睪酮對新生期大鼠支持細(xì)胞和精原細(xì)胞Adamts16 表達(dá)的影響

李倩倩，王東陽，白薩日娜，劉建琦，包圖雅，郭曉珍

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

睪丸下降是一種復(fù)雜的多階段的過程， 發(fā)生于不同哺乳動(dòng)物生命中的特定時(shí)間。 睪丸下降的任何階段的中斷都可能由遺傳、激素、環(huán)境或社會(huì)因素觸發(fā)［1-2］。 在人類和哺乳動(dòng)物中，睪丸保留在腹腔內(nèi)而不是正常下降到陰囊中的現(xiàn)象并不少見，這種情況稱為隱睪癥［3］。 隱睪癥的直接后果包括精子生成障礙、 生殖細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的不育癥和生殖細(xì)胞腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的增加［4-5］。

Adamts （a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs）蛋白是一個(gè)由19 個(gè)成員組成的細(xì)胞外金屬蛋白酶家族，涉及許多分子過程，包括膠原蛋白加工、 蛋白聚糖裂解和血管生成抑制。 同時(shí)，Adamts 對細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）結(jié)構(gòu)和功能的控制發(fā)揮著組織形態(tài)發(fā)生和病理生理重塑的多種作用［6］，包括凝血、組織修復(fù)、生育能力、關(guān)節(jié)炎和癌癥。 其中，Adamts16 是Adamts 蛋白家族中的一類孤兒蛋白酶，包括前肽區(qū)域、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、 解整合素樣結(jié)構(gòu)域和1 型血小板反應(yīng)蛋白（TS）基序［7］。 許多研究結(jié)果表明Adamts16 基因與生殖功能有關(guān)［8-9］。 從小鼠模型鑒定的新候選基因Adamts16 已被證明在胚胎性腺、 睪丸和精子細(xì)胞中表達(dá)［10］。 Abdul-Majeed 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，靶向破壞Adamts16 基因雄性大鼠表現(xiàn)出雙側(cè)隱睪和不育。此外， 這項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)大鼠在精子發(fā)生之前Adamts16 基因mRNA 并不局限于生精小管內(nèi)，而是在整個(gè)睪丸實(shí)質(zhì)中都能觀察到。睪酮對睪丸下降具有重要意義， 目前國內(nèi)外針對睪酮與Adamts 家族成員之間的相互作用尚未得到很好的研究［12］。因此，該研究以大鼠支持細(xì)胞和精原細(xì)胞、野生型大鼠和Adamts16 基因敲除大鼠為試驗(yàn)對象， 初步探討不同濃度睪酮對Adamts16 基因表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

細(xì)胞從10 日齡SPF 級雄性SD 大鼠睪丸組織中提取 （由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）； 野生型 （WT） 大鼠和Adamts16 基因敲除（KO）大鼠盆腔石蠟標(biāo)本，購自美國俄亥俄州托萊多大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院；DMEM/F12 培養(yǎng)基、胰酶、膠原酶、雙抗、PBS，購自美國Gibco 公司；胎牛血清，購自浙江天杭生物科技股份有限公司；睪酮（T）、Tris-HCl 緩沖液，購自北京索萊寶科技有限公司；極速抽提總RNA 試劑盒RNA fast200，購自武漢諾唯贊生物科技股份有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Regent Kit、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMKit， 購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞的制備

1.2.1 單細(xì)胞懸液的制備

在LV2 等級的動(dòng)物房中取材，首先用200 μL 2.5%的三溴乙烷麻醉大鼠并剔出睪丸， 然后將其放入200 μL 含10%FBS 的低溫DMEM 中冰凍保存，30 min 內(nèi)帶回?zé)o菌細(xì)胞間進(jìn)行如下處理：在立體顯微鏡下剝離睪丸并去除外囊，再用冷的PBS清洗兩遍，然后置于離心機(jī)中離心1 min（5 000 r/min），倒掉上清液；將200 μL 預(yù)熱（37 ℃）的0.2 mg/mL膠原酶加入去囊的睪丸中， 吹打混勻置于振蕩爐中，34 ℃、120 r/min、振蕩25 min；振蕩結(jié)束后用手搖晃離心管使睪丸組織破碎（如有大的組織碎片，則在振蕩爐中再放置5 min）， 以5 000 r/min 離心2 min， 倒掉上清液； 剩余的組織再加入200 μL 0.25%胰蛋白酶/DNase Ⅰ（1 μg/mL DNase Ⅰ）重復(fù)消化一次，吹打混勻置于振蕩爐中，34 ℃、120 r/min振蕩25 min；加入200 μL 10%FBS 的冷DMEM 終止消化，5 000 r/min 離心2 min，倒掉上清液；最后加10%FBS 的冷DMEM 重懸、計(jì)數(shù)、鋪板。

1.2.2 支持細(xì)胞的分離和純化

Tris-HCl 低滲處理去除精原細(xì)胞： 以1×106個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板， 培養(yǎng)24 h后，加入20 mmol/L Tris-HCl 處理細(xì)胞2 min，去除生精細(xì)胞。 然后用PBS 洗去殘留的Tris-HCl 并加入新培養(yǎng)液。

1.2.3 精原細(xì)胞的分離和純化

差速貼壁法去除支持細(xì)胞： 細(xì)胞接種密度同上，進(jìn)行3 次差速貼壁（2 h、4 h、過夜），收集過夜未貼壁的精原細(xì)胞置于新的培養(yǎng)瓶， 待細(xì)胞融合至80%，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞干預(yù)試驗(yàn)

使用完全培養(yǎng)基和6 孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 箱 設(shè) 置 為37 ℃、5%CO2。 使 用 二 甲 基 亞 砜（DMSO） 將睪酮溶解后加入培養(yǎng)液中配制成濃度為10-6、10-7、10-8、10-9mol/L 的試驗(yàn)組培養(yǎng)液，對照組培養(yǎng)液僅加入DMSO，不加睪酮。 選取對數(shù)期的細(xì)胞，對照組及試驗(yàn)組分別培養(yǎng)0、6、12、24 h。

1.4 RT-qPCR 法檢測

使用RNA 試劑盒提取精原細(xì)胞、支持細(xì)胞中的RNA，配制20 μL 的反應(yīng)體系（反轉(zhuǎn)錄溶液）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并在-80 ℃條件下儲(chǔ)存。 根據(jù)Gen-Bank 上公布的大鼠Adamts16 基因和β-actin 序列 設(shè) 計(jì) 引 物。 Adamts16 F：5′-TAGCGGCCGC CACCATGGAACCCCGCGGTTGCTTT-3′，Adamts16 R：5′-CCAAGGTGAAAGTTGTCATGGTGCAG-3′；β-actin F：5′-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3′，β-actin R：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3′。配制20 μL 反應(yīng)體系（qPCR 反應(yīng)溶液）、加樣。 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s， 共40 個(gè)循環(huán)。 以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct相對定量分析方法確定目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.5 組織病理學(xué)分析

將出生后2、4、8 d 野生型大鼠和Adamts16 基因敲除型大鼠盆腔的石蠟標(biāo)本于組織切片機(jī)上連續(xù)橫切成5 μm 切片。 隨后進(jìn)行HE 染色和光鏡檢查。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析及作圖采用SPSS 27.0 及GraphPad Prism 8 軟件。 采用2-△△Ct公式計(jì)算基因的相對表達(dá)量，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示。 經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)后， 采用雙因素重復(fù)測量方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR 熔解曲線

運(yùn)用qPCR 方法檢測大鼠支持細(xì)胞和精原細(xì)胞內(nèi)Adamts16 基因mRNA 的特異性表達(dá)。 大鼠Adamts16 和β-actin 基因經(jīng)qPCR 擴(kuò)增分別在83、82 ℃時(shí)出現(xiàn)了單一峰，無雜峰的熔解曲線（見圖1），并且各擴(kuò)增產(chǎn)物的理論Tm值均與各自主峰的Tm值相近， 表明qPCR 產(chǎn)物為特異性的大鼠Adamts16 和β-actin 基因。

圖1 大鼠支持細(xì)胞和精原細(xì)胞β-actin、Adamts16 基因熔解曲線

2.2 睪酮對支持細(xì)胞Adamts16 基因mRNA 相對表達(dá)量的影響

在大鼠支持細(xì)胞中添加不同濃度 （10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）的睪酮，作用6、12、24 h。 qPCR 的結(jié)果表明，睪酮對Adamts16 基因mRNA 的表達(dá)受到時(shí)間和劑量的影響。 10-6mol/L 睪酮為誘導(dǎo)Adamts16 基因mRNA 表達(dá)的最佳劑量（見圖2）。6 h 時(shí)，10-6mol/L 睪酮誘導(dǎo)Adamts16 基因mRNA的相對表達(dá)量達(dá)到峰值，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （1.04±0.35 vs 4.39±0.25，P＜0.01）。 12 h時(shí)，10-6mol/L 睪酮誘導(dǎo)Adamts16 基因mRNA 的相對表達(dá)量有所下降， 但與對照組比較差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （0.25±0.04 vs 1.11±0.56，P＜0.05）。24 h 時(shí)，Adamts16 基因mRNA 的相對表達(dá)量與12 h相比稍升高，10-6mol/L 睪酮誘導(dǎo)組與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.01±0.12vs2.41±0.29，P＜0.01）（見圖2）。

圖2 對照組和睪酮處理組6、12、24 h 時(shí)大鼠支持細(xì)胞中Adamts16 基因mRNA 表達(dá)情況

2.3 睪酮對精原細(xì)胞Adamts16 基因mRNA 相對表達(dá)量的影響

在大鼠精原細(xì)胞中添加不同濃度 （10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）的睪酮，作用6、12、24 h。 qPCR 的結(jié)果表明，睪酮對Adamts16 基因mRNA 的表達(dá)受到時(shí)間和劑量影響。 10-7mol/L 睪酮為誘導(dǎo)Adamts16 基因mRNA 表達(dá)的最佳劑量（見圖3）。6 h 時(shí)，10-7mol/L 睪酮誘導(dǎo)Adamts16 基因mRNA的相對表達(dá)量升高與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.00±0.05 vs 0.83±0.62，P＜0.01）。 12 h 時(shí)，10-7mol/L 睪酮誘導(dǎo)Adamts16 基因mRNA 的相對表達(dá)量下降， 但與對照組比較差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.01 ±0.18 vs 0.69 ±0.03，P ＜0.01）。 24 h 時(shí)，Adamts16 基因mRNA 的相對表達(dá)量達(dá)到最高，10-7mol/L 睪酮誘導(dǎo)組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.00±0.10 vs 1.02±0.13，P＜0.01）（見圖3）。

圖3 對照組和睪酮處理組6、12、24 h 時(shí)大鼠精原細(xì)胞中Adamts16 基因mRNA 表達(dá)情況

2.4 HE 染色

出生第2 天， 野生型對照組睪丸穿過腹股溝管深環(huán)行至腹橫肌內(nèi)部（見圖4A1）、Adamts16 基因敲除組睪丸位于上腹部、腹膜后方（見圖4A2）。出生第4 天， 野生型對照組睪丸繼續(xù)在腹股溝管內(nèi)向下行走（見圖4B1）、Adamts16 基因敲除組睪丸到達(dá)下腹部但未進(jìn)入腹股溝管（但位置高，和鞘突距離較遠(yuǎn)）（見圖4B2）。 出生第8 天，野生型對照組睪丸離開腹股溝管開始準(zhǔn)備進(jìn)入陰囊 （見圖4C1）、Adamts16 基因敲除組睪丸有下降但仍位于腹部（見圖4C2）。

圖4 出生第2、4、8 天野生型大鼠和Adamts16 基因敲除大鼠睪丸位置

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)， 雄性大鼠生殖發(fā)育畸形包括肛門生殖器距離縮短、副性腺減少、陰莖畸形（尺寸減小和尿道下裂）、隱睪和生精障礙（睪丸發(fā)育不全綜合征）等［13］。 隱睪具有典型的組織學(xué)特征，其特征是生殖細(xì)胞成熟受損導(dǎo)致生殖細(xì)胞耗竭， 并伴有間質(zhì)纖維化、 支持細(xì)胞發(fā)育停滯和支持細(xì)胞數(shù)量減少［14］。 小青春期似乎是完成和穩(wěn)定正常雄性生殖器發(fā)育的一個(gè)重要階段， 包括支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞的增殖和成熟、 睪丸的生長以及睪丸下降等［15］。 睪丸下降是由生長過程和睪酮影響共同促成的。雖然金屬蛋白酶與雄性生殖有一定的關(guān)系，但其潛在機(jī)制仍不清楚［16］。 為了進(jìn)一步了解Adamts16 基因在睪丸發(fā)育中的潛在作用，初步探討睪丸支持細(xì)胞和精原細(xì)胞中Adamts16 基因的表達(dá)受睪酮調(diào)節(jié)的影響以及敲除Adamts16 基因后新生期大鼠睪丸位置的變化過程。

由于大鼠體型較大、血容量和產(chǎn)仔數(shù)較高，更適合進(jìn)行外科、生理和藥理實(shí)驗(yàn)，同時(shí)大鼠被認(rèn)為是了解睪丸功能調(diào)節(jié)的更好模型（與小鼠相比），因此， 該研究中使用了10 日齡SD 大鼠支持細(xì)胞和精原細(xì)胞［17］。 在支持細(xì)胞中， 睪酮作用6 h Adamts16 基因mRNA 的相對表達(dá)量最高、睪酮作用12 h Adamts16 基因mRNA 的相對表達(dá)量最低，隨后24 h 目的基因的表達(dá)量又輕度上調(diào) （見圖2）。在精原細(xì)胞中，睪酮作用6 h 和12 h Adamts16基因mRNA 的相對表達(dá)量增加，24 h 達(dá)到峰值（見圖3）。 該研究觀察到隨著睪酮濃度的增加支持細(xì)胞和精原細(xì)胞中Adamts16 基因mRNA 的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢。 細(xì)胞的雄激素作用調(diào)節(jié)它們的基因表達(dá)和增殖， 出現(xiàn)這種趨勢可能是支持細(xì)胞和精原細(xì)胞自身成熟的結(jié)果 （類似于哺乳動(dòng)物的兩個(gè)生長高峰）。 有研究顯示，雄性大鼠在出生后的6 h 內(nèi)性激素水平出現(xiàn)了短暫的增 高［18］。 Slob 等［19］使 用 的Wistar 大 鼠 在 出 生 后24 h 睪酮顯示高水平狀態(tài)。 睪酮不僅誘導(dǎo)大鼠雄性編程窗口（關(guān)鍵胎兒期）支持細(xì)胞的增殖，而且促進(jìn)妊娠后期和出生后支持細(xì)胞和精原細(xì)胞的發(fā)育［20］， 因此， 推測睪酮對支持細(xì)胞和精原細(xì)胞Adamts16 基因mRNA 的表達(dá)是有促進(jìn)作用的。

在哺乳動(dòng)物中，主要通過解剖學(xué)、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和掃描電子顯微鏡（SEM）等方法研究睪丸下降［21］。 該研究通過組織學(xué)的方法來觀察睪丸的位置變化。 發(fā)現(xiàn)野生對照組出生2、4、8 d 大鼠睪丸逐漸下降，Adamts16 基因敲除組睪丸位置變化不大。 野生型大鼠，出生后第2 d 和第4 d 睪丸逐漸下降（見圖4A1 和圖4B1）、第8 d 睪丸開始準(zhǔn)備進(jìn)入陰囊（見圖4C1）。 正常雄性大鼠，自出生之日起、每天測定其血漿中的睪酮濃度，連續(xù)7 d，結(jié)果顯示， 大鼠血漿中的睪酮含量在出生后第2天顯著升高，第3 天下降，第4 天至第7 天又緩慢上升［22］。此外，相關(guān)研究表明雄性大鼠可以通過睪丸重量預(yù)測睪丸組織分泌睪酮的水平［23］。 睪酮存在于新生期大鼠的血漿和睪丸組織中， 這一時(shí)期大鼠發(fā)生了行為和生理上的性別分化［24］，提示新生野生型大鼠睪丸可以正常下降。 Adamts16 基因敲除大鼠，出生后第2 d 和4 d 睪丸位置變化不大（見圖4A2 和圖4B2）、 第8 d 睪丸有所下降但仍位于腹部（見圖4C2），提示Adamts16 基因敲除會(huì)導(dǎo)致隱睪。 Gerszon 等［25］分析了Adamts16 基因在隱睪患者中的表達(dá)， 獲得的數(shù)據(jù)表明睪丸未降患者Adamts16 基因的表達(dá)量尤其是在睪丸中顯著降低。 Adamts16 基因敲除大鼠模型在睪丸下降過程中的組織解剖學(xué)研究表明，敲除Adamts16 基因可阻止引帶周圍ECM 的酶解，從而阻止引帶遷移并引起隱睪［26］。 Adamts16 基因敲除大鼠可能由于睪丸不能正常分泌睪酮、Adamts16 基因缺失等兩方面的原因引起隱睪癥。