多發(fā)性骨髓瘤患者PHF19基因表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系

董慧娟,程楊燕,鄭 林,李春艷,顏靜秀

(上饒市人民醫(yī)院血液科,江西 上饒 334000)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是骨髓漿細(xì)胞的惡性腫瘤,發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位。隨著蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)藥物、單抗以及造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用,MM患者的預(yù)后得到了很大的改善,仍有部分患者終將走向難治復(fù)發(fā)[1]。腫瘤患者中大多存在表觀遺傳學(xué)異常,而且表觀遺傳學(xué)修飾與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),多發(fā)性骨髓瘤也不例外。多梳蛋白家族是一類重要的表觀遺傳調(diào)控因子,PHD鋅指蛋白19(PHF19)作為多梳蛋白家族的成員之一,發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用,既往研究發(fā)現(xiàn)PHF19在多種實(shí)體瘤細(xì)胞中過度表達(dá),可能參與著腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[2]。關(guān)于PHF19在多發(fā)性骨髓瘤研究的報(bào)道并不多,有研究[3]發(fā)現(xiàn)PHF19過度表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖及耐藥產(chǎn)生相關(guān),但關(guān)于PHF19基因表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤臨床特征及療效預(yù)后關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究旨在通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)初治、難治復(fù)發(fā)患者PHF19表達(dá)水平,結(jié)合患者的臨床資料,分析PHF19與患者預(yù)后、疾病進(jìn)程的關(guān)系,擬為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2018年2月至2021年12月上饒市人民醫(yī)院確診為初診MM患者69例(男39例,女30例,年齡27～86歲,IgAκ7例、IgGκ24例、IgAλ12例、IgGλ16例、IgDλ1例、輕鏈型9例),隨訪過程中20例患者出現(xiàn)難治復(fù)發(fā),同時(shí)收取15例正常人骨髓標(biāo)本(營養(yǎng)性貧血等)作為對(duì)照。初診患者誘導(dǎo)及鞏固化療方案采用蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑為主的方案。中位隨訪22個(gè)月,患者出現(xiàn)死亡或進(jìn)行造血干細(xì)胞移植,則隨訪中止。

1.2 RNA提取及cDNA合成

骨髓標(biāo)本EDTA抗凝,Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞,Trizol溶解提取的單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇清洗,提取細(xì)胞總RNA。cDNA合成使用TAKARA公司PrimeScriptTMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行,合成過程37℃ 15min,85℃ 5sec反應(yīng)后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成

本研究中所用的PHF19及內(nèi)參GAPDH引物均由金維智生物科技公司設(shè)計(jì)合成,引物序列:PHF19上游引物5’-CTACCTCGGGAAGATCAAGAG-3’,下游引物5’-CTAGGCAGATGTTGCACTTGG-3’;GAPDH上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.4 熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按照TAKARA公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行,ABI PRISM 7500 Fast Real-Tmie PCR System上95℃預(yù)變性30sec,95℃ 5sec,60℃ 34sec,40個(gè)循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后軟件自動(dòng)得出mRNA的拷貝數(shù)。最終計(jì)算結(jié)果采用2-△CT值(△CT=△CT PHF19-△CT GAPDH)作為基因的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 多發(fā)性骨髓瘤患者PHF19基因表達(dá)情況比較

69例初診患者PHF19基因中位表達(dá)水平為0.0206(0.0002～0.9424),15例正常對(duì)照組PHF19基因表中位水平為0.0008(0.0001～0.3214),初診患者PHF19基因表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(Z=-3.767,P=0.000)。同時(shí)分析20例進(jìn)展為難治復(fù)發(fā)患者PHF19基因表達(dá)情況,見表1,中位表達(dá)水平為0.0798(0.0013～0.9616),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示復(fù)發(fā)難治狀態(tài)患者PHF19基因表達(dá)水平較初治組顯著升高(Z=-2.290,P=0.022)。

表1 正常對(duì)照、初診及難治復(fù)發(fā)MM患者PHF19基因表達(dá)情況比較

2.2 初治患者兩組臨床特征差異比較

對(duì)不同免疫球蛋白亞型初診患者進(jìn)行PHF19基因表達(dá)分析,結(jié)果顯示,不同免疫球蛋白亞型患者PHF19基因表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=3.991,P<0.05);PHF19基因低表達(dá)組初診患者中位年齡為66歲,高表達(dá)組為68歲,兩組統(tǒng)計(jì)無差異(Z=-0.384,P<0.05);39例男性及30例女性患者PHF19基因表達(dá)中位水平分別為0.1121(0.0000～0.7241)、0.3514(0.0001～0.9424),PHF基因表達(dá)情況在男女分布中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-1.005,P<0.05)。

2.3 初診患者兩組疾病負(fù)荷、預(yù)后分期比較

根據(jù)患者初診時(shí)臨床實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)對(duì)患者進(jìn)行疾病負(fù)荷及預(yù)后評(píng)估,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,69例患者貧血程度、LDH水平以及β2微球水平在不同PHF基因表達(dá)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表2,且腎功能損傷、是否合并高鈣血癥以及骨質(zhì)破壞情況PHF基因表達(dá)也未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表2 初診患者兩組血紅蛋白、LDH、β2微球水平比較

對(duì)不同DS、ISS分期組患者PHF19基因表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示5例DS II期患者PHF19基因中位表達(dá)水平為0.0444(0.0004～0.9424),64例患者DS分期為III期中位表達(dá)水平為0.0229(0.0000～0.7241),兩組對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);69例患者ISS分期3例I期、26例II期、40例III期,三組患者PHF19基因表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.791,P>0.05)。

2.4 初診患者PHF基因表達(dá)水平與療效的關(guān)系

69例初診患者經(jīng)誘導(dǎo)方案治療后60例患者達(dá)到VGPR及以上療效,中位隨訪22個(gè)月。PHF19基因高表達(dá)組的OS率為76.5%,而低表達(dá)組的OS率為94.3%,低表達(dá)組優(yōu)于高表達(dá)組(χ2=4.468,P=0.035);高表達(dá)組患者PFS率為52.9%,低表達(dá)組PFS率為74.3%,高表達(dá)組初診患者的PFS率顯著低于低表達(dá)組(χ2=4.244,P<0.05)。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是起源于漿細(xì)胞的惡性腫瘤,盡管診治手段不斷改善,目前仍不可治愈,部分患者難治且易復(fù)發(fā)。深入探討多發(fā)性骨髓瘤發(fā)展及耐藥機(jī)制,為其治療提供新靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究[4]。表觀遺傳學(xué)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其機(jī)制主要是通過DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重構(gòu)等方式進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展,多發(fā)性骨髓瘤也不例外[5]。

多梳蛋白家族是一類重要的表觀遺傳調(diào)控因子,多見的有PRC1和PRC2,它能從染色質(zhì)水平上通過表觀遺傳修飾作用調(diào)控靶基因,在細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用。PHD鋅指蛋白19(PHF19)是PRC2的成員之一,位于人類染色體9q33.2,發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用[6]。既往研究發(fā)現(xiàn),PHF19在多種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá),且與腫瘤的侵襲性有密切關(guān)系,可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[7, 8]。目前國內(nèi)外關(guān)于PHF19在多發(fā)性骨髓瘤中表達(dá)情況的研究不多,2020年Mike J Mason等[9]人組織了一項(xiàng)名為“Multiple Myeloma DREAM Challenge”的眾包測(cè)試,結(jié)果顯示PHF19是多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后不良的分子標(biāo)志,聯(lián)合患者的MMSET基因表達(dá)、年齡以及ISS分期情況,有望進(jìn)一步完善多發(fā)性骨髓瘤的危險(xiǎn)分層系統(tǒng)。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),PHF19過表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖及耐藥相關(guān),但相關(guān)機(jī)制并不明確[10]。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)69例初診、20例難治復(fù)發(fā)MM患者以及15例正常人骨髓PHF19基因表達(dá)情況,結(jié)果顯示MM患者PHF19基因表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組,且在患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展后PHF19基因表達(dá)水平顯著提高,提示PHF19在MM發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。對(duì)初治患者發(fā)病時(shí)臨床特征及疾病負(fù)荷進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)初診患者PHF19基因表達(dá)水平與患者年齡、性別、免疫球蛋白亞型無相關(guān);對(duì)患者疾病符合和預(yù)后分層分析顯示,不同DS、ISS及R-ISS分期患者PHF19基因表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究結(jié)果還顯示PHF19基因低表達(dá)組患者OS率及PFS率明顯優(yōu)于高表達(dá)組,提示PHF19基因表達(dá)和多發(fā)性骨髓瘤患者療效和預(yù)后存在一定的相關(guān)性,PHF19高表達(dá)患者預(yù)后不良。

本研究結(jié)果提示PHF19基因表達(dá)水平和MM患者療效和預(yù)后存在一定的關(guān)系,PHF19基因高表達(dá)提示預(yù)后較差。今后仍需擴(kuò)大樣本量以及延長隨訪時(shí)間,以期進(jìn)一步了解PHF19基因在多發(fā)性骨髓發(fā)展及耐藥中的作用,為其治療提供新的靶點(diǎn)。