SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳分析16個(gè)博落回種質(zhì)資源的遺傳多樣性

牛雨晴，朱育菁，鄭梅霞，朱雁鳴，陳 宏，蘇海蘭

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 福建 福州 350003)

博落回Macleayacordata別名三錢三，又名筒桿、滾地龍等，為罌粟科博落回屬植物[1]，多產(chǎn)于貴州、四川、湖南、湖北、廣西、廣東等地，全草有大毒，不可內(nèi)服。博落回作為藥用植物在抗菌抗炎、抗腫瘤、改善肝功能以及增強(qiáng)免疫力、治療皮膚疾病等方面有重要功效，同時(shí)在飼料添加劑和植物源農(nóng)藥方面也有廣泛的應(yīng)用[2-6]。因此，博落回市場前景廣闊且經(jīng)濟(jì)效益顯著。但是當(dāng)前，對于博落回的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、抗癌藥物及生物農(nóng)藥等方面，而對博落回植物遺傳多樣性與品種選育研究相對缺乏[7-11]。博落回育種工作進(jìn)展緩慢，對其育種工作缺乏系統(tǒng)深入研究，生產(chǎn)上容易出現(xiàn)種質(zhì)混雜以及種性退化，嚴(yán)重影響該產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展。

分子標(biāo)記因具有高特異、高精度、微量、快速等特點(diǎn)，可從DNA層面上直接識別出不同種質(zhì)之間的差異，是研究藥材種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要方法。近年來，科研人員已將各種分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用在藥用植物遺傳多樣性、種質(zhì)資源的鑒定和輔助育種等研究領(lǐng)域[13]，但博落回中DNA分子標(biāo)記研究較少。黃鵬等[14]對來自湖南、江西等地的30個(gè)博落回屬植物ITS2序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，并獲得30條博落回ITS2序列，這些ITS2序列可以有效準(zhǔn)確鑒別博落回屬植物。朱鵬程等[15]基于博落回轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)并篩選了28對SSR有效性引物，利用引物擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)4個(gè)產(chǎn)地博落回的相似性較高。然而，過去研究中所使用的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，靈敏性、準(zhǔn)確性及效率相比熒光標(biāo)記毛細(xì)管技術(shù)更低。利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管技術(shù)用于多個(gè)省份博落回種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究尚未見報(bào)道。本研究基于文獻(xiàn)報(bào)道的SSR分子標(biāo)記，對貴州、江西、福建、湖南、湖北及浙江等13個(gè)省份16份博落回種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了綜合分析，為博落回種質(zhì)資源鑒定提供參考依據(jù)，并對進(jìn)一步利用分子標(biāo)記縮短育種年限有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

16份博落回種質(zhì)資源來自我國13個(gè)省份，所有種質(zhì)材料均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所陳敏健副研究員鑒定，具體信息見表 1。

1.2 儀器和試劑

磁珠法基因組DNA提取試劑盒(武漢納磁生物科技有限公司)；2×TaqPCRMasterMix(美國基因泰克公司)；384孔PCR板[愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司]；分子量內(nèi)標(biāo)GeneScanTM500 LIZ、Hi-DiTMFormamide、POP-7TMPolymer、3730 Running Buffer(10X)(賽默飛世爾科技公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1DNA的提取 采用磁珠法植物基因組提取試劑盒配套說明書對博落回樣本進(jìn)行核酸提取。取適量植物組織(鮮重20～50 mg)在液氮中研磨后，經(jīng)過DNA沉淀、DNA清洗、DNA溶解去雜，最終得到每份博落回樣品的DNA。經(jīng)過凝膠核酸電泳檢測成功后的DNA進(jìn)行吸光度值的檢測后，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2熒光PCR擴(kuò)增 SSR引物采用朱鵬程等[15]開發(fā)的引物，共6對，引物信息見表2。16份種質(zhì)資源樣本擴(kuò)增反應(yīng)在Veriti384 PCR儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，62～52℃梯度退火30 s，72℃延伸30 s，運(yùn)行10個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，運(yùn)行25個(gè)循環(huán)；72℃延伸20 min，最后4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熒光毛細(xì)管電泳檢測。

表2 6對SSR引物信息

1.3.3毛細(xì)管電泳檢測 取PCR產(chǎn)物1 μL、分子量內(nèi)標(biāo)0.5 μL和去離子甲酰胺8.5 μL混合加入PCR板離心后放到PCR儀上運(yùn)行變性程序(95℃、3 min)，變性完成后立即冷卻。在ABI3730XL DNA遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，并用Data Collection軟件收集電泳原始數(shù)據(jù)。

1.3.4數(shù)據(jù)分析 收集到的原始數(shù)據(jù)利用Genemapper軟件分析，計(jì)算擴(kuò)增片段大小。按照毛細(xì)管電泳遷移位置，用1和0分別代表檢測到擴(kuò)增片段的有無，建立原始數(shù)據(jù)表。利用POPGENE 1.32 軟件統(tǒng)計(jì)觀測等位基因數(shù)(Na)、Shannon′s信息指數(shù)(I)、有效等位基因數(shù)(Ne)，利用NTSYS 2.10e軟件對各品種進(jìn)行遺傳相似性分析，采用UPGMA(unweighted pair group method with average)法對各品種進(jìn)行聚類分析，利用PIC-CAL計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)。利用R包poppr的aboot方法，UPGMA方法進(jìn)行聚類分析。

1.3.5指紋圖譜構(gòu)建 根據(jù)檢測到的引物等位基因差異，建立16份博落回種質(zhì)資源樣品的指紋圖譜，并對6對標(biāo)記的擴(kuò)增片段按分子量大小排列，并進(jìn)行數(shù)字編碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

由表3可知，6對SSR引物在16個(gè)博落回種質(zhì)資源中檢測到27個(gè)等位基因，等位基因數(shù)(Na)的變化幅度為2～6個(gè)，平均為4.5個(gè)，說明這些引物可適于16份博落回種質(zhì)資源的遺傳多樣性檢測；有效等位基因數(shù)(Ne)的變化幅度為2～3.686，平均為2.6105，其中有效等位基因數(shù)最高的是P1，為3.686，其次是P5、P37和P24，分別為2.82、2.56和2.513，說明這4對引物有較高的檢測效率；Shannon′s指數(shù)(I)的變化幅度為0.693～1.479，平均為1.1098；多態(tài)信息含量(PIC)的變化范圍為0.375～0.687，平均為0.5355，PIC大于0.50的位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)，在0.25～0.50為中度多態(tài)位點(diǎn)，小于0.25時(shí)為低度多態(tài)位點(diǎn)[15]，說明16份博落回種質(zhì)資源屬于高度多態(tài)位點(diǎn)，具有一定的遺傳變異。

表3 6對SSR標(biāo)記對16份博落回種質(zhì)資源的多態(tài)性分析

2.2 遺傳相似系數(shù)分析

由表4可知，16份博落回種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.0714～0.7142，平均值為0.5790，其中云南(N)與陜西(I)遺傳相似系數(shù)最小，為0.0714，說明這兩份資源之間遺傳基礎(chǔ)差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；江蘇(K)與甘肅(J)這兩樣本之間的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.7142，說明這兩份資源間遺傳基礎(chǔ)差異最小，親緣關(guān)系最近。

表4 16份博落回種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)

2.3 聚類分析

由圖1可知，在遺傳相似系數(shù)0.3處可將16份博落回種質(zhì)資源分為3個(gè)大類群，第Ⅰ大類包括三明明溪(A)、云南(N)、長沙(B)、貴州獨(dú)山縣(C)、貴州羅甸縣(D)、貴州邊陽縣(E)、重慶(O)，說明這7份種質(zhì)資源具有相近的遺傳背景，與其他種質(zhì)資源遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；第Ⅱ大類只有三明明溪(P)這一份種質(zhì)資源；其余8份種質(zhì)資源聚到第Ⅲ大類。進(jìn)一步遺傳分析表明，第Ⅰ大類在遺傳相似系數(shù)0.5處又可分為3個(gè)亞類，第ⅰ亞類有三明明溪(A)、云南(N)2份種質(zhì)資源；第ⅱ亞類有長沙(B)、貴州獨(dú)山縣(C)、貴州羅甸縣(D)、貴州邊陽縣(E)4份種質(zhì)資源；第ⅲ亞類只有重慶(O)這1份種質(zhì)資源。第Ⅲ大類在遺傳相似系數(shù)0.5處又可分為2個(gè)亞類，第ⅰ亞類有浙江(F)、甘肅(J)、江蘇(K)、云南(N)4份種質(zhì)資源。

2.4 SSR指紋圖譜的構(gòu)建

按表5順序?qū)?對標(biāo)記對應(yīng)的編碼組合，每份種質(zhì)資源可得到唯一的數(shù)字編碼，組成每份種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜(表6)。如樣本“P”中的擴(kuò)增片段大小為184、212、197、237、216、186、183、225/227，轉(zhuǎn)換成0，1格式的指紋數(shù)字代碼為010100001000100000001000110。首先，按照引物P12、P1、P24、P37、P5、P9的順序進(jìn)行排序；然后，在每個(gè)位點(diǎn)中，根據(jù)所有樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物大小依次進(jìn)行排序，如P37位點(diǎn)在所有樣本中的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為：235、237、250、253、256 bp，樣本P在這個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增片段大小為237/237，轉(zhuǎn)化成0，1格式即為01000；依次類推，將樣本在每個(gè)位點(diǎn)中的0，1矩陣按位點(diǎn)順序排列組成在一起即為該樣本的0，1指紋圖譜。

表5 6個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性片段及其編碼

表6 16份博落回種質(zhì)資源指紋圖譜

3 討論與結(jié)論

本研究表明在16份博落回的供試材料中，引物P1擴(kuò)增條帶中的213、219 bp，引物P9擴(kuò)增條帶中的218、227 bp，這些條帶是福建三明明溪(優(yōu))產(chǎn)地特有的條帶；引物P1擴(kuò)增條帶中的212 bp，引物P9擴(kuò)增條帶中的225、227 bp，這些條帶是福建三明明溪(一般)產(chǎn)地特有的條帶；引物P5擴(kuò)增條帶中的189、191 bp是甘肅產(chǎn)地博落回所特有的條帶；引物P9擴(kuò)增條帶中的211、230 bp，引物P24擴(kuò)增條帶中的206 bp，引物P37擴(kuò)增條帶中的235、237 bp，這些條帶是重慶產(chǎn)地特有的條帶；引物P24擴(kuò)增條帶中的209 bp條帶是長沙山上博落回所特有的條帶。這些條帶將為博落回的產(chǎn)地溯源及種質(zhì)資源評價(jià)提供幫助。

已有的植物SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性研究中，SSR擴(kuò)增產(chǎn)物主要由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[16-17]，較難準(zhǔn)確讀出擴(kuò)增片段大小，并且整合不同試驗(yàn)批次和不同膠板的數(shù)據(jù)是個(gè)難題，容易出現(xiàn)人為的誤讀或錯(cuò)讀。SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測可直接讀出擴(kuò)增的目標(biāo)片段大小，檢測數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確[18]，便于遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)整合及分析。本研究區(qū)別于其他研究中所利用的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測準(zhǔn)確地對16份博落回種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)供試種間的遺傳相似系數(shù)0.0714～0.7142，平均值為0.5790，說明16份博落回種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。這一結(jié)果的遺傳相似系數(shù)范圍相比于其他研究結(jié)果更廣，這可能是因?yàn)楸狙芯克玫脑嚬┎牧蟻碓捶秶鼜V，說明本研究的結(jié)果對博落回種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析具有重要意義。

在16份來自不同省份的博落回樣品中，親緣關(guān)系最近的為甘肅(J)種質(zhì)與江蘇(K)種質(zhì)，說明它們之間的遺傳差異很??；采自云南(N)種質(zhì)與陜西(I)種質(zhì)之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。而來自福建三明明溪的兩個(gè)不同種質(zhì)其遺傳相似系數(shù)為0.2727，遺傳相似系數(shù)較低。從遺傳相似系數(shù)看種質(zhì)親緣關(guān)系，福建三明明溪的兩個(gè)不同種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)小于甘肅(J)種質(zhì)與江蘇(K)種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)，這表明博落回種質(zhì)資源間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近不全由地理距離決定，其種質(zhì)資源之間的基因交流可能還與地形地貌、生態(tài)氣候、海拔經(jīng)緯度、生物群落分布等自然因素及人類活動等社會因素密切相關(guān)，從而影響種質(zhì)之間的親緣關(guān)系。16份來自于不同省份的博落回樣品在閾值為0.3時(shí)分為三大類，這些樣品遺傳多樣性處于較高水平，其種質(zhì)資源基因庫較為豐富，種質(zhì)間有明顯分化，有待于結(jié)合生物學(xué)特性、農(nóng)藝性狀、化學(xué)成分及其他分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步探討研究。