土壤Cu、Cd 的過程中， 一定程度上抑制了巨菌草對Cu 的吸收和富集， 但促進了巨菌草對Cd 的吸收和富集。 姬朋朋等［8］利用盆栽巨菌草實驗，研究了不同土壤Cd 濃度條件下，接種兩種叢枝菌根真菌和根內根孢囊霉后顯著降低了土壤中可交換態(tài)和可還原態(tài)Cd 含量及其生物可利用性，并顯著提高了巨菌草的重金屬富集系數(shù)， 從而提高了巨菌草修復Cd 污染土壤的能力。

4.3 水土保持和荒漠化防治

在內蒙古干旱、半干旱以及部分濕潤、半濕潤地區(qū)均存在荒漠化嚴重現(xiàn)象，荒漠化不僅造成土地生產力降低，同時對環(huán)境以及人民的生活和生產都帶來了極大的損害。 張博［48］對內蒙古烏蘭布和沙漠、土默特左旗、奈曼旗三個地區(qū)種植巨菌草前后土壤進行采樣，發(fā)現(xiàn)種植巨菌草后土壤物理指標得到改善， 且隨著種植時間的增加，土壤中各物理指標改良效果逐漸增強。 在不同種植時間內，不同樣地對土壤中各理化性質指標影響程度存在差異。 土默特左旗、奈曼旗種植巨菌草土壤改良效應最高，對烏蘭布和沙漠改良則需要繼續(xù)研究以及對改良技術進行優(yōu)化，包括結合其他植物間作綜合治理、改良種植行間距等。 梅蘭等［49］的研究表明不同生長時期的巨菌草均能明顯促進砒砂巖地區(qū)土壤細菌菌群多樣性和豐富度，有效提高土壤有機質含量。 將巨菌草種植于生態(tài)脆弱區(qū)域，能減少水土流失、緩解土壤板結程度、吸附重金屬離子，長年種植巨菌草還能降低土壤侵蝕程度。 四川省甘孜州的天然草場退化嚴重，土地沙化面積大，自然災害及森林火災頻發(fā)， 生態(tài)環(huán)境形勢嚴峻。 在甘孜州土壤退化治理中， 巨菌草對甘孜州土地貧瘠地區(qū)的土壤治理與修復具有良好效應，對甘孜州生態(tài)環(huán)境保護起到了積極作用［50］。 崩崗侵蝕是南方花崗巖低山丘陵區(qū)普遍分布的一種嚴重的水土流失類型。 植被恢復是防治崩崗侵蝕的重要方法。 何愷文等［5］研究了2 種草本植物根系對長汀縣崩崗洪積扇土壤水分狀況的影響，巨菌草和寬葉雀稗均對改善崩崗洪積扇土壤水分狀況有明顯的效果。 林占熺團隊針對黃河流域不同類型生態(tài)脆弱區(qū)的生態(tài)治理難題建立了一整套巨菌草栽培技術體系，取得了多項國際領先的研究成果［9］。 在內蒙古鄂爾多斯市準格爾旗暖水鄉(xiāng)圪秋溝開展砒砂巖區(qū)的生態(tài)修復試驗。 針對不同砒砂巖類型，建立了集整地技術、淤地壩技術、優(yōu)質菌草種苗選擇及草灌喬配置方式為一體的菌草治理技術標準，形成了以小流域為單元、獨具特色的菌草生態(tài)治理砒砂巖模式——基于雨養(yǎng)菌草建植技術的小流域空間梯層治理模式［51］。

5 小結

巨菌草在生態(tài)治理中不僅能修復生態(tài)脆弱地區(qū)、重金屬污染土壤，還能防風固沙、提高土壤中微生物的數(shù)量和多樣性，極大地改善土壤環(huán)境。除了在生態(tài)治理方面的應用， 巨菌草在其他多種應用方面已獲得豐碩的成果， 但依舊存在著一些問題。巨菌草的研究體系尚未完善，由于狼尾草屬形態(tài)上相似，因此導致菌草的命名混亂，而巨菌草由非洲引進我國，且是野生栽培品種，其種質資源遺傳背景模糊， 因此在分子生物學理論研究方面相對薄弱，從而也限制了巨菌草品種的改良。隨著測序技術和多種組學的快速發(fā)展， 對于巨菌草種質資源挖掘和優(yōu)良基因克隆及抗逆機制等方面的研究提供了分子水平的大數(shù)據(jù)平臺。