鴉膽子油乳對大鼠體內(nèi)紫杉醇藥代動力學(xué)的影響*

雷珍珍，薛春苗，梁 艷，朱寶琛，曹俊嶺，3△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院洛陽醫(yī)院，河南 洛陽 471934）

紫杉醇是一種廣譜抗腫瘤藥，主要作用機(jī)制為通過使腫瘤細(xì)胞微管蛋白和組成微管的微管蛋白二聚體失去動態(tài)平衡，誘導(dǎo)與促進(jìn)微管蛋白聚合、微管裝配、防止解聚，進(jìn)而使細(xì)胞周期阻斷至G2/M 期，導(dǎo)致細(xì)胞停止分裂并死亡［1-4］。目前，紫杉醇已被廣泛應(yīng)用于卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等實(shí)體瘤的化學(xué)治療（簡稱化療）［5-7］，其在體內(nèi)的主要代謝酶包括P - 糖蛋白（P-gp）、細(xì)胞色素P450酶（CYP450）中的CYP3A4和CPY2C8［8］。鴉膽子油乳是由苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實(shí)提取的有效抗腫瘤成分［9］，為細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物，對G0期、G1期、S 期、G2期、M 期的腫瘤細(xì)胞均有殺傷和抑制作用，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞DNA 和RNA 及蛋白質(zhì)的合成，干擾肽鍵形成［10］。近年來，抗腫瘤中藥注射劑在腫瘤治療中的優(yōu)勢明顯［11］，臨床常將中藥注射劑作為輔助化療的藥物應(yīng)用于多種腫瘤的治療，可增強(qiáng)療效，減少化療引起的不良反應(yīng)［12］。臨床常聯(lián)用鴉膽子油乳和紫杉醇治療非小細(xì)胞肺癌、直腸癌、食管癌、惡性胸腔積液等，可提高療效，提升患者的生活質(zhì)量，減輕不良反應(yīng)［13-19］。同時，鴉膽子油乳對腫瘤多藥耐藥有一定逆轉(zhuǎn)作用［20］。治療劑量的鴉膽子油乳對CYP3A4 有較強(qiáng)的抑制作用，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.78%［21］，提示鴉膽子油乳與紫杉醇可能存在藥物相互作用，但兩藥產(chǎn)生相互作用的機(jī)制尚不明確。本研究中探討了鴉膽子油乳對大鼠體內(nèi)紫杉醇藥代動力學(xué)的影響，為臨床的兩藥聯(lián)用提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器：UPLC I- Class 型超高效液相色譜儀，XEVO TQS - Micro 型質(zhì)譜儀，均購自美國Waters 公司；900 SERIES 型超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；Sepatech biofuge 28RS型離心機(jī)（德國Heraeus公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為萬分之一）。

試藥：鴉膽子油乳注射液（沈陽藥大雷允上藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號為120120811，規(guī)格為每支10 mL）；紫杉醇注射液（北京協(xié)和藥廠有限公司，批號為191202，規(guī)格為每支5 mL∶30 mg）；紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，貨號為B21695，含量不低于98%）；鹽酸普萘洛爾（內(nèi)標(biāo)，上海貝萬塔生物科技有限公司，批號為BCP-100783，純度不低于99%）。

動物：SPF 級雄性SD 大鼠20 只，7 周齡，體質(zhì)量（210 ± 10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2016—0006。置晝夜光照規(guī)律條件下，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)溫度為20.4～25.4 ℃，相對濕度為50%～70%。本研究方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會審批，倫理審批號為SYXK（京）2020—0013。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，取16 只，隨機(jī)分為紫杉醇聯(lián)用鴉膽子油乳組（PTX + BJOE 組）和紫杉醇組（PTX 組），各8 只。PTX+BJOE 組大鼠腹腔注射鴉膽子油乳注射液2.7 mL/kg，PTX 組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)5 d，每天1 次；最后1 d 給藥30 min 后，兩組大鼠均腹腔注射紫杉醇注射液3.5 mL/ kg。給藥后0，0.083，0.5，1，2，4，8，24，48 h，經(jīng)大鼠眼眶靜脈采血0.2 mL，置肝素抗凝離心管中，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min）10 min，分離血漿，- 80 ℃凍存，備用。其余4 只大鼠經(jīng)腹主動脈采血，制備空白血漿，-80 ℃凍存，備用。

2.2 血漿樣品處理

常溫解凍血漿樣品，取100 μL 置1.5 mL EP 管中，加300 μL甲醇，振蕩10 min，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min）10 min，取上層血漿，分裝凍存，備用。

2.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定大鼠血漿中紫杉醇含量

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A 為1 mmol / L 乙酸銨- 0.04%乙酸水溶液，B 為乙腈- 異丙醇（1∶1，V/V），梯度洗脫（程序見表1）；流速：0.26 mL / min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）；離子源溫度：500 ℃；檢測模式：正離子、多重反應(yīng)模式；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源電壓：10 V；離子源溫度：150 ℃；霧化溫度：500 ℃；霧化氮?dú)饬髁浚? 000 L/h。

2.3.3 溶液制備

紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，精密稱定，加1 mL 甲醇使溶解，置50 mL 容量瓶中，加甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為100 μg/ mL 的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，加甲醇稀釋為質(zhì)量濃度分別為0.5，1，2，5，10，20，50，100，200，500，2 000 ng/mL 的系列紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)工作液：取鹽酸普萘洛爾10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。取內(nèi)標(biāo)貯備液，加甲醇多次稀釋并定容至100 mL，即得，質(zhì)量濃度為0.005 μg/mL。

紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液：取空白血漿樣品，室溫解凍，按2.2項(xiàng)下方法處理，加入系列紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，即得。

質(zhì)控樣品溶液：取空白血漿樣品，室溫解凍，按2.2 項(xiàng)下方法處理，加入質(zhì)量濃度分別為5，50，500 ng/mL的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，即得低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液，室溫放置。另取1份于-80 ℃凍存，備用。

內(nèi)標(biāo)樣品溶液：取空白血漿樣品，室溫解凍，按2.2 項(xiàng)下方法處理，精密吸取50 μL，轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管中，加內(nèi)標(biāo)工作液50 μL和甲醇200 μL，振蕩10 min，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r / min）10 min，濾過，取上清液，即得。

2.3.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取空白血漿樣品和PTX 組大鼠血漿樣品，室溫解凍，分別加紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。取空白血漿、空白血漿+ 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、PTX 組大鼠血漿+ 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，考察紫杉醇出峰處是否有雜質(zhì)干擾，以及樣品與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)是否完全分離。結(jié)果紫杉醇的保留時間為3.24 min，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)無干擾，分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

1.紫杉醇A.空白血漿 B.空白血漿+紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液 C.PTX組大鼠血漿+紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液圖1 專屬性試驗(yàn)超高效液相色譜圖1.PaclitaxelA.Blank plasma B.Blank plasma + paclitaxel standard solution C.Rats' plasma in the PTX group + paclitaxel standard solutionFig.1 UPLC chromatogram of the specificity test

線性關(guān)系考察：精密吸取內(nèi)標(biāo)樣品溶液和紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液各適量，按上述色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，以紫杉醇和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)、紫杉醇質(zhì)量濃度（C，ng / mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行加權(quán)線性回歸分析，權(quán)重為W=1/C2，回歸方程為Y=3 478X+10 330（R2=0.999 3，n=11）。結(jié)果表明，紫杉醇的質(zhì)量濃度在0.5～2 000 ng/mL 范圍內(nèi)與紫杉醇和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值線性關(guān)系良好。定量下限為0.5 ng/mL。

精密度試驗(yàn)：取低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液，按上述色譜與質(zhì)譜條件于同1 d 內(nèi)平行測定5 次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿中紫杉醇的質(zhì)量濃度。結(jié)果見表2，表明儀器精密度良好。

表2 精密度、穩(wěn)定性、加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（%，n=5）Tab.2 Results of the precision，stability，recovery tests（%，n = 5）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取- 80 ℃凍存低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液，分別于第2，3，7天室溫解凍，按上述色譜與質(zhì)譜條件于同1 d內(nèi)平行測定5次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿中紫杉醇的質(zhì)量濃度。結(jié)果見表2，表明樣品在-80 ℃冰箱放置2，3，7 d 的穩(wěn)定性均良好。

加樣回收試驗(yàn)：取低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液適量，按上述色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，計算血漿中紫杉醇的質(zhì)量濃度，即得實(shí)測質(zhì)量濃度；取質(zhì)量濃度分別為5，50，500 ng/mL 的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，各平行5份，同法測定，即得理論質(zhì)量濃度。回收率（%）=實(shí)測質(zhì)量濃度/理論質(zhì)量濃度×100.00%。結(jié)果見表2。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理［22］

采用GraphPad Prism 7.04 軟件繪制血藥濃度-時間曲線；采用DAS 2.0軟件分析各組大鼠血藥濃度隨時間的變化，計算藥代動力學(xué)參數(shù)；采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析各組間的差異，結(jié)果以±s表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 鴉膽子油乳對大鼠體內(nèi)紫杉醇血藥濃度的影響

與PTX 組比較，PTX + BJOE 組大鼠給藥后0.5，4，8，24 h 時紫杉醇的血藥濃度均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2和表3。

圖2 兩組大鼠體內(nèi)紫杉醇的血藥濃度-時間曲線（n=8）Fig.2 Blood concentration - time curve of PTX in rats in the two groups（n = 8）

表3 兩組大鼠給藥后各時間點(diǎn)的血藥濃度（±s，ng/mL，n=8）Tab.3 Blood drug concentrations of PTX at different time points after administration in two groups（±s，ng/mL，n=8）

表3 兩組大鼠給藥后各時間點(diǎn)的血藥濃度（±s，ng/mL，n=8）Tab.3 Blood drug concentrations of PTX at different time points after administration in two groups（±s，ng/mL，n=8）

注：與PTX組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表4同。Note：Compared with those in the PTX group，*P ＜ 0.05，**P ＜0.01（for Tab.3 - 4）.

PTX+BJOE組7.44±3.69 84.37 ±8.20**141.04±22.95 627.49±163.94 518.83±41.86**457.13±53.23**82.68±23.93*7.58±0.88時間0.083 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h PTX組5.88±2.40 35.56±9.34 106.97± 32.84 534.30±235.18 276.50±121.65 178.99±51.08 50.30±19.73 11.97±4.90

2.6 鴉膽子油乳對大鼠血漿中紫杉醇藥代動力學(xué)參數(shù)的影響

兩組大鼠達(dá)峰時間（tmax）均為（2.40±0.89）min。與PTX 組比較，PTX+BJOE 組大鼠血漿中的0-∞時血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-∞）顯著升高（P＜0.05），半衰期（t1/2）顯著縮短（P＜0.05）；達(dá)峰濃度（Cmax）升高，表觀分布容積（Vd）降低，但均無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表4 兩組大鼠血漿中的藥代動力學(xué)參數(shù)（±s，n=8）Tab.4 Pharmacokinetic parameters of PTX in rat plasma in the two groups（X ± s，n = 8）

表4 兩組大鼠血漿中的藥代動力學(xué)參數(shù)（±s，n=8）Tab.4 Pharmacokinetic parameters of PTX in rat plasma in the two groups（X ± s，n = 8）

PTX+BJOE組2.40±0.89 634.49±163.29 7 921.25±2 438.29*0.035±0.028 0.003±0.002 7.520±1.480*參數(shù)tmax（h）Cmax（ng/mL）AUC0-∞［（h·ng）/mL］Vd（L/g）Cl［（h·g）/h］t1/2（h）PTX組2.40±0.89 576.59±184.51 4 835.92±933.44 0.065±0.014 0.004±0.001 10.100±1.300

3 討論

中西藥聯(lián)用抗腫瘤在臨床應(yīng)用普遍［23］，聯(lián)用方案能提高總有效率，改善化療藥物的多藥耐藥，減少不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量［24-26］。鴉膽子油乳聯(lián)用紫杉醇抗腫瘤在臨床十分常見，但中藥所含成分復(fù)雜，具有多靶點(diǎn)、多信號通路等特點(diǎn)［27-28］，兩藥聯(lián)用可能存在相互作用。不良的相互作用會導(dǎo)致療效降低或不良反應(yīng)增加，故明確中西藥間的相互作用，發(fā)掘其作用機(jī)制，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)［29］。

本研究中探討了鴉膽子油乳對紫杉醇藥代動力學(xué)的影響，鴉膽子油乳對CYP3A4 有較強(qiáng)的抑制作用，紫杉醇主要經(jīng)肝臟CYP3A4 代謝。結(jié)果顯示，鴉膽子油乳可提高紫杉醇的Cmax和AUC0-∞，減小Vd，縮短t1/2。鴉膽子油乳為CYP3A4 抑制劑，紫杉醇主要通過該酶代謝，推測t1/2應(yīng)延長，但結(jié)果不一致。閆加慶［22］研究艾迪注射液對大鼠體內(nèi)紫杉醇藥代動力學(xué)的影響發(fā)現(xiàn)，艾迪注射液提高紫杉醇的Cmax和AUC0-∞可能與其抑制CYP3A4 活性從而抑制紫杉醇的代謝有關(guān)，聯(lián)用的t1/2顯著短于單用，認(rèn)為t1/2的大小取決于Vd和Cl的比值。故推測鴉膽子油乳聯(lián)用紫杉醇存在藥物相互作用，鴉膽子油乳可影響紫杉醇AUC0-∞和Cmax的提升，可增強(qiáng)臨床療效，t1/2的降低可能加快紫杉醇的代謝，減輕其不良反應(yīng)。預(yù)測鴉膽子油乳可能會通過抑制CYP3A4而抑制紫杉醇代謝，改變紫杉醇藥代動力學(xué)參數(shù)。

本研究中初步明確了鴉膽子油乳對紫杉醇藥代動力學(xué)的影響，兩藥聯(lián)用可能存在相互作用，鴉膽子油乳可能會使紫杉醇的血藥濃度增大、藥效增強(qiáng)，臨床應(yīng)用時需減小紫杉醇的劑量。本研究存在以下局限性。1）紫杉醇在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟CYP3A4 和CYP2C8 代謝，且是P - gp 底物，需進(jìn)一步考察鴉膽子油乳對CYP2C8 和P-gp的影響，評價鴉膽子油乳是否通過肝藥酶、P-gp對紫杉醇藥代動力學(xué)參數(shù)產(chǎn)生影響，鴉膽子油乳對紫杉醇的影響及其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討；2）本研究中以SD大鼠為給藥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，臨床應(yīng)用中受試者為人，存在種屬間的差異，會導(dǎo)致某些藥物在代謝行為和特異性方面與大鼠有差異，其相互作用的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。