五味苦參腸溶膠囊對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠模型TLR4/MYD88通路表達(dá)的影響研究

甘旭穎,姜 威,韓宇鵬,陳 剛,陳 曦,張瑞洲

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是表現(xiàn)為一種局限于大腸黏膜的特發(fā)性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病[1,2]。以黏膜潰瘍?yōu)樘卣?常見臨床表現(xiàn)為血性排便和腹痛[1]。在過去20年中,UC的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加,尤其是在中國[3]。發(fā)病受環(huán)境、基因、免疫反應(yīng)等多因素影響[4],可見UC 發(fā)病為多重因素相互作用同時(shí)致病的結(jié)果,因此病情復(fù)雜、復(fù)發(fā)率高、臨床治療難度大[5,6]。本研究所用五味苦參腸溶膠囊(five-flavor sophora flavescens enteric-coated capsules,FSEC)為仝戰(zhàn)旗老師及其團(tuán)隊(duì)研制的一種治療UC的國家新藥,療效并不差于氨基水楊酸制劑[7]。故本實(shí)驗(yàn)探討五味苦參腸溶膠囊治療UC的療效及作用機(jī)制,為其實(shí)際臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只健康成年雄性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量30～32g,由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉(DSS)(美國MP公司),Hotstart HiTaq 兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑 、TRIzol(生工生物上海),PCR儀(美國應(yīng)用生物),熒光定量PCR管(賽默飛),Gel-Green染料(碧云天),DNAmaker(莊盟),6*loading Buffer(takara),光學(xué)顯微鏡 (日本奧林巴斯)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及造模

C57BL/6小鼠30只,隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組,各組10只。模型組、治療組小鼠自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉溶液7d造模,對(duì)照組正常喂養(yǎng)7d。造模成功后治療組的10只小鼠,用3.84g/(kg·d)中等濃度的五味苦參腸溶膠囊溶液灌腸7d;模型組的10只小鼠分別進(jìn)行等容量的0.9%氯化鈉灌腸7d后;對(duì)照組正常喂養(yǎng)7d。

1.4 小鼠一般狀況觀察

逐日監(jiān)測小鼠的臨床癥狀及體征,觀察小鼠的表現(xiàn),進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)估[8]。

1.5 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(rt-PCR)檢測結(jié)腸組織的表達(dá)

取各組小鼠結(jié)腸組織50mg,1000μL TRIzol提取全細(xì)胞總RNA,在無菌的 RNase-free 的離心管中配制下列反轉(zhuǎn)錄體系I。

TLR4上游:5TGAATCCCTGCATAGAGGTA3,下游: 5GACCGTTCTGTCATGGAAGG3

MyD88 上游:5TACAAAGCAATGAAGAAGGA3,下游:5TTGCATGAGGTAGTGGCACG3

總RNA 2μg

引物 1μL

dNTP Mix(10 mM) 1μL

RNase free ddH2O 6μL

65℃保溫5min后迅速在冰上冷擊2min,離心30s使模板 RNA/引物的變性溶液聚集于離心管底部。

在新無菌的RNase-free的離心管中配制下列反轉(zhuǎn)錄體系II。

Super M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL

5X HS HiTaq One-Step RT-PCR buffer 4μL

Solution I 2μL

RNase Inhibitor(40 U/μL) 1μL

RNase free dH2O 2μL

將體系II加入到反應(yīng)后的體系I中,進(jìn)行第一鏈合成。輕彈離心管,在37℃保溫60min, 80℃保溫 10min后冰上冷卻,得到的cDNA在-20℃保存。

PCR擴(kuò)增配制以下體系

Hotstart HiTaq DNA Polymerase 1.2μL

5X HS HiTaq Buffer(Mg2+Plus) 10μL

dNTP Mix(10mM) 1μL

Solution I 5μL

cDNA 15μL

ddH2O 17.8μL

反應(yīng)條件:95℃,10 min。采用2-ΔΔCT表示的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件進(jìn)行正態(tài)分布,單因素方差分析,以及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠臨床癥狀及體征

對(duì)照組:小鼠飲食及活動(dòng)正常,體質(zhì)量逐漸增加,無排稀便、無便血、大便隱血試驗(yàn)均陰性,皮毛潔白光滑亮澤,無毛發(fā)稀疏或雜亂現(xiàn)象;模型組:造模第5天,小鼠多動(dòng)好動(dòng),全身可見打斗痕跡,造模第7天,小鼠飲食及活動(dòng)減少,出現(xiàn)排帶血稀便,大便隱血試驗(yàn)出現(xiàn)陽性,體質(zhì)量下降,毛發(fā)光澤度下降低,略顯雜亂,精神不佳。第14天,小鼠飲食及活動(dòng)明顯減少,體質(zhì)量下降明顯,肛周可見明顯糞便沾黏,糞質(zhì)稀水樣,全身各部位均有沾染,肉眼可見血便,大便隱血試驗(yàn)均陽性,聚團(tuán)休息;治療組:小鼠給予3.84g/(kg·d)中等濃度的五味苦參腸溶膠囊溶液灌腸治療后,小鼠上述癥狀均減輕,活動(dòng)及飲食逐漸恢復(fù),排便逐漸成型,血便逐漸減少至消失。

2.2 各組小鼠組織中TLR4、MYD88mRNA的相對(duì)表達(dá)量

模型組TLR4、MYD88mRNA的相對(duì)表達(dá)量水平均高于對(duì)照組(P<0.05),且治療組TLR4、MYD88mRNA的相對(duì)表達(dá)量水平低于模型組(P<0.05),見表1,圖1。

圖1 各組小鼠組織中TLR4、MYD88mRNA的相對(duì)表達(dá)量

表1 各組小鼠組織中TLR4、MYD88mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性終身疾病,其特征是復(fù)發(fā)緩解過程[9]。目前,沒有專門許可的藥物用于治療UC。臨床治療主要包括氨基水楊酸鹽、免疫調(diào)節(jié)劑、皮質(zhì)類固醇、抗TNF-α藥物、手術(shù)和飲食治療。然而,由于臨床療效和潛在毒性的限制,這些藥物取得的療效有限[10]。因此,進(jìn)一步尋找更有效、毒性更小的藥物對(duì)治療UC具有重要意義。Toll樣受體(TLR)是一種跨膜蛋白,用于天然免疫防御[11]。TLR激活先天免疫應(yīng)答,引起細(xì)胞因子釋放,上調(diào)共刺激分子的表達(dá),并通過識(shí)別醫(yī)源微生物的脂多糖、脂蛋白和遺傳物質(zhì)核酸,為獲得性免疫應(yīng)答提供必要的激活信號(hào)[12]。TLR4是TLRs系列中的一個(gè)關(guān)鍵元素。MyD88位于染色體3p22上,My D88 碳端 TIR區(qū)域與TLR4的TIR區(qū)域相結(jié)合,而My D88的氮端是無意區(qū)域,與 NF-κB 的無意區(qū)域相結(jié)合,使得腸道黏膜免疫反應(yīng)進(jìn)而引起UC[13],最近一項(xiàng)研究證實(shí),位于MyD88 3'-UTR的rs7744次要等位基因變異與UC易感性顯著相關(guān),尤其是在日本男性受試者中。這種多態(tài)性也可能與UC治療反應(yīng)有關(guān)[14]。TLR4的激活啟動(dòng)MyD88的激活,MyD88是TLR信號(hào)傳導(dǎo)所必需的重要銜接分子。二者相互作用觸發(fā)該通路下游NF-κB信號(hào)通路的和促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的合成,包括促進(jìn)IBD發(fā)展的IL-6、IL-1β和TNF-α[15]。此外,NF-κB在破壞上皮屏障功能以及黏膜免疫系統(tǒng)和腸道微生物群之間的相互作用中也起著至關(guān)重要的作用[16]。TLR4/MyD88異常激活導(dǎo)致腸道炎癥持續(xù)惡化,并成為UC患者藥物治療的目標(biāo)[17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與模型組相比FSEC可使治療組TLR4、MYD88水平下降,可證FSEC對(duì)UC的治療作用可能與下調(diào)TLR4、MYD88的mRNA表達(dá)水平有關(guān),FSEC治療UC有一定的治療作用。