肺結(jié)核分枝桿菌感染與趨化因子MCP-1、MIF和炎癥因子IL-6、IL-1α、IL-1β水平的關(guān)系分析

周 明,秦柯君,郭利敏

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453000)

肺結(jié)核屬于肺部慢性傳染病。目前我國肺結(jié)核患病率仍居高不下,嚴(yán)重影響人類健康。而探索更為有效地預(yù)防、診斷結(jié)核病新技術(shù)和新方法是當(dāng)前研究熱點。結(jié)核分枝桿菌為肺結(jié)核感染菌,該菌入侵機體后先侵害宿主肺泡巨噬細(xì)胞,導(dǎo)致趨化及細(xì)胞因子受影響,發(fā)生炎性反應(yīng),降低機體免疫[1]。當(dāng)機體發(fā)生炎癥時,巨噬細(xì)胞通過分泌趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)和促炎性因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-1α(interleukin-α,IL-1α)、白介素1β(interleukin-1beta, IL-1β)等炎性介質(zhì),直接或間接參與炎癥反應(yīng)綜合征[2]。上述因子在機體炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用,能影響結(jié)核分枝感染的保護免疫反應(yīng)。為此,本研究分析肺結(jié)核分枝桿菌感染與趨化因子、炎癥因子的關(guān)系。旨在為臨床提供有效地預(yù)防、診斷結(jié)核病新技術(shù)和新方法的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年1月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院就診的浸潤性肺結(jié)核患者78例為結(jié)核組和60例正常健康人群為對照組,其中結(jié)核組男55例,女23例,年齡24～77歲,平均(38.65±14.85)歲,吸煙11例;對照組男41例,女19例,年齡23～76歲,平均(37.47±13.74)歲,吸煙10例;兩組受試者性別、年齡一般資料比較無顯著差異(P>0.05),有可比性。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①浸肺結(jié)核經(jīng)結(jié)核菌素實驗 、影像學(xué)、痰抗酸桿菌染色檢查確診; ②心、肝、腎功能基本正常; ③無合并糖尿病、矽肺、乙肝、腎病、艾滋病等疾病;④無吸毒、酗酒等不良嗜好;⑤全身狀況良好。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①妊娠者、酗酒者;②近期服用激素或免疫調(diào)節(jié)劑者。

1.2 方法

收集所有受試者血清,采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血液中趨化因子MCP-1、MIF和細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-1α。Elisa檢測方法,首先嚴(yán)格按照試劑盒(購于武漢賽培生物科技有限公司)說明書備試劑、標(biāo)準(zhǔn)品;將不同濃度質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本加入對應(yīng)經(jīng)處理后的微孔板內(nèi),100μL/孔。將反應(yīng)空用封板膠紙封住,室溫孵育2h;除去孔板中液體,清洗孔板,于每孔中加入300μL洗滌液,重復(fù)4次,洗板清洗完全后倒置板,直至孔板無任何殘留液;加人200μL/孔酶標(biāo)測抗體,反應(yīng)孔用封板膠封住,室溫孵育2h;重復(fù)洗板操作;加入200μL/孔顯色底物,室溫避光孵育30min;加入50μL/孔終止液后30min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取A540-A570值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品,縱坐標(biāo)為A540-A570,根據(jù)樣本A值,計算濃度。

采用 q-PCR法檢測患者血清中MCP-1、 MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)水平。根據(jù)Trizol試劑盒(購于武漢科昊佳生物科技有限公司)說明提取血清總RNA,于血清中加入1mL Trizol,均勻混合后置入1.5mL EP管中,充分振蕩后,室溫放置5min完全裂解細(xì)胞。于EP管中加200μL氯仿,震蕩15s。25℃條件下靜置3min,12000rpm離心15min,得3層離心液,取上層清液400μL于1.5mL EP管內(nèi)(經(jīng)焦碳酸二乙酯處理后)。加 400μL異丙醇,混勻,室溫放置2h后離心,棄上清,再加焦碳酸二乙酯處理后 75%乙醇,離心,棄上清,管內(nèi)液風(fēng)干,加20μL 焦碳酸二乙酯水,多次處理后完全溶解,得總RNA液。

配置1.5%瓊脂糖凝膠,放入電泳槽內(nèi),加電泳緩沖液超過凝膠?；靹騌NA樣品和緩沖液加膠板樣品槽內(nèi)后,開展電泳,待溴酚藍(lán)至膠板邊沿約1cm處時,停止電泳。紫外燈下觀察,凝膠系統(tǒng)成像后拍照保存。紫外分光光度計檢測總RNA質(zhì)量,取1μL RNA樣品至紫外分光光度計測樣臺上測量開始,并記錄 OD260/OD280值及濃度。將質(zhì)量良好RNA 樣品保存于-80℃冰箱中。采用10μL體系,室溫下5min,基因組DNA去除反應(yīng);逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) cDNA的合成,用20μL體系,于恒溫金屬加熱器中37℃ 15min反應(yīng)結(jié)束,取1μL/標(biāo)本cDNA用于PCR,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 反應(yīng),根據(jù)試劑盒操作,根據(jù)引物合成報告單各引物的理論Tm值,在梯度PCR儀上設(shè)退火溫度梯度,范圍54～60℃,循環(huán)參數(shù)30。產(chǎn)物電泳,反應(yīng)結(jié)束后,取8μL PCR反應(yīng)終產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝90V電泳40min后,于BIO-RAD成像儀上成像保存。 RT-qPCR檢測血清的MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA的相對表達(dá)。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔,以2-CT法行數(shù)據(jù)分析。按照基因序列設(shè)計引物,見表1。

表1 基因PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β水平比較

結(jié)核組MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β水平均高于對照組(P<0.05),見表2。

表2 兩組受試者血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β水平比較

2.2 兩組受試者血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA含量比較

結(jié)核組MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA含量均高于對照組(P<0.05),見圖1。

圖1 兩組MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA表達(dá)

2.3 血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β與肺結(jié)核分枝桿菌感染的關(guān)系

血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β與肺結(jié)核分枝桿菌感染均呈正相關(guān)(P<0.05),見表3。

表3 MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β與肺結(jié)核分枝桿菌感染的關(guān)系

2.4 血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β診斷肺結(jié)核感染的敏感度與特異度

聯(lián)合血清因子診斷敏感度、特異度高于單獨MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β(P<0.05),見表4、圖2。

圖2 診斷肺結(jié)核感染的ROC曲線

表4 血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β診斷肺結(jié)核感染的敏感度與特異度

3 討論

MIF為促炎細(xì)胞因子,參與機體局部或全身系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。MIF可抑制體外巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的繁殖,提示MIF參與結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展[3]。但MIF面對復(fù)雜的機體免疫系統(tǒng)環(huán)境時,其對抗結(jié)核分枝桿菌的作用及水平表達(dá)程度的具體機制,需進一步確認(rèn)。本研究結(jié)核患者血清MIF水平高于對照組,提示MIF水平參與肺結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病。MCP-1是趨化因子CC亞家族的典型代表,參與結(jié)核的發(fā)病機制。有研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)核宿主免疫中,MCP-1參與誘導(dǎo)結(jié)核感染,具有趨化作用[4,5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),肺結(jié)核分枝桿菌感染者機體內(nèi)MCP-1水平明顯高于健康正常者[6],與本文研究結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn),肺結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病與細(xì)胞因子有關(guān)[7,8]。細(xì)胞因子如IL-6、IL-1α、IL-1β等在機體維持細(xì)胞免疫有重要意義。IL-6、IL-1α、IL-1β均為促炎性細(xì)胞因子。IL-6可誘導(dǎo)B細(xì)胞分化與形成抗體,還誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖活化、分化,并參與機體免疫,促進炎癥反應(yīng)發(fā)生。有研究表明,肺結(jié)核分枝桿菌感染患者機體內(nèi)存在促炎癥因子,參與疾病發(fā)生[9]。本文肺結(jié)核分枝桿菌感染患者血清中IL-6水平高于對照組,證實IL-6參與該病癥發(fā)病。IL-1α、IL-1β均屬于IL-1家族,二者通過共同IL-1受體傳遞信號通路[10]。IL-1作為復(fù)雜多功能細(xì)胞因子,廣泛參與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié),調(diào)控機體各類細(xì)胞發(fā)揮作用。臨床資料表明,IL-1α可誘導(dǎo)多類型細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用,誘導(dǎo)單核浸潤炎癥局部,并在局部釋放溶酶體酶,產(chǎn)生多炎癥因子[11]。大量研究表明,IL-1β參與細(xì)胞凋亡相關(guān)炎癥因子[12,13]。有研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核感染患者機體內(nèi)血清IL-1β水平均高于健康人群[14]。另有研究發(fā)現(xiàn),較正常人群,肺結(jié)核感染患者機體血清IL-1α水平明顯較高[15]。這與本研究結(jié)果一致,提示IL-1α、IL-1β參與肺結(jié)核分枝桿菌感染,這可能與肺結(jié)核分枝桿菌感染機體中巨噬/單核細(xì)胞分泌大量IL-1α、IL-1β,且成熟后的IL-1α、IL-1β能增強凋亡相關(guān)蛋白的活性有關(guān)。

分析患者外周血MCP-1、MIF和IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),趨化因子與炎癥因子 mRNA表達(dá)水平趨勢一致,肺結(jié)核分枝桿菌感染患者上述因子mRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組。血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β 水平表達(dá)與肺結(jié)核分枝桿菌感染均呈正相關(guān)。由此可見,肺結(jié)核分枝桿菌感染患者存在炎癥反應(yīng),且MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β表達(dá)水平與患者疾病相關(guān);提示MCP-1、MIF和IL-6、IL-1α、IL-1β 因子在肺結(jié)核分枝桿菌感染疾病中發(fā)揮重要作用。本研究顯示,上述因子有一定診斷敏感度,且聯(lián)合因子診斷敏感度均高于單獨因子;再次表明MCP-1、MIF和IL-6、IL-1α、IL-1β 因子在肺結(jié)核分枝桿菌感染疾病中的重要性。

綜上所述,MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β參與肺結(jié)核分枝桿菌感染,且上述因子水平與該病呈正相關(guān),聯(lián)合因子診斷可提高敏感度。