牧草葉面乳酸菌分離鑒定及青貯用優(yōu)良乳酸菌的篩選

冷 靜，彭 睿，賴先軍，2，顏 朗，2

（1.西昌學院農業(yè)科學學院，四川 西昌 615000；2.廳州共建攀西特色作物研究與利用四川省重點實驗室，四川 西昌

615000）

青貯飼料是指將新鮮青飼料切碎后，在厭氧環(huán)境下經乳酸菌發(fā)酵并抑制各種有害微生物的生長從而得到的一種柔軟多汁、 營養(yǎng)豐富的粗飼料［1］。近年來， 隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展， 青貯飼料的品質、 營養(yǎng)價值以及對動物產能的影響等方面受到高度重視［2］。 牧草表面上附著的乳酸菌等微生物是青貯飼料的發(fā)酵菌來源之一， 在青貯過程中能迅速降低pH 值，抑制有害菌的生長，降低二次發(fā)酵風險，是決定青貯品質優(yōu)劣、成敗的關鍵因素之一。 微生物的種類和數量在不同地域呈現(xiàn)出顯著的差異［3］，其菌落結構和豐度在青貯發(fā)酵的過程中也呈現(xiàn)出動態(tài)變化的趨勢， 乳酸菌等少數具有優(yōu)勢的菌種則在整個種群的變化中扮演著至關重要的角色［4］。

近年來， 對青貯飼料中天然乳酸菌的篩選和應用的研究報道較多［5］。 朱愛文等［6］研究表明，湖羊在飼喂乳酸菌后， 其營養(yǎng)物質消化率和出欄率均能得到提高， 同時羊肉品質也得到改善；Zhang等［7］的研究表明，將植物乳桿菌每日定量添加于犢牛的基礎日糧中， 可顯著提升其生長性能和營養(yǎng)物質的消化率。 雖然目前已經開發(fā)了許多乳酸菌添加劑用于生產優(yōu)質青貯飼料， 然而由于區(qū)域性環(huán)境因素的影響導致不同乳酸菌添加劑的應用效果具有地域性和環(huán)境差異。 例如，有研究表明，在西藏地區(qū)添加商品用乳酸菌制劑并不能顯著改善青貯飼料的發(fā)酵品質［8］。另有研究表明牧草表面附著乳酸菌的發(fā)酵效率高于市售乳酸菌接種劑［9］。

目前， 與青貯飼料發(fā)酵有關的乳酸菌主要分為乳桿菌屬 （Lactobacillus）、 片球菌屬（Pedicoccus）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）等7 個屬［10-12］。 然而，經研究、條件篩選以及農業(yè)農村部在《飼料添加劑品種目錄》中批準使用的作為添加劑的常用乳酸菌種類不多， 如植物乳桿菌、乳酸片球菌、布氏乳桿菌以及戊糖片球菌等， 市面上發(fā)酵菌劑產品內菌株種類結構相對單一，因此，篩選生長快速、產酸能力強、抗逆性強的乳酸菌菌株是研發(fā)優(yōu)良乳酸菌菌劑的核心， 有著重要的經濟價值，對改善青貯飼料質量，豐富飼草料種類等方面有著重要的意義。 該研究旨在從生長在四川省涼山彝族自治州（下文簡稱涼山州）本地的皇竹草、牛筋草、白茅、紫竹草、高丹草等8 種不同牧草葉面上分離出生長迅速、產酸快、抗逆性強的具有優(yōu)良潛力的乳酸菌菌株， 對于開發(fā)更多適宜應用于當地青貯飼料的優(yōu)質青貯飼料乳酸菌復合菌劑具有研究意義和實用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 牧草葉片樣品

禾本科牧草葉片采集于西昌學院農場， 包括皇竹草、牛筋草、白茅、紫竹草、高丹草、甜高粱、燕麥、黑麥草共8 種。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS 液體培養(yǎng)基：主要包括蛋白胨10 g/L，肉膏5 g/L，酵母浸出粉4 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，吐溫80 1 mL/L，葡萄糖20 g/L，調節(jié)pH 值至6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

MRS 固體培養(yǎng)基：在MRS 液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g/L； 調節(jié)pH 值至6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

LB 固體培養(yǎng)基：主要包括胰蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉15 g，調節(jié)pH 值至7.0，121 ℃滅菌20 min。

NA 固體培養(yǎng)基： 主要包括蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，調節(jié)pH 值至7.3，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 抑菌試驗指示菌株

鼠傷寒沙門菌、 假絲酵母菌均購于索萊寶生物科技有限公司， 金黃色葡萄球菌購于河南省工業(yè)微生物工程技術研發(fā)中心。

1.1.4 主要試劑

細菌基因組DNA 提取試劑盒（TaKaRa）購于寶日醫(yī)生生物科技（北京）有限公司，沙氏葡萄糖瓊脂購于索萊寶生物科技有限公司，蛋白胨、牛肉膏、 葡萄糖、NaCl 等其他化學試劑均購于成都隆豪生物科技有限公司。

1.1.5 主要儀器設備

恒溫培養(yǎng)箱，型號：BXP-450S，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產品； 全自動立式蒸汽滅菌鍋，型號：CT1158B，上海伯能儀器有限公司產品；電子天平，型號：FA110，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；pH 計，型號：PHSJ-4F，上海儀電科學儀器股份有限公司產品；超凈工作臺，型號：SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；磁力加熱攪拌器，型號：78-1，溫州標諾儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離與純化

分別稱取不同種類的新鮮牧草葉片各10 g，將葉片切碎， 裝入含有90 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中，200 r/min 條件下振搖2 h。振搖后，稀釋懸浮液，取1 mL 懸浮液，加入9 mL 無菌生理鹽水，即為稀釋10-2的懸浮液，繼續(xù)按梯度稀釋到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度。

將各梯度的懸浮液取10 μL 涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上，重復3 次。 在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48～72 h 后根據菌落特征進行分離純化2 次。經過細菌菌落形態(tài)特征觀察、 革蘭染色鏡檢以及過氧化氫酶試驗， 將革蘭染色陽性和過氧化氫酶試驗陰性的菌株初步確定為乳酸菌。 對各菌株進行編號，挑取單菌落接種于5 mL MRS 液體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h， 于40%甘油生理鹽水中保存，-80 ℃條件下保存。

1.2.2 乳酸菌PCR 鑒定將充分活化的菌株利用細菌基因組DNA 提取試劑盒（TaKaRa）提取基因組DNA。 利用Kim等［13］基于37 種乳酸菌16S～23S rDNA 區(qū)域相似性分 析 設 計 的 特 異 性 引 物：L2 -15F （5′ -GCTCAGGAYGAACGCYGG-3′）和L2-687R（5′-CACCGCTACACATGRADTTC-3′）進行PCR 擴增，使用筆者所在實驗室保存的戊糖片球菌DNA 樣品作為陽性對照，無菌ddH2O 作為陰性對照。 目的片段預計擴增長度為692 bp。 PCR 擴增體系（25 μL）如表1 所示，反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min；4 ℃保存。

表1 乳酸菌PCR 初步鑒定反應體系 單位：μL

1.2.3 16S rDNA 多樣性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建為進一步確定乳酸菌菌株種屬， 以初步鑒定得到的乳酸菌菌株基因組DNA 為模板，參考細菌16S rDNA 通 用 引 物：27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）， 對分離得到的乳酸菌菌株進行16S rDNA 擴增，PCR 擴增體系同表1，無菌ddH2O作為陰性對照。 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，40 個循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min；4 ℃保存。 目的片段預計擴增長度為1 542 bp。 凝膠電泳后，條帶符合預期大小的PCR 產物將送至生工生物工程 （成都）有限公司進行雙向測序，測序結果在DNAMAN 軟件中拼接后， 在GenBank 中的BLAST-N 程序進行序列同源性的比較。 下載與分離菌株相似度最高的參考菌株序列， 在MEGA 11.0 軟件中進行乳酸菌16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.2.4 優(yōu)良乳酸菌的篩選

1.2.4.1 產酸試驗

將各初篩菌液按5%的量加入MRS 液體培養(yǎng)基，每組設置3 個重復，37 ℃培養(yǎng)24 h。 在生長過程中每間隔2 h 無菌取樣測定菌液的pH 值，記錄結果。 以培養(yǎng)時間作為橫坐標，pH 值作為縱坐標，繪制乳酸菌產酸速率曲線圖。

1.2.4.2 抑菌試驗

參考高擎燏等［14］報道的方法，將指示菌（鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌）和乳酸菌菌株分別加入LB 液體培養(yǎng)基和MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。 指示菌液體培養(yǎng)物于4 ℃、8 000 g 條件下離心10 min，棄上清液，菌體懸浮于無菌生理鹽水中，再次離心洗滌1 次， 制成濃度為3.0×108CFU/mL的指示菌懸液。 吸取200 μL 指示菌懸液分別涂布接種于NA 固體培養(yǎng)基表面，靜置2 h。 制備待測乳酸菌懸液（4 ℃、8 000 g 條件下離心10 min），上清液經微孔濾膜過濾。 分別吸取各樣品上清液100 μL 添加至已放置于NA 固體培養(yǎng)基表面的牛津杯內，37 ℃培養(yǎng)24 h。每株乳酸菌針對每種指示菌設置3 個重復， 抑菌能力根據觀察菌落周圍的抑菌圈大小進行判定。

采用平板畫線法進行假絲酵母菌拮抗試驗。將酵母菌接種于沙氏葡萄糖培養(yǎng)基上， 待長出成熟菌落后，用打孔器將供試菌苔打成小菌塊，將其菌面向下放置于待測平板中央， 在兩側畫線接種同種乳酸菌，25 ℃培養(yǎng)7 d， 若病原菌生長形狀類似于橢圓且無法靠近兩邊畫線區(qū)域， 則說明具有抑菌作用。

1.2.5 乳酸菌生長特性測定

1.2.5.1 乳酸菌生長曲線的測定

將各初篩菌株按5%的量加入至MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。 在生長過程中每間隔2 h無菌取樣測定各組菌液的OD600nm值。 以培養(yǎng)時間作為橫坐標，OD600nm值作為縱坐標， 繪制生長曲線圖。

1.2.5.2 耐鹽性試驗

將各初篩菌株按5%的量分別加入至6 種不同NaCl 濃度的MRS 液體培養(yǎng)基中，NaCl 濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/mL，每組設置3 個重復，37 ℃培養(yǎng)24 h 后測定各樣品菌液的OD600nm值，以菌液NaCl 濃度值作為橫坐標，OD600nm值為縱坐標繪制柱狀圖。

1.2.5.3 不同pH 值生長試驗

將各初篩菌株按5%的量分別加入至4 種不同pH 值的MRS 液體培養(yǎng)基中，pH 值分別為3、3.5、4、6， 每組設置3 個重復，37 ℃培養(yǎng)24 h 后測定各菌液的OD600nm值，以菌液pH 值作為橫坐標，OD600nm值作為縱坐標繪制柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計方法與數據處理

采用Excel 和SPSS 27.0 軟件對數據進行分析。 使用SPSS 27.0 軟件單因素方差分析及LSD檢驗（P＜0.05）對該研究數據進行統(tǒng)計分析。 采用SigmaPlot 和Excel 軟件進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離純化

經MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)， 挑取30 個單菌落進行革蘭染色鏡檢。根據過氧化氫酶反應結果，在其中挑選出10 個疑似乳酸菌的單菌落（見表2）。 8 種牧草中，在牛筋草、甜高粱和白茅等5 種牧草葉片表面各分離到2 株疑似乳酸菌， 在其他3 種牧草表面未分離、篩選到乳酸菌。 經鑒定，所有菌株皆為革蘭染色陽性，過氧化氫酶試驗陰性。分離菌株的形態(tài)特征如圖1 所示。 菌落在MRS 培養(yǎng)基上呈大小不一的圓形凸起，表面濕潤光滑，顏色多為乳白色。

圖1 牧草葉片分離乳酸菌菌株在MRS 培養(yǎng)基上的生長情況及革蘭染色鏡檢結果（600×）

表2 乳酸菌分離來源及表型鑒定結果

2.2 乳酸菌分子生物學鑒定

通過PCR 反應進一步鑒定10 個疑似乳酸菌的單菌落。10 株菌株的PCR 擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2 所示。 凝膠電泳條帶大小符合預期，均在692 bp 左右，初步確定10 株菌株皆為乳酸菌。

圖2 10 株乳酸菌PCR 鑒定凝膠電泳圖

2.3 乳酸菌菌株16S rDNA 多樣性分析及系統(tǒng)進化樹的構建

PCR 擴增結果表明，10 株乳酸菌菌株16S rDNA 全長序列長度均在1 542 bp 左右（見圖3），經與標準乳酸菌菌株序列的BLAST 比較顯示其相似性均達到了99%以上。 如表3 所示，10 株乳酸菌菌株中含魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）和乳桿菌屬（Levilactobacillus）共3個菌屬，其中菌株Lab1、Lab5、和Lab8 為短乳桿菌（L.brevis）， 菌 株Lab3、Lab4 為 戊 糖 片 球 菌（P.pentosaceus）， 菌株Lab6、Lab7 為植物乳桿菌（L.plantarum）， 菌 株Lab2 為 魏 斯 氏 乳 酸 菌（W.cibaria）， 菌 株Lab 9 為 戊 糖 乳 桿 菌（Lactiplantibacillus pentosus）， 菌株Lab10 為棒狀乳桿菌（L.coryniformis）。 圖4 中列出了上述10 株菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關系。

圖3 乳酸菌16S rDNA 基因PCR 擴增結果

圖4 基于16S rDNA 序列構建的乳酸菌系統(tǒng)進化樹

表3 乳酸菌分子生物學鑒定結果 單位：%

2.4 乳酸菌生長性能評價

由圖5 可知，10 株乳酸菌均在0～2 h 時開始進入快速生長期， 此階段生長速度達到最大，2～14 h 內生長速率有稍微減少的趨勢， 但處于快速穩(wěn)定上升階段。 從14 h 開始生長緩慢，18 h 后OD600nm值增長趨勢逐漸放緩。 在發(fā)酵30 h 后，除菌株Lab4、Lab5 外， 其他菌株的OD600nm值均在1.3 左右，其中，菌株Lab10 的生長速率最快，在生長過程中OD600nm值高于其余菌株。 菌株Lab10 在MRS 液體培養(yǎng)基中生長速率最快， 細胞代謝物快速生成，促進了菌液中乳酸的生成，使整體pH 值快速降低， 進而在實際發(fā)酵進程中可能會抑制有害菌的繁殖。

圖5 乳酸菌生長曲線

2.5 乳酸菌產酸能力比較

10 株乳酸菌菌株產酸能力比較分析結果見圖6。 10 種菌株在發(fā)酵0～20 h 內的pH 值均快速下降， 發(fā)酵30 h 后菌株Lab10 產酸最快，pH 值降到4.52，產酸最慢的菌株為Lab4，發(fā)酵30 h 后pH值降到4.75。 OD600nm值越大，產酸速率越快，菌株Lab10 在發(fā)酵14 h 后pH 值降到5 以下，發(fā)酵30 h后pH 值降至4.52，且具有繼續(xù)下降的趨勢，在整個發(fā)酵過程中產酸速率基本均快于其余菌株，具有較好的青貯潛能。

圖6 乳酸菌產酸曲線

2.6 乳酸菌耐酸性能

生長環(huán)境中pH 值過低不利于乳酸菌的繁殖。由圖7 可知，總體來看，在培養(yǎng)基pH 值為6 時各菌株的OD600nm值達到最大，說明各菌株的最佳生長pH 值為6。 10 株菌株在pH 值為3 時OD600nm值均較培養(yǎng)前濃度高，具有較好的耐酸性，其中，菌株Lab7 的OD600nm值高于其余菌株， 具有較強的耐酸性。 菌株Lab5 在pH 值為3.5 時OD600nm值顯著（P＜0.05）低于其余菌株，且在其余pH 值的培養(yǎng)基中生長狀況與其他菌株相比無明顯優(yōu)勢。

圖7 乳酸菌在不同pH 值培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后的OD600 nm 值

2.7 乳酸菌耐鹽性能

由圖8 可知， 隨著培養(yǎng)基中NaCl 濃度的增高，各菌株的繁殖速率逐漸降低。所有菌株在培養(yǎng)基中NaCl 濃度為0.1 g/mL 時基本不再繁殖，菌株Lab7 在NaCl 濃 度 為0.08 g/mL 時 的OD600nm值 顯著（P＜0.05）高于其余菌株，表明該菌株具有較好的耐鹽性。

圖8 乳酸菌在不同NaCl 含量培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后的OD600 nm 值

圖8 乳酸菌在不同NaCl 含量培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后的OD600 nm 值

2.8 乳酸菌抑菌性能

由圖9 可見， 所有菌株對鼠傷寒沙門菌有不同的抑制作用， 但對金黃色葡萄球菌及假絲酵母菌均無抑制作用。 各分離株中菌株Lab1、Lab2、Lab9、Lab10 抑菌圈較寬、 抑菌活性較好， 菌株Lab3、Lab5 和Lab7 次之，菌株Lab4、Lab6 和Lab8的抑菌效果不明顯。

圖9 部分菌株對鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌和假絲酵母菌的抑菌效果

3 討論

在青貯飼料發(fā)酵過程中， 不同的原料種類及生長環(huán)境都會導致青貯中乳酸菌群落的多樣性。在不添加微生物菌劑的前提下， 青貯飼料的發(fā)酵品質主要依賴于青貯原料表面的乳酸菌數量、種類和底物含量［15-16］。 目前研究表明，在自然條件下牧草表面附著的乳酸菌數量較低，一般低于1×105CFU/g FM［17］，因此，在飼料生產中，一般需加入乳酸菌發(fā)酵劑來提高乳酸的含量， 提高青貯飼料發(fā)酵質量。有研究表明，牧草表面附著乳酸菌較市售乳酸菌接種劑發(fā)酵效率高［9］。 從牧草表面鑒定篩選出生長迅速、產酸快，具有較強抗逆性的乳酸菌種類對青貯飼料的發(fā)酵品質具有重要的意義。 該試驗從8 種不同牧草中經微生物分離和16S rDNA 多樣性分析最終分離鑒定出了短乳桿菌3 株、植物乳桿菌2 株、戊糖片球菌2 株、魏斯氏乳酸菌1 株、戊糖乳桿菌1 株、棒狀乳桿菌1 株，具有進一步開發(fā)應用的價值。

乳酸菌生長和產酸速率是篩選優(yōu)質乳酸菌的重要指標［18］。 乳酸菌的快速生長及乳酸的迅速產生可有效抑制有害菌的生長，減少牧草營養(yǎng)損耗。Woolford 等［10］總結出作為優(yōu)質青貯用乳酸菌的條件有：①生長速率快，具有抑制有害微生物生長的作用；②需為同型發(fā)酵乳酸菌，能快速產生乳酸；③具有較強的耐酸能力，pH 值為4 左右的環(huán)境下生長。 韋慶旭等［15］從玉米青貯飼料等材料中分離出的乳酸菌菌株發(fā)酵48 h 后pH 值可降至3.5 以下。 而袁潔等［19］從多年生黑麥草青貯中分離出的優(yōu)質乳酸菌更是在12 h 后達到4.0 左右。 該研究分離出的乳酸菌菌株Lab10、Lab8 在發(fā)酵30 h后pH 值分別降到4.52 和4.68，不過從pH 值曲線可以看出其仍具有下降至4.0 的趨勢， 且耐酸性實驗表明菌株能在pH 值為3.0 的條件下生長，在pH 值3.5～4.0 時生長旺盛， 基本符合較為優(yōu)質的乳酸菌的條件。

乳酸菌對導致青貯飼料腐敗的有害微生物的抑菌性能在維持青貯品質方面具有重要意義。 鄭昕等［20］研究顯示，從雞盲腸內中分離篩選出的7種乳酸菌菌株均對大腸桿菌、 鼠傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌性能；付彤［21］從玉米青貯飼料分離出的9 株乳酸菌中有3 株對大腸桿菌具有抑制作用， 其余6 株對金黃色葡萄球菌具有抑制性能。在現(xiàn)有的研究中，大多數如乳酸菌菌株的抑菌活性來自自身產生的有機酸、 抑菌素以及過氧化氫等代謝產物［22］。該研究中，菌株Lab1、Lab2、Lab3、Lab5、Lab7、Lab9 和Lab10 對鼠傷寒沙門菌有抑制作用， 至于對金黃色葡萄球菌和假絲酵母菌是否具有抑制作用，還需要進一步驗證。

4 結論

該研究對8 種牧草表面附著乳酸菌進行了本體分離與鑒定， 最終篩選出的植物乳桿菌（Lab7）具有較強的耐鹽耐酸性能，短乳桿菌（Lab1）和棒狀乳桿菌（Lab10）具有良好的生長、產酸、耐酸、耐鹽及抑菌性能， 為調制優(yōu)質青貯飼料添加劑提供科學依據， 可減少青貯飼料生產中微生物菌劑添加的盲目性。 3 種菌株均具有較好的青貯潛能，有望開發(fā)出適合當地生態(tài)環(huán)境下的優(yōu)良乳酸菌添加劑，同時建立地方性優(yōu)良青貯乳酸菌種資源庫，為青貯產業(yè)添加劑的發(fā)展提供幫助。