淅川烏骨雞出殼前后胸肌的全轉錄組表達譜分析

石建州，于金冉，王彥偉，王鐵軍，李 娜，劉陽坤，姚倫廣

（1.南陽師范學院，河南 南陽 473061；2.神農(nóng)種業(yè)實驗室，河南 鄭州 450046；3.鄭州大學，河南 鄭州 450001；4.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南 南陽 473000；5.河南省動物疫病防控工程技術研究中心，河南 南陽 473000）

淅川烏骨雞（原稱藥雞）是我國珍貴的地方雞種， 中心產(chǎn)地是河南省南陽市淅川縣老城鎮(zhèn)以及盛灣鎮(zhèn)石板溝村等區(qū)域，在2006 年全國畜禽遺傳資源調查時被發(fā)現(xiàn)。 2010 年，淅川烏骨雞被《國家畜禽遺傳資源名錄》收錄；2011 年，淅川烏骨雞作為優(yōu)質的家禽遺傳資源被列入 《中國畜禽遺傳資源志·家禽志》。淅川烏骨雞體型較小而緊湊，頭部大小適中，主體白羽，腿肌、胸肌發(fā)達，蛋殼綠色，具有適應性廣、抗病力強、覓食能力強、喜群居、耐寒性強、耐粗飼、飼料消耗低等特征，不僅具有肉質鮮美的肉用價值，以及蛋品質高的蛋用價值，更具有天然保健的藥用功效等優(yōu)點［1-2］， 是稀有的“肉、蛋、藥”兼用型地方品種。 淅川烏骨雞遺傳性能穩(wěn)定，最顯著的特征是雞體含有大量的黑色素，具有典型的“五烏”特征（烏喙、烏腿、烏皮、烏骨、烏肉），烏色呈顯性遺傳，是烏骨雞的重要種質遺傳資源；產(chǎn)綠殼蛋也是淅川烏骨雞的重要特征之一，綠殼蛋比率能夠達到罕見的73%，并且該雞是目前唯一生產(chǎn)綠殼蛋的白羽烏骨雞品種［3］。 烏骨雞作為健康食品，使得“肉、蛋、藥”三位一體兼用型淅川烏骨雞的市場需求愈來愈高，備受關注的淅川烏骨雞具有深遠的育種價值和經(jīng)濟開發(fā)潛力［4］。

全轉錄組是指在一定時空狀態(tài)下有機體特定細胞或組織能夠轉錄出的所有轉錄本， 其中蘊含著重要的生物學調控規(guī)律。 全轉錄組研究能夠對基因結構和功能進行更深層次地分析與探究，揭示基因表達與生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系。 轉錄本是生物體特定細胞或者組織在某一特定條件下的所有轉錄產(chǎn)物， 包括編碼RNA （messenger RNA，mRNA）和非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）［5］。全轉錄組測序能夠對細胞mRNA 及ncRNA 進行整體測序分析。 微RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA），這三類ncRNA 在細胞轉錄合成過程中具有靶向調節(jié)作用，其調控對象與mRNA 有關。 基于RNA 序列長度的差異，一般將全轉錄組分為small RNA 文庫（miRNA）與去rRNA 鏈特異性文庫（mRNA、lncRNA、circRNA）［6］。

淅川烏骨雞出殼的雛雞與未出殼的雞胚相比，基因表達是否存在時間差異？差異表達基因包括哪些？ 這些差異表達基因在淅川烏骨雞個體發(fā)育中發(fā)揮著哪些作用？ 這些科學問題的解決對于揭示淅川烏骨雞胸肌的黑色素沉積、脂肪代謝、發(fā)育性變化等相關機制具有重要意義。

該研究選擇出殼前后的淅川烏骨雞雞胚和雛雞為研究對象， 利用轉錄組測序技術檢測不同生長發(fā)育階段胸肌組織中基因的表達水平， 鑒定組織中的mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA 的差異表達基因， 并分析篩選相關性狀的候選基因以及差異表達基因的生物學功能， 進一步探索差異表達基因在淅川烏骨雞在生長發(fā)育過程中的調控作用， 以期為優(yōu)良的地方雞種淅川烏骨雞的遺傳育種改良以及機理解析提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

淅川烏骨雞種蛋由河南興盛源牧業(yè)有限公司提供。對照組隨機選取3 只入孵14 d、發(fā)育健康的蛋胚（記為X-14 d），取胸肌組織；試驗組隨機選取3 只1 日齡的雛雞（記為X-1 d），采集胸肌組織。將用于測序的胸肌組織放入液氮中速凍，于-80 ℃條件下保存。

1.2 儀器及試劑

微量分光光度計（賽默飛世爾科技Nanodrop 2000）、PCR 儀 （東勝興業(yè)科學儀器 有限 公司ETC811）、Agilent 2100 生物分析儀和High Sensitivity DNA assay Kit 5067-4626 文庫質檢試劑盒（Agilent Technologies）、 離 心 機 （Eppendorf 5427R）、試劑盒#7530NEB 和小RNA 建庫試劑盒#E7300（New England Biolabs）。

1.3 轉錄組測序

提取胸肌的總RNA，對RNA 質量進行檢測，純化mRNA，將mRNA 片段化并反轉錄為cDNA，構建轉錄組文庫，用Illumina Hiseq 2000（Illumina，San Diego，CA，USA）平臺上機測序（由廣州基迪奧生物科技有限公司完成）。

1.4 生物信息學分析

對差異表達的mRNA 進行GO（Gene Ontology）和KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。GO 是標準化的基因功能分類體系，全面描述基因與產(chǎn)物的屬性。 GO 描述基因的分子功能（molecular function）、細胞組分（cellular component）、 參與的生物過程 （biological process）， 進行基因的GO 功能分類注釋及顯著性富集 分 析。 將 基 因 向GO 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.geneontology.org/）各詞條映射，計算詞條的基因數(shù)，得到具有某個GO 功能的基因列表和數(shù)目， 進行超幾何檢驗和基因組背景比對， 得到顯著富集的GO 條目。

不同基因協(xié)調行使生物學功能，Pathway 分析有助于進一步探究基因的生物學功能。 KEGG 是Pathway 的數(shù)據(jù)庫， 顯著性富集分析以KEGG Pathway 為單位，超幾何檢驗，與基因組背景比對，得到顯著性富集的Pathway。 通過Pathway 顯著性富集可以確認基因參與的最主要的生化代謝途徑與信號轉導途徑［7-8］。

2 結果與分析

2.1 差異表達分析

對mRNA、lncRNA、circRNA 和miRNA 依據(jù)表達量進行顯著差異表達分析， 基于錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05 且｜log2FC｜＞1 的閾值條件， 篩選差異表達mRNA、lncRNA、circRNA；基于P＜0.05 且｜log2FC｜＞1 的閾值條件， 篩選差異表達miRNA。 圖1 為各比較組顯著差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs） 整體統(tǒng)計結果。 測序結果顯示， 出孵1 d 的雛雞與入孵14 d的雞胚相比（X-14 d vs X-1 d），胸肌生長發(fā)育過程中大量的基因轉錄組水平發(fā)生顯著變化，上調的基因包括1 054 個mRNA、222 個lncRNA、148 個circRNA、159 個miRNA； 下調的基因包括2 804 個mRNA、149 個lncRNA、168 個circRNA、218 個miRNA。

圖1 淅川烏骨雞出殼前后胸肌mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA 顯著差異表達基因結果統(tǒng)計（X-14 d vs X-1 d）

2.2 mRNA 差異表達基因的GO 富集分析

通過測序方法分析剛出殼1 d 的淅川烏骨雞雛雞胸肌與入孵14 d 的雞胚胸肌（X-1 d vs X-14 d）的mRNA 差異表達基因（X-14 d vs X-1 d）。 針對具有表達差異的mRNA 進行GO 富集分析，結果顯示（見圖2），差異表達基因主要集中在“生物學過程”，其次是“細胞組分”，最后是“分子功能”。首先，在“生物學過程”方面，細胞過程、單組織過程、多組織過程、代謝過程、生物調節(jié)、生物過程調控、刺激反應、定位、多細胞有機體過程、細胞組成、組織或生物發(fā)生、信號、正負調節(jié)生物過程、生長過程、免疫系統(tǒng)過程、生物黏附、運動、行為、繁殖、生殖過程、生長、規(guī)律性發(fā)生過程、解毒、細胞死亡、參與突觸傳遞的突觸前過程、生命階段、細胞集合等多個條目被顯著富集。

圖2 mRNA 差異表達基因的GO 富集分類

其次，在“細胞組分”方面，細胞、細胞部分、細胞器、膜、膜部分、細胞器部分、大分子復合物、膜包圍的腔、胞外域、胞外部分、細胞結、突觸、突觸部分、超分子纖維、細胞外基質、類核、細胞外基質成分、其他生物等條目被顯著富集。

最后，在“分子功能”方面，分子功能、綁定、催化活性、運輸活性、分子功能調節(jié)劑、分子換能器活性、信號換能器活性、結構分子活性、核酸結合轉錄因子活性、電子載體活性、轉錄因子活性、蛋白結合、抗氧化活性、翻譯調節(jié)因子活性、化學引誘活性、化學排斥活性、金屬伴侶蛋白活性、形態(tài)發(fā)生活性等條目被顯著富集。

2.3 mRNA 差異表達基因的KEGG 通路富集分析

KEGG 通路富集分析結果顯示（見圖3）：心肌收縮，黏附連接，肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)，氨基酸的生物合成，氧化磷酸化，碳代謝，檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)），緊密連接，間隙連接，心肌細胞中的腎上腺素信號，2-氧羧酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，代謝途徑，焦點黏附，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，糖酵解/糖異生，癌癥中的microRNA，丙酮酸代謝，Notch 信號通路， 以及黑素原生成等多個信號通路被顯著富集。

圖3 mRNA 差異表達基因的KEGG 富集氣泡圖

3 討論

淅川烏骨雞的黑色素沉淀、免疫性能、肌肉發(fā)育、肉質性狀等直接影響其生產(chǎn)性能和經(jīng)濟價值。運用轉錄組學、代謝組學、蛋白組學等組學技術能夠從分子的角度進行相關性狀調控機制的闡述。同時，采用組學的方法，能夠快速篩選鑒定與目的性狀相關的候選基因和分子功能， 了解其性狀形成機制，在生產(chǎn)上，將鑒定出的關鍵遺傳標記進行應用，實現(xiàn)優(yōu)質種質資源的精準遺傳選育，也是有效實現(xiàn)品種選育以及縮短育種實踐工作周期的有效方法。 全轉錄組是在特定時空狀態(tài)下生物體可以轉錄出的所有轉錄本， 包含生物學調控信息。mRNA 作為蛋白質合成的直接模板， 雖然只占細胞總RNA 的2%～5%， 但因其轉錄后修飾繁多而在疾病的研究中意義重大［9］。 miRNA 是一類長度約為19～25 nt 的內(nèi)源性ncRNA，廣泛參與基因轉錄后調控活動，具有高度序列保守性、表達時序性和組織特異性。 lncRNA 是長度大于200 nt 的ncRNA，lncRNA 直接參與調控基因的表達， 也能夠作為競爭性內(nèi)源RNA （competing endogenous RNA，ceRNA）與miRNA 相互調控，影響靶基因轉錄本的表達，具有無蛋白編碼功能、低表達、物種間保守性低等特性，參與生物過程如組蛋白修飾、基因表達調控、細胞增殖分化等［10］。 circRNA 由編碼蛋白的外顯子生成， 并通過下游剪接供體反向共價連接上游剪接體環(huán)化形成［11］。 不同差異circRNA 來源基因相互協(xié)調行使其生物學功能。全轉錄組學以差異基因的功能富集、 候選基因的功能預測等生物信息學分析為主。 該文旨在通過分析淅川烏骨雞出殼前后胸肌的全轉錄組表達譜，從分子層面揭示基因和非編碼RNA 在淅川烏骨雞兩個生長階段的胸肌表達特點。

淅川烏骨雞是我國新發(fā)現(xiàn)的“肉、蛋、藥”兼用型珍禽， 是目前唯一報道過的產(chǎn)綠殼蛋的白羽烏骨雞。 為了更好地了解和保護淅川烏骨雞品種資源［12］，利用組學技術挖掘經(jīng)濟性狀的相關基因是必要的。 該研究首次構建了淅川烏骨雞入孵14 d的雞胚和出殼1 d 的雛雞的胸肌的全轉錄組表達譜， 篩選獲得3 858 個顯著差異表達mRNA，371個顯著差異表達lncRNAs，316 個顯著差異表達circRNAs 和377 個顯著差異表達miRNAs。 通過GO 功能富集和KEGG 通路分析差異表達基因的生物學功能，挖掘與胸肌發(fā)育相關的基因，獲得了差異表達基因的功能分類和信號通路， 以揭示淅川烏骨雞生長發(fā)育的遺傳機制。

淅川烏骨雞出殼前后， 顯著差異表達基因主要富集在催化活性、運輸活性、分子功能調節(jié)劑、信號換能器活性、結構分子活性、核酸結合轉錄因子活性、轉錄因子活性、蛋白結合、抗氧化活性、翻譯調節(jié)因子活性、金屬伴侶蛋白活性、形態(tài)發(fā)生活性等GO 條目，參與細胞過程、單/多組織過程、代謝過程、生物調節(jié)、生物過程調控、刺激反應、定位、多細胞有機體過程、細胞組成、信號、正/負調節(jié)生物過程、生長過程、免疫系統(tǒng)過程、生物黏附、規(guī)律性發(fā)生過程、解毒、細胞死亡、參與突觸傳遞的突觸前過程等多個生物學過程。 KEGG 通路富集分析表明， 差異表達mRNA 顯著富集在黏附連接、 肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、 氨基酸的生物合成、氧化磷酸化、碳代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）、緊密連接、 間隙連接、 心肌細胞中的腎上腺素信號、2-氧羧酸代謝、代謝途徑、焦點黏附、糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝、黑素原生成、Notch 信號通路等多條信號通路。 基于測序結果挖掘影響淅川烏骨雞胸肌生長發(fā)育、脂肪沉積、黑色素沉積、免疫系統(tǒng)等相關性狀的關鍵基因以及基因的功能。 肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、糖酵解/糖異生等與肉質性狀相關［13］。 Notch 信號通路由相鄰細胞的Notch受體與配體互作而被激活［14］，參與多種不同細胞功能的調節(jié)，例如細胞凋亡、分化、增殖和遷移等［15］。烏色作為烏骨雞品種的顯著特征，有著十分重要的研究意義。 黑素原生成通路參與黑色素生成過程［16］，與淅川烏骨雞的肌肉烏色相關。烏骨雞與非烏骨雞的顯著不同之處在于是否含有黑色素，烏骨雞體內(nèi)富含黑色素，黑色素是機體活性功能的物質基礎，黑色素決定了烏骨雞的藥用價值［17］。隨著分子技術和細胞生物學的迅速發(fā)展， 逐漸對黑色素生成的分子機制有了認識， 在黑色素細胞的遷移分化、 黑色素的產(chǎn)生分布等過程中受眾多基因的協(xié)同調控，涉及多個信號通路。 目前，黑色素的生成受到多種信號通路的調控， 研究發(fā)現(xiàn)Edn/EdnrB、WNT/β-catenin、αMSH/MC1R、SCF/Kit、腺苷酸環(huán)化酶/cAMP 和酪氨酸激酶信號通路參與黑色素的生成調控， 在黑色素生成過程中起直接或間接的作用［18-20］。 該研究為了挖掘與淅川烏骨雞黑色素生成有關的基因， 通過轉錄組測序數(shù)據(jù)分析挖掘調控淅川烏骨雞烏色性狀相關的候選基因， 采用GO 和KEGG 富集方法分析了調控黑色素生成的相關基因， 大量差異基因富集于多種信號通路，因此，具體何種信號通路主要調控黑色素性狀仍需深入研究， 為進一步研究黑色素調控機制提供理論依據(jù)。 差異表達基因主要參與免疫系統(tǒng)、解毒、代謝過程等生物學過程，富集于Notch信號通路［21］、丙酮酸代謝、代謝途徑等信號通路，推測這些差異基因可能與機體的免疫與代謝相關信號傳導密切相關。

該試驗結果可為解析淅川烏骨雞胸肌生長發(fā)育的調控機制提供基礎數(shù)據(jù)， 為進一步鑒定調控目的性狀的關鍵基因和信號通路奠定了試驗基礎， 也為淅川烏骨雞的靶向選育和遺傳改良提供參考。

4 結論

mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA 作為淅川烏骨雞基因轉錄組的重要組成部分， 在淅川烏骨雞的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。 該研究結果為解析淅川烏骨雞胸肌生長發(fā)育過程的基因調控機制提供了參考。