骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)跨區(qū)皮瓣術(shù)后血管新生的研究

薛 蘭,毛春迎,田荊華,張爭(zhēng)輝,李 巖

(菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校,山東 菏澤 274000)

在臨床上,患者遭受外部創(chuàng)傷、腫瘤切除術(shù),以及自身先天性畸形,均會(huì)引起血管組織損傷,或損傷面積擴(kuò)大[1]。針對(duì)上述問(wèn)題,醫(yī)生會(huì)采取跨區(qū)皮瓣的方式進(jìn)行血管組織修復(fù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[2],用穿支為蒂進(jìn)行跨區(qū)取皮瓣,會(huì)導(dǎo)致動(dòng)力供區(qū)和潛力供區(qū)間的皮瓣壞死[3],而且蒂部的供血下降,致使血管體間吻合點(diǎn)向遠(yuǎn)端進(jìn)行供血[4]。簡(jiǎn)單地說(shuō)蒂部供血越遠(yuǎn),皮瓣的供血量越少。所以,遠(yuǎn)端組織的供血需求無(wú)法滿(mǎn)足時(shí),皮瓣的纖維化、萎縮問(wèn)題越嚴(yán)重[5],直至皮瓣壞死。在較大組織缺損修復(fù)時(shí),要盡量提高皮瓣新生率,并通過(guò)延遲法進(jìn)行皮瓣組織修復(fù)。雖然延遲方法能促進(jìn)皮瓣新生,但是該手術(shù)的成本較高[6],術(shù)后疼痛感強(qiáng)烈,無(wú)法在臨床上廣泛應(yīng)用。因此,尋找一種有效藥物,達(dá)到choke血管擴(kuò)張、皮瓣新生的治療目的[7],是基礎(chǔ)臨床醫(yī)學(xué)研究的主要方向。有文獻(xiàn)研究顯示,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)能擴(kuò)張下肢側(cè)副血管,促進(jìn)血液流動(dòng),并在臨床上作為輔助治療手段。但是,也有部分學(xué)者認(rèn)為BMMSCs的治療效果不理想,并存在質(zhì)疑?；诖?本文以BMMSCs為研究對(duì)象進(jìn)行血管皮瓣新生研究,驗(yàn)證其實(shí)驗(yàn)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

選取已清潔的40只SD大鼠,體質(zhì)量為300～350g(北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,產(chǎn)地北京),DMEM/F12(Hyclone公司,產(chǎn)地美國(guó));胰蛋白酶(Sigma公司,產(chǎn)地美國(guó));倒置顯微鏡分別為DMEM、IX-70(Olympus公司,產(chǎn)地美國(guó))、CD29、CD90、CD34和CD45抗體均購(gòu)置于Biolegen公司(美國(guó))、青霉素、鏈霉素(Gibco公司,產(chǎn)地美國(guó));流式細(xì)胞儀(Coulter公司,產(chǎn)地美國(guó))。

1.2 研究方法

1.2.1 全骨髓貼壁培養(yǎng)法

先取得SD大鼠兩側(cè)的脛骨和股骨(4對(duì)),為全髓差異貼壁培養(yǎng)法做準(zhǔn)備;在超凈臺(tái)上,剪去脛骨和股骨骨端,用DMF=EM/F12對(duì)髓腔反復(fù)沖洗4次;利用濾網(wǎng)(200目)過(guò)濾,得到細(xì)胞懸液[8],用1000r/min離心機(jī)離心5min,撇去上清液。將青鏈霉素(濃度:1%)+FBS/DMEM(10%)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按3×105個(gè)/L細(xì)胞密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,放置于37℃,濕度飽和度100%,CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行撫育。待48h后進(jìn)行首次換液,2～3d再進(jìn)行換液。定期觀察培養(yǎng)液中細(xì)胞分裂、增殖以及形態(tài)特征。如果細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部,而且面積大于90%以后,按1:2傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至P3代后,用胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化,收獲細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞表面標(biāo)記物流式細(xì)胞儀檢測(cè)

通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記物流式細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),選取第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過(guò)EDTA(濃度:0.1%)聯(lián)合胰酶(濃度:0.25%)消化并收集P3代的BMMSCs[9],用PBS進(jìn)行漂洗和重懸,經(jīng)過(guò)濾網(wǎng)(規(guī)格:200目)進(jìn)行處理。細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別裝于7個(gè)EP管中,每管規(guī)格為100、約為106細(xì)胞,分別為CD29、CD90、CD34、CD45、及其對(duì)照管。其中,CD90、CD45的對(duì)照組為同型。在20℃陰涼條件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)稀釋,稀釋比例為CD29為1:16,CD45和CD90為1:8,CD34不能稀釋。取標(biāo)記抗體20混合到各管內(nèi),并在20℃、避光下培養(yǎng)40min。經(jīng)PBS洗滌兩遍后,用光電倍增管PMT2,檢測(cè)PE的熒光度。

1.2.3 跨區(qū)皮瓣壞死模型的構(gòu)建

在SD大鼠背部取得3支血管,胸背動(dòng)脈穿支、肋間后動(dòng)脈穿支,以及髂腰動(dòng)脈穿支為蒂、囊括肋下動(dòng)脈穿支皮瓣。皮瓣切除后,將SD大鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組。對(duì)照組中皮瓣被取出后無(wú)任何干預(yù),觀察組皮瓣被取出后1h,經(jīng)尾部靜脈按照1mL/100g的使用劑量為SD大鼠注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液(濃度:1×106個(gè)/mL)。1周后,提取肋間髂腰動(dòng)脈、肋間動(dòng)脈的choke區(qū)組織,進(jìn)行石蠟包埋,并進(jìn)行切片。最后,利用間接法染色法對(duì)Von Willebrand因子的免疫組染色。在200倍視野下,對(duì)隨機(jī)取的3張切片進(jìn)行10個(gè)視野觀察,計(jì)算微血管管徑,比較兩組SD大鼠choke區(qū)血管的直徑。處死大鼠后,用作圖軟件測(cè)量皮瓣壞死面積,壞死率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,對(duì)choke區(qū)內(nèi)的血管直徑進(jìn)行分析。其中,計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,組間行t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料表示為n(%),組間χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

結(jié)果顯示:原代細(xì)胞經(jīng)1d培養(yǎng)后,出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞,并懸浮于培養(yǎng)基表面,部分沉淀于貼壁。經(jīng)2d后,提取未貼壁細(xì)胞。相對(duì)來(lái)說(shuō),貼壁細(xì)胞體積小,而且形態(tài)多樣,并呈現(xiàn)圓形、橢圓形。經(jīng)4～6d后,細(xì)胞分裂增殖速度更快,而且呈瘦小的長(zhǎng)梭形,體積大于2d細(xì)胞,并鋪滿(mǎn)管底部,呈現(xiàn)漩渦狀。其中,出現(xiàn)放射狀、密集排列的細(xì)胞群。所以,傳代培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)1～2d后出現(xiàn)貼壁;P2代BMMSCs細(xì)胞出現(xiàn)纖維樣,多分布于底部; 50%以上的P3代呈長(zhǎng)梭形,類(lèi)似膜狀,均勻鋪展在底部,漩渦樣分布多于P2代。

2.2 流式檢測(cè)

用流式細(xì)胞儀對(duì)P3代進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)表面標(biāo)志物CD90、CD29、CD34和CD45的陽(yáng)性細(xì)胞率分別為93.5%、98.2%、0.82%和2.22%,如圖1中A和B所示。

注:A為CD90,B為CD29,CD34和CD45略

2.3 皮瓣壞死率與choke血管直徑

術(shù)后7d觀察組的壞死率低于對(duì)照組,而choke血管直徑大于對(duì)照組,存在顯著差異(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠皮瓣壞死率與chocke血管直徑(n=20)

3 討論

3.1 背部跨區(qū)模型

臨床研究顯示,背部表皮中每支動(dòng)脈均有明確的供血范圍,并與周?chē)噜弰?dòng)脈形成豐富吻合,即choke血管。當(dāng)某側(cè)血管被阻斷,其管內(nèi)血壓會(huì)下降,血流會(huì)跨越原來(lái)的吻合部位向其供血。在跨越動(dòng)力學(xué)供區(qū)的基礎(chǔ)上,如再繼續(xù)向遠(yuǎn)端供區(qū)延伸,此區(qū)域皮瓣為跨區(qū)皮瓣,是臨床上進(jìn)行組織修復(fù)的對(duì)象。切取跨區(qū)皮瓣后,choke區(qū)皮瓣會(huì)出現(xiàn)不同程度的壞死。SD大鼠背部由6個(gè)血管進(jìn)行供應(yīng),可以切取含有3個(gè)血管體區(qū)、2個(gè)choke區(qū)跨區(qū)皮瓣,能構(gòu)建研究遠(yuǎn)端30%的壞死模型,對(duì)皮瓣取缺血、缺氧,以及血管新生進(jìn)行分析。

3.2 BMMSCs對(duì)背部跨區(qū)皮瓣壞死的作用

研究發(fā)現(xiàn), BMMSCs植入肢體后,旁分泌產(chǎn)生多種促血管擴(kuò)張細(xì)胞因子,諸如,單核細(xì)胞趨化蛋白-1等。臨床研究發(fā)現(xiàn),可以利用全骨髓差異貼壁法,從SD大鼠中分離和培養(yǎng)BMMSCs,并鑒定其特異性表型,以驗(yàn)證方法的可靠性。通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)鑒定BMMSCs,發(fā)現(xiàn)表面標(biāo)記物特征與相關(guān)文獻(xiàn)研究類(lèi)似,能改善跨區(qū)皮瓣的新生率,血管本體比鄰區(qū)choke血管的直徑增加。BMMSCs進(jìn)入皮瓣后,單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集中于血管壁, MMP-2蛋白酶會(huì)消化血管基膜纖維,致使彈力纖維裂解,促進(jìn)平滑肌層的細(xì)胞新生,使得choke血管發(fā)生擴(kuò)張。因此,MMP-2蛋白酶促進(jìn)局部組織血管的再生,其作用與細(xì)胞因子類(lèi)似,優(yōu)勢(shì)明顯。

3.3 皮瓣血流力學(xué)變化

choke管徑細(xì)小會(huì)阻礙跨區(qū)皮瓣中血液流向遠(yuǎn)端,所以要適當(dāng)進(jìn)行藥物干預(yù),以擴(kuò)張choke血管直徑,改善遠(yuǎn)端供血。本研究中,觀察組的choke血管內(nèi)徑顯著大于對(duì)照組,對(duì)皮瓣遠(yuǎn)端供血的改善十分明顯,能促進(jìn)遠(yuǎn)端血管的再生。

總之,通過(guò)在SD大鼠背部的穿支,包括胸背動(dòng)脈穿支、肋間后動(dòng)脈穿支等,能構(gòu)建有效的皮瓣壞死模型。而在該模型中,注射BMMSCs,能改善choke血管擴(kuò)張,促進(jìn)皮瓣存活。