枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對綿羊瘤胃上皮細(xì)胞β- 防御素-1 表達(dá)的影響

白綏明，辛雅明，齊 盟，胡 亮，楊銀鳳

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.清澗縣動物疫病預(yù)防控制中心，陜西 榆林 718399；3.鄂爾多斯市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000；4.巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

防御素（defensin）是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一類陽離子抗菌肽，最早從兔肺巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞胞漿顆粒中分離得到［1］， 具有多種生物學(xué)作用，是動物機(jī)體天然免疫的重要組成部分［2］。 哺乳動物防御素可以殺傷多種病原微生物及某些腫瘤細(xì)胞［3］。 β-防御素（β-defensin）由胃腸道、肝臟、皮膚和肺內(nèi)的吞噬細(xì)胞、白細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要通過發(fā)揮抗微生物活性和免疫調(diào)控作用提高機(jī)體抗病能力［4］。 在綿羊體內(nèi)有2 種β-防御素，分別在氣管和回腸中發(fā)現(xiàn)了綿羊β-防御素-1 （sheep β-defensin-1，SBD-1）和綿羊β-防御素-2（sheep β-defensin-2，SBD-2）［5］。

益生菌作為飼料添加劑能夠改善動物胃腸道功能，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)［6-7］。 大量研究表明，益生菌可以促進(jìn)動物胃腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及增強(qiáng)機(jī)體先天性免疫功能［8］。 枯草芽孢桿菌作為一種飼用添加劑，應(yīng)用范圍廣泛。 王佩等［9］研究表明枯草芽孢桿菌可以誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞（ovine ruminal epithelial cells，ORECs） 中SBD-1 的表達(dá)且效果顯著。 趙霏霏等［10］研究發(fā)現(xiàn)熱滅活的枯草芽孢桿菌同樣可以顯著誘導(dǎo)ORECs 中SBD-1的表達(dá)。 益生性大腸桿菌Nissle 1917 可以誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞Caco-2 中人β-防御素-2（human β-defensin-2，hBD-2）的表達(dá)，其有效誘導(dǎo)成分是大腸桿菌的鞭毛蛋白［11］。 釀酒酵母細(xì)胞壁成分可以誘導(dǎo)ORECs 中SBD-1 的表達(dá)［12］。也有研究表明釀酒酵母培養(yǎng)物可以誘導(dǎo)ORECs中SBD-1 的表達(dá)［13］。 上述研究表明，益生菌主要通過細(xì)胞壁成分和代謝產(chǎn)物影響機(jī)體免疫系統(tǒng)。枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液中的代謝產(chǎn)物按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為多肽蛋白類和大環(huán)內(nèi)酯類［14］，其培養(yǎng)上清液中的代謝產(chǎn)物作為發(fā)揮免疫作用的成分之一，與ORECs 中的防御素的表達(dá)關(guān)系尚未有研究報道。 因此， 筆者開展枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 中SBD-1 表達(dá)影響的研究，為從益生菌胞外代謝產(chǎn)物對上皮細(xì)胞防御素表達(dá)影響的角度揭示益生菌提高動物免疫力和發(fā)揮免疫調(diào)控作用的機(jī)制提供參考， 也為更好地將枯草芽孢桿菌開發(fā)為安全綠色的飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種及綿羊瘤胃組織

枯草芽孢桿菌CMCC 63501 購于中國微生物菌種網(wǎng)， 綿羊瘤胃組織來源于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市某屠宰場。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基、青鏈霉素，均購自Gibico公司；胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS），購自四季青公司；綿羊β-防御素-1（DEFβ1）ELISA 檢測試劑盒，購自武漢新啟迪公司；Cell Counting kit-8試劑，購自Proteintech 公司；總RNA 提取試劑盒，購自Axygen 公司。

1.1.3 主要儀器多功能酶標(biāo)儀，Biotek 公司產(chǎn)品；VIIA7 實(shí)時熒光定量PCR 儀，Applied Biosystems 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原代綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

將瘤胃組織鈍性分離肌層和漿膜層， 保留黏膜層，用含有1 mg/mL 青鏈霉素、50 μg/mL 慶大霉素、200 μg/mL 兩性霉素的PBS 溶液反復(fù)清洗瘤胃組織5～6 次，然后用0.25%Trypsin-0.02%EDTA 消化液于37 ℃恒溫箱進(jìn)行消化，共消化7 次，消化時間依次為35、25、10、5、3、3、2 min。 每次消化完成后在顯微鏡下觀察， 當(dāng)出現(xiàn)大量圓而亮的細(xì)胞時收集細(xì)胞，置于終止液（含20%胎牛血清的DMEM/F12 液體培養(yǎng)基）中終止消化，消化完成后，將收集的消化液用200 目細(xì)胞篩過濾3 次，1 500 r/min 離心5 min，收集沉淀，用完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、200 μg/mL 青鏈霉素、100 μg/mL兩性霉素、2 μg/mL 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑、β-巰基乙醇的DMEM/F12 液體培養(yǎng)基）重懸為均勻的細(xì)胞懸液， 裝入細(xì)胞瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)3 d 后觀察細(xì)胞是否貼壁，每隔3 d換液1 次，當(dāng)細(xì)胞長滿細(xì)胞瓶80%～90%進(jìn)行傳代用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液的制備

將枯草芽孢桿菌接種于液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)72 h 后，5 000 r/min 離心10 min，分別收集菌體沉淀與培養(yǎng)上清原液。菌體沉淀用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，其菌液濃度為6×1013CFU/mL，再按照倍比稀釋法用DMEM/F12 液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL。枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清原液用0.22 μm 的濾器過濾除菌后， 按照同樣的稀釋方法將其稀釋為菌液濃度為1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL 所對應(yīng)的上清液，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 Cell Counting kit-8（CCK-8）方法檢測枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 的毒性作用

將ORECs 傳于96 孔板， 放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)設(shè)置對照組、空白組、試驗(yàn)組，每組設(shè)置6 個重復(fù)， 向培養(yǎng)板每孔中加入10 μL 不同濃度（1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL） 的枯草芽孢桿菌對應(yīng)的培養(yǎng)上清液孵育24 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm 處的吸光度后計(jì)算細(xì)胞存活率。 細(xì)胞存活率 （%）=［（試驗(yàn)組OD450nm-空白組OD450nm）/（對照組OD450nm-空白組OD450nm）］×100。用篩選出的對細(xì)胞無毒性的最大濃度刺激不同時間（0、2、4、8、12、24、36 h），篩選對細(xì)胞無毒性的最大作用時間。

1.2.4 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 的刺激試驗(yàn)

1.2.4.1試驗(yàn)分組及處理

將6 孔板中的ORECs 用DPBS 清洗2 次，每孔加入DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓處理24 h，之后在每孔中加入對ORECs 無明顯毒性的不同濃度（1011、1010、109、108、107CFU/mL）的 枯 草 芽 孢 桿菌對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 8 h（通過預(yù)試驗(yàn)確定）， 同時用相同稀釋方法稀釋的LB 培養(yǎng)基做對照，DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照，每組設(shè)置3 個重復(fù)，使用熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法篩選最佳刺激濃度。使用篩選出的最佳刺激濃度分別刺激ORECs 0、2、4、8、12、24 h，每組設(shè)置3 個重復(fù)，使用qPCR 技術(shù)和ELISA 方法篩選最佳刺激時間。

1.2.4.2 ORECs 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

ORECs 總RNA 的提取參照總RNA 提取試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀檢測提取的總RNA在260 nm 和280 nm 波長下的吸光度，分析其濃度和純度。然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Yeasen）說明書將RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 qPCR 技術(shù)檢測SBD-1基因的mRNA相對表達(dá)量

內(nèi)參基因β-actin 和目的基因SBD-1 的特異性引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，引物信息見表1。 qPCR 試驗(yàn)條件按試劑盒說明書進(jìn)行操作，參照金鑫等［15］報道的qPCR試驗(yàn)方法檢測目的基因SBD-1 的mRNA 相對表達(dá)量。 每個樣品均進(jìn)行3 次重復(fù)反應(yīng)。

表1 qPCR 試驗(yàn)內(nèi)參基因及SBD-1 基因引物信息

1.2.4.4 ELISA方法檢測SBD-1 蛋白表達(dá)量

按照試劑盒說明書進(jìn)行ELISA 試驗(yàn)， 使用Excel 2019 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到二次多項(xiàng)式擬合方程， 根據(jù)該方程和各樣品的OD450nm計(jì)算SBD-1 蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraPhPad Prism 7 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 表示有顯著差異，P＜0.01 表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORECs 原代培養(yǎng)結(jié)果

ORECs 培養(yǎng)結(jié)果如圖1 所示， 剛裝瓶的細(xì)胞大小均一、折光度高，亮而圓的細(xì)胞為上皮細(xì)胞，而折光度低、大小及形態(tài)不規(guī)則的是角質(zhì)細(xì)胞（見圖1A）。 培養(yǎng)4 d 的細(xì)胞貼壁呈島嶼狀分布（見圖1B）。 培養(yǎng)6 d 的細(xì)胞生長狀況良好，細(xì)胞連接成片狀生長（見圖1C）。培養(yǎng)8 d 的細(xì)胞胞質(zhì)均一，基本長滿整個瓶底 （見圖1D）， 此時可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 ORECs 原代培養(yǎng)（100×）

2.2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 的毒性作用結(jié)果

用CCK-8 方法檢測枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 的毒性作用。由圖2A 可知，用枯草芽孢桿菌濃度為1012CFU/mL 對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 24 h 時， 與對照組相比，ORECs 發(fā)生了明顯（P＜0.01）的死亡。 因此，選用枯草芽孢桿菌濃度為107、108、109、1010、1011CFU/mL 對應(yīng)的培養(yǎng)上清液為最佳刺激濃度的篩選范圍。 由圖2B 可知，用對細(xì)胞無毒性作用的最大的枯草芽孢桿菌濃度（1011CFU/mL）對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 36 h時，與對照組相比ORECs 發(fā)生了明顯（P＜0.01）的死亡， 故選用0、2、4、8、12、24 h 作為最佳刺激時間的篩選范圍。

圖2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 存活率的影響

2.3 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 中SBD-1 表達(dá)影響的結(jié)果

2.3.1 最佳刺激濃度的篩選結(jié)果

用不同濃度 （1011、1010、109、108、107CFU/mL）的枯草芽孢桿菌對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 8 h，從基因和蛋白水平分析最佳的刺激濃度。 由圖3A 可知，枯草芽孢桿菌的濃度分別為109、1010、1011CFU/mL 時對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs后，SBD-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量均顯著 （P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于對照組；枯草芽孢桿菌的濃度為1011CFU/mL 對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 時，SBD-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量達(dá)到了最高值，與對照組相比呈極顯著（P＜0.01）差異，且與用相同稀釋方法稀釋的LB 培養(yǎng)基相比，呈極顯著（P＜0.01）差異。 ELISA 分析結(jié)果顯示（見圖3B）， 枯草芽孢桿菌的濃度分別為108、109、1010、1011CFU/mL 時對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs后，SBD-1 蛋白表達(dá)量均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于對照組；枯草芽孢桿菌的濃度為1011CFU/mL 時對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 后，SBD-1 蛋白的表達(dá)量達(dá)到了最高值， 與對照組相比呈極顯著（P＜0.01）差異。 上述結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的濃度為1011CFU/mL 時對應(yīng)的培養(yǎng)上清液為刺激ORECs 中SBD-1 表達(dá)的最佳濃度。

圖3 不同濃度枯草芽孢桿菌對應(yīng)的培養(yǎng)上清液對ORECs 中SBD-1 表達(dá)的影響

2.3.2 最佳刺激時間的篩選結(jié)果

用篩選出的最佳刺激濃度的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液刺激ORECs 0、2、4、8、12、24 h，從基因和蛋白水平分析最佳的刺激時間。 由圖4A 可知，刺激24 h 時SBD-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量達(dá)到了最高值，與空白對照組相比呈極顯著（P＜0.01）差異。 ELISA 分析結(jié)果表明（見圖4B），用最佳刺激濃度刺激24 h 時，SBD-1 蛋白表達(dá)量達(dá)到了最高值，與空白對照組相比呈極顯著（P＜0.01）差異。以上結(jié)果提示，ORECs 中SBD-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量與SBD-1 蛋白表達(dá)量均在刺激24 h 時達(dá)到最高值，結(jié)果表明24 h 為最佳刺激時間。

圖4 最佳刺激濃度的培養(yǎng)上清液刺激不同時間對ORECs 中SBD-1 表達(dá)的影響

3 討論

近年來， 隨著家畜舍飼和半舍飼飼養(yǎng)模式的逐漸推廣， 隨之而來的是養(yǎng)殖成本的提高以及感染各種傳染病的風(fēng)險性升高［16］。 我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019 年發(fā)布公告，自2020 年1 月起，我國飼料中全面禁止添加抗生素， 以此減少濫用抗生素造成的危害［17］。 抗生素作為飼料添加劑過度使用不僅引起耐藥菌的出現(xiàn)和傳播，而且對人、動物和環(huán)境造成危害［18］。 防御素是內(nèi)源性抗菌肽中的一個大家族，它與傳統(tǒng)抗生素的抗菌機(jī)理不同，即防御素主要作用于病原微生物的細(xì)胞膜， 病原微生物不易對其產(chǎn)生抗性［19］。 β-防御素對動物機(jī)體的先天性免疫有著極其重要的作用， 因此防御素可以作為一種天然、綠色替抗產(chǎn)品，但是由于其自身表達(dá)量很低， 再加上體外生產(chǎn)過程難以實(shí)現(xiàn)及成本過高， 因此造成了防御素難以應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐當(dāng)中。 有研究表明給動物飼用益生菌可以誘導(dǎo)其防御素的表達(dá)， 因此在飼料中添加益生菌及其有效成分誘導(dǎo)體內(nèi)的防御素表達(dá)可能會成為一種新型的方式來替代抗生素的作用。

枯草芽孢桿菌作為益生菌的一種， 添加到飼料中飼喂動物可以增強(qiáng)動物機(jī)體胃腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)， 增加養(yǎng)分消化率和飼料轉(zhuǎn)化率來改善其生長性能， 還可提高機(jī)體的免疫力從而提高動物的健康狀況［20］。 本實(shí)驗(yàn)室前期的研究已經(jīng)證明枯草芽孢桿菌、 滅活菌以及枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁［21］均可以誘導(dǎo)ORECs SBD-1 的增加，但是對其有效成分尚不清楚， 本試驗(yàn)在前期的研究基礎(chǔ)上探討枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液中的代謝產(chǎn)物作為益生菌發(fā)揮免疫作用的有效成分之一， 是否可以誘導(dǎo)ORECs SBD-1 的表達(dá)。 本試驗(yàn)選取王佩等［9］的研究中使用的枯草芽孢桿菌的濃度作為依據(jù)， 選取了107、108、109、1010、1011、1012CFU/mL 6 個 濃 度 作為研究對象，CCK-8 試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)枯草芽孢桿菌的濃度為1012CFU/mL 對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激36 h 時，ORECs 發(fā)生了明顯的死亡，在篩選最佳濃度和最佳時間時應(yīng)當(dāng)在表現(xiàn)無明顯毒性作用的濃度和時間范圍內(nèi)進(jìn)行， 排除高濃度枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對細(xì)胞產(chǎn)生毒性從而導(dǎo)致細(xì)胞防御性的產(chǎn)生SBD-1 的可能性。 在最佳濃度的篩選過程中，為了使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時，按照倍比稀釋法用無抗生素的DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 調(diào) 整 菌 液 濃 度 為1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL，按照同樣的稀釋方法將其稀釋為菌液濃度為1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL 所對應(yīng)的培養(yǎng)上清液，同時設(shè)置相同稀釋方法稀釋過的LB培養(yǎng)基作陰性對照，以排除LB 培養(yǎng)基的作用。 結(jié)果顯示， 低濃度的枯草芽孢桿菌對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs SBD-1 的表達(dá)效果不明顯，但隨著枯草芽孢桿菌的濃度升高， 其培養(yǎng)上清液的刺激作用也隨著增強(qiáng)，且與各個濃度相對應(yīng)的LB 培養(yǎng)基刺激組相比，培養(yǎng)上清液的作用均高于LB 培養(yǎng)基的作用， 說明枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液中的代謝產(chǎn)物是誘導(dǎo)ORECs SBD-1 表達(dá)的有效刺激成分。當(dāng)枯草芽孢桿菌的濃度為1011CFU/mL 對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 24 h 時，SBD-1 的mRNA和蛋白表達(dá)量達(dá)到了最高， 但是隨著枯草芽孢桿菌的濃度進(jìn)一步升高和刺激時間的延長， 其對應(yīng)的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 時，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的死亡， 說明太高的劑量或刺激時間反而會出現(xiàn)抑制作用，由此推測在一定的濃度和時間內(nèi)，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)ORECs SBD-1 的表達(dá)可能是機(jī)體實(shí)現(xiàn)自身穩(wěn)態(tài)的一種調(diào)節(jié)過程。 本試驗(yàn)證明了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液是誘導(dǎo)ORECs內(nèi)SBD-1 表達(dá)的有效刺激成分，但是對其具體作用機(jī)制和代謝產(chǎn)物中具體發(fā)揮作用的成分還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液可以誘導(dǎo)ORECs SBD-1 表達(dá)。