鴉膽子油乳對(duì)肺癌A549細(xì)胞順鉑化療的增敏作用及其機(jī)制

易飛，劉蕾，張軍

1 成都市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，成都 610031；2 成都市第三人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)部；3 成都市第三人民醫(yī)院腫瘤二科

鴉膽子為枯木科鴉膽子屬灌木或小喬木的干燥成熟果實(shí)，鴉膽子油乳是以鴉膽子石油醚提取物為原料，以精制大豆磷脂為乳化劑制成的水包油乳［1］。作為目前臨床常用的中藥抗癌藥物之一，鴉膽子油乳多用于肺癌、肺癌腦轉(zhuǎn)移及消化道惡性腫瘤的治療［2］。王權(quán)等［3］在鴉膽子油乳聯(lián)合含鉑類(lèi)一線(xiàn)化療方案治療非小細(xì)胞肺癌的Meta 分析中發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳聯(lián)合含鉑類(lèi)化療能提高非小細(xì)胞肺癌的腫瘤控制率，提高患者的化療效果。目前關(guān)于鴉膽子油乳可提高鉑類(lèi)化療藥物臨床療效的觀察研究較多，但該藥是否與鉑類(lèi)藥物有協(xié)同作用的基礎(chǔ)研究較少。2022年1月—12月，本課題組在肺癌A549細(xì)胞株中觀察了鴉膽子油乳與順鉑的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，探討鴉膽子油乳是否對(duì)肺癌A549 細(xì)胞順鉑化療具有增敏作用并分析其可能機(jī)制，以期為臨床肺癌化療的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺癌A549 細(xì)胞株（中科院典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)）。注射用順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司），鴉膽子油乳注射劑（沈陽(yáng)藥大藥業(yè)責(zé)任有限公司）。RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國(guó)HyClone 公司），CCK-8 試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京Biosharp 公司），熒光雙染凋亡試劑盒（蘇州四正柏生物科技有限公司）。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Perkin Elmer 公司）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司）、熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.2 細(xì)胞的藥物敏感性觀察 人肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔 100 μL，常規(guī)培養(yǎng)48 h 后分別加入100 μL以培養(yǎng)液稀釋的藥物。鴉膽子油乳設(shè)5個(gè)梯度濃度（625、313、156、78、39 μg/mL），順鉑亦設(shè)置5個(gè)梯度濃度（5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/mL）［4-5］，每個(gè)藥物濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不接種細(xì)胞的空白對(duì)照孔及不加藥物的對(duì)照孔。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μL MTT，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm 處各孔光密度（OD）值，取各復(fù)孔OD 值的平均值計(jì)算各濃度藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。抑制率=（對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD 值）/對(duì)照孔OD 值×100%，根據(jù)抑制率計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。IC50越低，說(shuō)明細(xì)胞對(duì)藥物越敏感。MTT 試驗(yàn)結(jié)果顯示，鴉膽子油乳及順鉑的IC50分別為（58.47 ± 6.87）、（1.98 ± 0.31）μg/mL。根據(jù)兩種藥物的IC50，進(jìn)一步采用MTT 法觀察不同濃度鴉膽子油乳對(duì)順鉑IC50的影響。分別將2.44、9.77、78.12 μg/mL的鴉膽子油乳加入2.50、1.25、0.62、0.31、0.16 μg/mL 的順鉑中，MTT 法檢測(cè)各濃度藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，計(jì)算順鉑的IC50。

1.3 細(xì)胞分組及處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549 細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，以1 × 104/孔接種于6 孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過(guò)夜。細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、鴉膽子油乳組、順鉑組及鴉膽子油乳+順鉑組，根據(jù)“1.2”中得到的鴉膽子油乳及順鉑IC50的1/2 確定藥物處理濃度，即鴉膽子油乳組以30 μg/mL鴉膽子油乳單藥處理，順鉑組以0.75 μg/mL順鉑單藥處理，鴉膽子油乳+順鉑組以30 μg/mL 鴉膽子油乳及0.75 μg/mL順鉑聯(lián)合處理，對(duì)照組不做處理正常培養(yǎng)細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況觀察 各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用70%冷乙醇固定，以1 μg/mL的碘化丙啶（PI）染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，70%冷乙醇固定細(xì)胞后，以1 μg/mL 的PI 染色液及10 μL RNase A（50×）混勻，放置于37 ℃環(huán)境下避光反應(yīng)30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。1.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化細(xì)胞并收集，將細(xì)胞懸液加入5μL Annexin V-FITC 避光孵育5 min 后，再加入10 μL PI，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平檢測(cè) 采用二氯熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）熒光探針染色。取培養(yǎng)48 h 的各組細(xì)胞，在37 ℃下加載H2DCFDA 30 min，收集細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞儀在530 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定DCF 熒光強(qiáng)度，以此代表細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shaprio-Wilk 法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子油乳對(duì)順鉑藥物敏感性的影響觀察結(jié)果 以0、2.44、9.77、78.12 μg/mL 鴉膽子油乳處理后的順鉑IC50分別為（1.98 ± 0.31）、（0.99 ±0.04）、（0.36 ± 0.02）、（0.10 ± 0.01）μg/mL，順鉑IC50隨著鴉膽子油乳處理濃度的增高而下降（P均＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況比較 對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)較好，細(xì)胞數(shù)量較多且形狀為正常生長(zhǎng)狀態(tài)；順鉑組及鴉膽子油乳組細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組均減少，可見(jiàn)少量碎片；鴉膽子油乳+順鉑組細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制較明顯，細(xì)胞數(shù)量最少，細(xì)胞形狀不規(guī)則且細(xì)胞碎片增多。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.3 各組細(xì)胞周期比較 G0/G1期細(xì)胞比例鴉膽子油乳+順鉑組＞順鉑組、鴉膽子油乳組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞周期比較（）

表1 各組細(xì)胞周期比較（）

注：與對(duì)照組G0/G1期比較，*P＜0.05；與順鉑組G0/G1期比較，#P＜0.05。

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2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組、鴉膽子油乳組、順鉑組、鴉膽子油乳+順鉑組細(xì)胞凋亡率分別為1.12% ± 0.27%、5.03% ± 0.65%、5.48% ±0.85%、10.15% ± 1.09%，細(xì)胞凋亡率鴉膽子油乳+順鉑組＞鴉膽子油乳組、順鉑組＞對(duì)照組（P均＜0.01）。

2.5 各組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平比較 對(duì)照組、鴉膽子油乳組、順鉑組、鴉膽子油乳+順鉑組DCF 熒光強(qiáng)度分別為11 012 ± 6 233、17 160 ± 8 087、14 306 ±7 380、19 758 ± 9 309，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平鴉膽子油乳+順鉑組＞鴉膽子油乳組、順鉑組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。

3 討論

我國(guó)為肺癌高發(fā)區(qū)，多數(shù)肺癌患者需要輔助化療，但目前化療藥不良反應(yīng)較多，且部分患者對(duì)治療藥物產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致患者治療效果不佳［6］。鴉膽子油乳是肺癌常用中成藥，多項(xiàng)研究表明鴉膽子油乳可減少順鉑化療的不良反應(yīng)，同時(shí)可提高順鉑的臨床療效［7-8］。本研究在肺癌A549 細(xì)胞株中觀察了鴉膽子油乳與順鉑的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鴉膽子油乳可呈濃度依賴(lài)性地降低順鉑的IC50，提示鴉膽子油乳在體外可以增強(qiáng)A549 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度。鴉膽子油乳是以鴉膽子為原料提取的脂肪油，其有效成分主要為不飽和脂肪酸類(lèi)成分［9］。有研究表明，不飽和脂肪酸能降低-SH 基含量，促使細(xì)胞膜變薄，從而增加抗癌藥物向腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲入的機(jī)會(huì)，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度升高，從而產(chǎn)生更好的療效［10］。這可能為鴉膽子油乳可增效順鉑抗腫瘤效應(yīng)的解釋之一，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

因?yàn)槁?lián)合用藥的目的在于降低單藥使用的濃度，減少單藥治療對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，并且利用藥物的協(xié)同作用增強(qiáng)其抗腫瘤活性，所以我們選擇1/2 IC50左右的藥物濃度聯(lián)合用藥進(jìn)行后續(xù)研究。有研究顯示，鴉膽子油乳能濃度依賴(lài)性地抑制A549 細(xì)胞G0/G1期比例，從而抑制腫瘤DNA 合成［11］。順鉑為細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物，本研究觀察了鴉膽子油乳與順鉑單用或聯(lián)用對(duì)肺癌A549細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果顯示鴉膽子油乳或順鉑單用時(shí)均能導(dǎo)致A549 細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增加，而兩藥聯(lián)用時(shí)G0/G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步增加。這提示鴉膽子油乳與順鉑單用均能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí)，這種阻滯效果更加明顯。

多項(xiàng)研究表明，順鉑能夠通過(guò)增加活性氧的產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［12-13］。有研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳及其單體成分去氫鴉膽子苦素B可濃度依賴(lài)性的抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖，也可濃度依賴(lài)性地增加細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，從而誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡［11，14］。本研究結(jié)果顯示，鴉膽子油乳或順鉑單用時(shí)均能使肺癌A549 細(xì)胞ROS 生成增加，細(xì)胞凋亡率升高；當(dāng)兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平更高，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加，提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用比單一用藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用更加顯著。

綜上所述，鴉膽子油乳能夠增加肺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性，其機(jī)制可能與阻滯腫瘤細(xì)胞于G0/G1期，增加活性氧的產(chǎn)生從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，鴉膽子油乳可能作為一種潛在的化療增敏劑應(yīng)用于臨床。本研究為體外細(xì)胞研究，而關(guān)于鴉膽子油乳是否能夠在體內(nèi)增加肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性仍需要進(jìn)一步的研究。