遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)通過(guò)水通道蛋白-4對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠的血腦屏障保護(hù)機(jī)制

楊 軍,安貴良,劉子琨,李浩然, 宋廣福

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,黑龍江 佳木斯 154003)

缺血性腦卒中患者接受靜脈溶栓和或動(dòng)脈取栓,恢復(fù)腦組織血液灌注后,腦組織常常伴有一系列并發(fā)癥,包括出血性轉(zhuǎn)化、血腦屏障的破壞和水腫加重,進(jìn)一步加重腦損傷,這一現(xiàn)象被稱為腦缺血再灌注損傷。血腦屏障破壞,會(huì)引發(fā)細(xì)胞毒性、血管源性水腫甚至危及生命的出血轉(zhuǎn)化[1]。因此減輕腦水腫是改善缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能缺損和促進(jìn)病情恢復(fù)的關(guān)鍵。水通道蛋白在腦部水的運(yùn)輸中發(fā)揮著雙向作用,并參與腦水腫的形成和消除[2]。其中AQP4是近些年來(lái)備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)。遠(yuǎn)隔缺血適應(yīng)(remote ischemic conditioning,RIC)是指通過(guò)對(duì)遠(yuǎn)隔器官實(shí)施短暫、重復(fù)、非致死性的缺血再灌注刺激誘導(dǎo)心,腦等重要器官的缺血耐受,從而保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞[3],減輕腦缺血-再灌注損傷[4]。它是一種無(wú)創(chuàng)性物理治療技術(shù),安全性較高,因此,在多種類型的缺血性腦血管病中被廣泛研究和應(yīng)用[5, 6]。本研究主要探討遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)通過(guò)調(diào)節(jié)AQP4的表達(dá)來(lái)改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后血腦屏障的破壞,進(jìn)而產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要試劑及儀器:AQP4多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),羊抗鼠IgG抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(大連美侖生物技術(shù)有限公司)。高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司),VE-186垂直電泳儀、Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(上海天能科技公司),全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TEK公司),全自動(dòng)切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

75只SPF級(jí)SD雄性大鼠,12周齡,體質(zhì)量280～320g,購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物學(xué)部(SYXK(黑)2021-018),合格證編號(hào)為230729221100028356。飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度在 22 ～25 ℃。所有操作均符合佳木斯大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理要求。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

將 SPF 級(jí) SD 雄性大鼠75只,依據(jù)隨機(jī)原則,均分為3組:假手術(shù)組25只、缺血再灌注組(I/R)25只和遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)組(RIPC)25只。其中I/R組及RIPC組各有1只大鼠在取腦后觀察到蛛網(wǎng)膜下腔出血被排除在外。

1.3.2 大鼠缺血再灌注(MCAO/R) 模型建立

采用Longa等[7]線栓法制備小鼠缺血再灌注模型,造模前12h 禁食水,飲水自由。1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉,分離小鼠右側(cè)頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈,頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈近分叉部分別穿一根手術(shù)線并結(jié)扎,向頸總動(dòng)脈減一小口并向小鼠頸內(nèi)方向插入線栓塞19～20mm遇阻停止,結(jié)扎頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的手術(shù)線從而牢牢固定線栓。阻斷90min后取出線栓,進(jìn)行再灌注,恢復(fù)血供。遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)組:如既往方法所述[8],在再灌注開始時(shí),通過(guò)雙側(cè)后肢阻斷股動(dòng)脈血流10min,開放10min,共3個(gè)周期。假手術(shù)組除了不進(jìn)行線栓外,剩余操作均相同。死亡2只,造模不成功3只。

1.3.3 神經(jīng)功能評(píng)分

再灌注24h后檢測(cè),根據(jù)Longa等[7]的方法,評(píng)估大鼠的神經(jīng)行為。0分:無(wú)神經(jīng)功能損害。1分:左前肢不能完全伸展。2分:行走時(shí)向左打轉(zhuǎn)。3分:行走時(shí)向左側(cè)跌倒。4分:不能行走且意識(shí)水平低下。

1.3.4 腦組織含水量測(cè)定

取右側(cè)大腦半球稱重量,即濕重,110℃烘烤24h后再次稱重,即干重,腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.5 TTC染色法

腦組織冠狀切片,放在2%TTC溶液中,37℃避光水浴,30min充分染色,梗死組織染色呈白色,梗死體積%=[(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)半球非梗死區(qū)體積)/對(duì)側(cè)半球體積]×100%。

1.3.6 采用EB染色法評(píng)估血腦屏障破壞情況

麻醉大鼠,尾靜脈注射2%伊文氏藍(lán)溶液(4mL/kg),取腦組織稱重,加入1mLPBS溶液后研磨,與2.5mL的60%三氯乙酸混合之后進(jìn)行離心15min(12000rpm/min),低溫保存約10min,吸取上清液,分光光度計(jì)在610nm處估計(jì)EB吸收率。

1.3.7 Western blot法分析AQP4的表達(dá)

分離出右側(cè)紋狀體及右側(cè)頂葉皮質(zhì),并放在-80℃冰箱保存。分別經(jīng)以下步驟:組織蛋白提取,溶液配制,配膠,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗、二抗孵育,曝光,顯影。測(cè)定蛋白灰度值與β-Actin的比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行錄入分析,結(jié)果均以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。分析前使用正態(tài)性檢驗(yàn)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。符合數(shù)據(jù)的多組間獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布采用多獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織病理改變

Sham組:缺血側(cè)海馬CA1區(qū)組織細(xì)胞形態(tài)正常,無(wú)水腫及壞死;I/R組:CA1區(qū)呈明顯的病理性改變,間質(zhì)疏松、水腫,細(xì)胞周圍間隙增寬,細(xì)胞排列紊亂,神經(jīng)細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核濃縮且不規(guī)則;RIPC組:CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞濃縮和間質(zhì)腫脹程度明顯減輕,排列較規(guī)整,顯著改善了細(xì)胞損傷。見(jiàn)圖1。

Sham組(×200) I/R組 (×200) RIPC組(×200)

2.2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

Sham組大鼠無(wú)神經(jīng)功能障礙;I/R組出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙,神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.01);與I/R組比,RIPC組大鼠神經(jīng)評(píng)分降低,改善了神經(jīng)功能障礙,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.081),見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能、腦組織含水量、腦梗死體積以及腦血腦屏障情況比較(n=25)

2.3 腦組織含水量

評(píng)估腦水腫。和Sham組比,I/R組大鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.01);與I/R組比,RIPC組大鼠腦組織含水量顯著降低(P<0.01),見(jiàn)表1。

2.4 TTC染色

測(cè)大鼠腦梗死體積,梗死區(qū)域呈白色,而正常的非梗死組織呈紅色。Sham組大鼠腦組織無(wú)缺血梗死。與I/R組相比,RIPC組顯著降低了大鼠腦梗死體積(P<0.01),見(jiàn)表1。

2.5 血腦屏障滲透性

EB滲透量:I/R組與Sham組有顯著差異(P<0.01),RIPC組與I/R組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013),見(jiàn)表1。

2.6 AQP4的表達(dá)

紋狀體區(qū)和皮質(zhì)區(qū)I/R組的AQP4蛋白的表達(dá)明顯高于Sham組(P<0.01)。而RIPC組中紋狀體區(qū)AQP4蛋白的表達(dá)明顯低于I/R組(P<0.01),見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組大鼠腦組織紋狀體區(qū)、皮質(zhì)區(qū)AQP4比較

圖2 各組大鼠缺血側(cè)紋狀體和皮質(zhì)區(qū)AQP4的表達(dá)

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一種復(fù)雜的病理過(guò)程,包括缺血期原發(fā)性損傷和再灌注期繼發(fā)性損傷[9]。這會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷、凋亡和水腫,加重由細(xì)胞膜損傷、興奮性氨基酸毒性、中性粒細(xì)胞活化毒性等多種因素引起的腦損傷[10]。血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周血循環(huán)之間的動(dòng)態(tài)接口,在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由于血腦屏障的破壞引起的腦水腫可擴(kuò)大缺血性腦卒中的梗死面積[11]。因此,減輕腦水腫、保護(hù)血腦屏障完整性、降低血腦屏障通透性可有效緩解腦缺血再灌注損傷。

為了評(píng)價(jià)腦保護(hù)方法的效果,本研究采用了多種評(píng)價(jià)方法,包括干濕重法測(cè)量腦組織含水量、TTC染色測(cè)量腦梗死體積、EB染色評(píng)價(jià)血腦屏障的破壞程度。RIPC可以顯著減輕腦水腫、降低血腦屏障通透性和減少梗死體積,從而有效緩解腦缺血再灌注損傷,起到神經(jīng)保護(hù)作用。

AQP4是一種雙向水特異性通道,主要分布在膠質(zhì)界和星形細(xì)胞端足內(nèi),在血腦屏障處,星形膠質(zhì)細(xì)胞利用AQP4來(lái)維持顱內(nèi)液體平衡[12]。AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最高的水通道蛋白,在腦水腫的形成和消散中起著至關(guān)重要的作用。既往有研究使用大鼠紋狀體或頂葉皮質(zhì)通過(guò)免疫印跡法進(jìn)行AQP4的測(cè)定[13],但僅提供一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。考慮到不同區(qū)域可能會(huì)對(duì)AQP4表達(dá)的結(jié)果產(chǎn)生不同影響。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)AQP4在紋狀體和頂葉皮質(zhì)兩個(gè)區(qū)域的表達(dá)進(jìn)行測(cè)量。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,大腦中動(dòng)脈閉塞90min再灌注24h可導(dǎo)致AQP4在大鼠體內(nèi)表達(dá)上調(diào),經(jīng)過(guò)RIPC處理后大鼠兩部位AQP4的表達(dá)明顯降低。

Aoki等[14]使用MCAO模型發(fā)現(xiàn)AQP4mRNA的表達(dá)隨著腦水腫的加重而在缺血性病變外周顯著升高,表明腦缺血引起的腦水腫可能與AQP4參與的水運(yùn)輸有關(guān)。這可能是由于AQP4的上調(diào)使水從細(xì)胞外和間質(zhì)迅速轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。此外,I/R損傷可以導(dǎo)致AQP4的表達(dá)上調(diào),從而加重腦損傷。抑制AQP4后,腦I/R動(dòng)物的腦水腫程度明顯減輕,預(yù)后得到改善[15]。遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)治療可以降低大鼠腦I/R損傷后AQP4的表達(dá)水平,因此推測(cè)AQP4可能參與了遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

研究表明,RIPC可以顯著減少局灶缺血再灌注大鼠的腦梗死體積、降低腦水腫并減弱AQP4的表達(dá)[16],這表明RIPC的保護(hù)機(jī)制部分依賴于下調(diào)AQP4表達(dá),從而改善功能結(jié)果。本研究數(shù)據(jù)顯示,I/R組中AQP4的表達(dá)增加,而RIPC組顯著下調(diào)了AQP4的表達(dá),提示下調(diào)AQP4可以改善腦缺血再灌注早期的腦損傷。本研究的發(fā)現(xiàn)為RIPC在局灶性腦缺血再灌注模型中發(fā)揮有效的AQP4調(diào)節(jié)作用和神經(jīng)保護(hù)作用提供了初步的證據(jù)。首先,只觀察了再灌注24h后的結(jié)果,因?yàn)樵谌毖?4h后觀察到水腫高峰[17]。因此,研究了腦I/R后早期水腫的形成。由于條件的限制,沒(méi)有評(píng)估造模是否成功。僅從10只局灶腦缺血再灌注大鼠腦組織切片的TTC染色及造模大鼠神經(jīng)功能評(píng)分來(lái)看,這次造模是成功的,且與其他試驗(yàn)結(jié)果相符[18]。

遠(yuǎn)端缺血后適應(yīng)可以改善MCAO/R后神經(jīng)功能障礙,減輕腦水腫,減少梗死體積,降低血腦屏障通透性,產(chǎn)生腦保護(hù)作用;并且可以通過(guò)下調(diào)AQP4的表達(dá),減輕缺血再灌注損傷,降低血腦屏障的通透性,減輕腦水腫,降低梗死體積。使用下肢作為遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)的器官是安全可行的,值得臨床上進(jìn)一步探討并應(yīng)用。