中藥單體作用于外泌體治療非小細(xì)胞肺癌的機(jī)制研究進(jìn)展

王宇陽，汪丫婷，蒿艷蓉，侯恩存

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530000；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院臨床腫瘤中心；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腫瘤科

肺癌在組織病理學(xué)分型上分為小細(xì)胞肺癌及非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC 占80%～85%。NSCLC 治療難度較大，預(yù)后不佳，近年來以外泌體為代表的細(xì)胞外囊泡作為新興熱點(diǎn)越來越多地應(yīng)用于NSCLC 的免疫治療中。細(xì)胞外囊泡可以被所有細(xì)胞釋放，具有內(nèi)在的生物相容性、細(xì)胞靶向性、低免疫原性，根據(jù)其生物發(fā)生行為和直徑可分為外泌體（直徑30～150 nm）、微囊泡（直徑100～1 000 nm）、凋亡小體（直徑100～5 000 nm）及癌小體（直徑1～10 μm）。既往研究表明，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)可以引導(dǎo)細(xì)胞外囊泡攝取到特定細(xì)胞，保護(hù)治療劑免受吞噬細(xì)胞識別，從而使治療劑在健康細(xì)胞及組織中的半衰期更長，不良反應(yīng)更少［1］。外泌體是目前研究最為廣泛的細(xì)胞外囊泡，具有較強(qiáng)的滲透性及保留率，并且具有獨(dú)特的免疫監(jiān)視特性［2］。外泌體的轉(zhuǎn)運(yùn)可以使部分生物信息分子激活細(xì)胞表面受體，協(xié)助外泌體內(nèi)容物進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的生理功能。中藥單體是單味中藥提取的有效活性成分，與中藥復(fù)方相比具有功效明確、藥理機(jī)制清晰、用量可控等優(yōu)勢，近年來一直活躍在腫瘤治療用藥行列中。中藥單體可作用于外泌體影響NSCLC 細(xì)胞的生物活性、代謝、遷移及藥物敏感性，其中紫杉醇（PTX）、桔梗皂苷、紫草素、黃芪多糖（APS）等以其自身特性在NSCLC 中被廣泛研究?，F(xiàn)就中藥單體作用于外泌體治療NSCLC的機(jī)制綜述如下。

1 PTX作用于外泌體治療NSCLC的機(jī)制

PTX是一種從裸子植物紅豆杉的樹皮分離提純的天然中藥單體，經(jīng)臨床驗(yàn)證可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)微管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤的作用［3］。PTX 和鉑類是治療NSCLC 的一線方案，雖然PTX 等化療藥物在NSCLC 的治療中取得了良好的療效，但PTX 的非特異性循環(huán)引起的全身毒性往往引起多器官損傷，其中包括強(qiáng)烈的消化道反應(yīng)、嚴(yán)重的肝腎毒性及明顯的骨髓抑制。目前，圍繞PTX 開展的外泌體免疫治療機(jī)制越來越多地被研究者發(fā)現(xiàn)。

1.1 搭載間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）衍生外泌體 MSC存在于幾乎所有人類組織的血管周圍生態(tài)位中，MSC 具有自我更新、再生和修復(fù)缺陷細(xì)胞的能力以及分化為骨骼、軟骨、血管和心肌細(xì)胞的可塑性。MSC 對疾病的治療作用是通過其旁分泌功能實(shí)現(xiàn)的，旁分泌過程中細(xì)胞分泌物通過直接擴(kuò)散作用于鄰近細(xì)胞。MSC 與腫瘤部位具有先天親和力，可以調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)的多種生物學(xué)過程，如轉(zhuǎn)移、血管生成、上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等［4］。MSC 衍生的外泌體顯示出高效的生物相容性和較低的內(nèi)在免疫原性，是腫瘤治療中有價(jià)值的藥物遞送載體［5］。MELZER等［6］研究表明，與單獨(dú)PTX 處理比較，搭載高濃度PTX 的MSC 衍生外泌體處理的NSCLC 細(xì)胞增殖受到更多抑制，提示搭載高濃度PTX 的MSC 衍生外泌體在體外顯示出更強(qiáng)的NSCLC 細(xì)胞殺傷效率。同時(shí)，MSC 外泌體中的PTX 濃度比PTX 物質(zhì)在體外產(chǎn)生同等細(xì)胞毒性的濃度低7.6 倍。在小鼠體內(nèi)使用MSC 產(chǎn)生的PTX 外泌體后，至少在肺、肝、脾和腎中觀察到PTX 遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移量減少了50%；且與使用單獨(dú)PTX 處理比較，達(dá)到相同效果的外泌體中的PTX 濃度顯著降低，提示MSC 外泌體具有特異性和更高效的腫瘤靶向特性。由上可見，搭載PTX 的MSC 衍生外泌體對NSCLC 細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞殺傷效率、高效的屏障通過率、強(qiáng)靶向性和高生物保有率。

1.2 搭載氨基乙基乙醇胺（AA）-聚乙二醇（PEG）矢量化外泌體 既往研究表明，包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種癌癥sigma 受體都存在過度表達(dá)，AA 是一種對sigma 受體具有高親和力的配體，已被用于靶向遞送阿霉素、蛋白質(zhì)和siRNA［7］。KIM 等［8］開發(fā)并優(yōu)化了PTX 負(fù)載外泌體的配方，該外泌體結(jié)合了AA及PEG載體片段以靶向肺癌細(xì)胞過表達(dá)的sigma受體。搭載PTX 的AA-PEG 矢量化外泌體AA-PEGexoPTX 具有高負(fù)載能力，在全身給藥后能夠在腫瘤細(xì)胞中積累，顯著增強(qiáng)治療效果，體現(xiàn)了其強(qiáng)靶向和高負(fù)載能力。

1.3 搭載Lip-CExo@PTX 嵌合抗原受體T 淋巴細(xì)胞（CAR-T）免疫療法，是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法，其中T 淋巴細(xì)胞通過基因工程來表達(dá)靶向腫瘤相關(guān)抗原的CAR 蛋白，細(xì)胞衍生的外泌體具有良好的抗腫瘤作用，因?yàn)槠淅^承了來自親代細(xì)胞的細(xì)胞毒性顆粒及靶向CAR蛋白［9］。載藥效率相對較低一直是外泌體作為藥物載體所面臨的一個(gè)困境，脂質(zhì)體作為一種常規(guī)的藥物載體，已廣泛應(yīng)用于化療藥物的遞送。與外泌體相比，脂質(zhì)體具有載藥效率高、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［10］。ZHU［11］等設(shè)計(jì)了混合納米囊泡，將CAR-T 衍生的外泌體CAR-TExos及肺靶向脂質(zhì)體Lip-CExo 共壓，用于PTX 遞送，即Lip-CExo@PTX。外泌體從表達(dá)單鏈可變片段的雙特異性MSLN/程序性死亡受體配體1（PD-L1）CART 培養(yǎng)基中分離出來，通過繼承脂質(zhì)體對肺部的靶向能力，Lip-CExo@PTX 在靜脈給藥后迅速積聚在肺部。積累的Lip-CExo@PTX 將PTX 和細(xì)胞毒性顆粒（顆粒酶B 及穿孔素）通過CAR-TExos遺傳的抗間皮素單鏈Fvs傳遞給間皮素陽性腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，PTX溶解細(xì)胞后誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡，吸引更多浸潤性淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織，并產(chǎn)生損傷相關(guān)分子標(biāo)志物（DAMP），DAMP 刺激巨噬細(xì)胞、DC 及NK細(xì)胞，導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞活化并啟動(dòng)免疫反應(yīng)［12］。更重要的是，Lip-CExo@PTX 表面的抗PD-L1-scFvs 被腫瘤的PD-L1 阻斷，減少了浸潤性T 淋巴細(xì)胞的衰竭，進(jìn)而增強(qiáng)了免疫應(yīng)答。所以Lip-CExo@PTX 具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞及增強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力，同時(shí)具有更強(qiáng)的腫瘤靶向性、良好的生物相容性及重塑腫瘤微環(huán)境等多種抗腫瘤特性。

1.4 PTX@CAR-Exos 霧化吸入 在靜脈給藥的基礎(chǔ)上，ZHENG 等［13］考慮到肝腎毒性等不良反應(yīng)，選擇設(shè)計(jì)霧化吸入式PTX@CAR-Exos。通過對CARExos 的主動(dòng)識別和吸入的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)，霧化吸入式PTX@CAR-Exos 的總體療效較靜脈給藥的PTX@CAR-Exos表現(xiàn)出更高的靶向作用及更低的不良反應(yīng)。

2 桔梗皂苷作用于外泌體治療NSCLC的機(jī)制

桔梗是一種藥食兩用的傳統(tǒng)中草藥，桔梗皂苷D（PD）是桔梗中的主要活性成分，其含有一個(gè)雙糖鏈齊墩果烷型苷元，屬于五環(huán)三萜皂苷家族［14］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，PD 能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分裂障礙及凋亡，并能抑制腫瘤細(xì)胞生長，降低集落形成［15］。在包括NSCLC 在內(nèi)的多種惡性腫瘤的治療中，程序性細(xì)胞死亡因子1（PD-1）/PD-L1抑制劑已被證實(shí)具有良好的抗腫瘤作用，但PD-1/PD-L1 靶點(diǎn)由一個(gè)疏水、大而扁平的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用而構(gòu)成，因此可干預(yù)藥物的設(shè)計(jì)難度較大。在這種情況下，可以特異性降低細(xì)胞膜上PD-L1來發(fā)揮免疫治療作用的天然產(chǎn)物引起了關(guān)注。HUANG 等［16］研究表明，由PD 處理的NSCLC 細(xì)胞PD-L1 蛋白通過外泌體途徑釋放于細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)PD-L1蛋白水平降低，同時(shí)活化了人白血病T 淋巴細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)了白細(xì)胞介素2（IL-2）的分泌，促進(jìn)了多種淋巴細(xì)胞的生存和增殖。且PD 通過外泌體途徑降低PD-L1 蛋白表達(dá)的同時(shí)，并不降低PD-L1 mRNA 水平，也不促進(jìn)PD-L1蛋白降解，更與溶血機(jī)制無關(guān)。BAILLY 等［17］關(guān)于PD 促進(jìn)PD-L1 細(xì)胞外釋放機(jī)制的研究得到以下兩個(gè)觀點(diǎn)：①金屬蛋白酶或藥物直接促進(jìn)膜表面蛋白脫落形成可溶性PD-L1；②PD 通過消耗脂筏中的膽固醇和誘導(dǎo)蛋白在脂筏中以重新分布的方式干擾膜筏的結(jié)構(gòu)域，阻止Toll 樣受體4（TLR4）轉(zhuǎn)位進(jìn)入脂筏，進(jìn)而限制了TLR4 等蛋白質(zhì)的募集。PD 的PDL1 釋放作用至少部分源于膽固醇依賴性膜過程，該過程導(dǎo)致PD-L1 和其他膜蛋白形成囊泡，PD 在調(diào)節(jié)膜筏蛋白分布過程中限制TLR4 等蛋白質(zhì)募集促使PD-L1 等蛋白質(zhì)釋放到膜囊泡中。由上可見，PD 能夠通過干擾膜筏結(jié)構(gòu)域促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞PD-L1 蛋白外泌體細(xì)胞外釋放，同時(shí)活化免疫系統(tǒng)，進(jìn)而治療NSCLC。

3 紫草素作用于外泌體治療NSCLC的機(jī)制

紫草是多年生草本植物，其有效成分是萘醌類化合物紫草素。ZHANG 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，紫草素在治療NSCLC 中具有抑制細(xì)胞增生、阻滯細(xì)胞周期及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用。異常代謝是腫瘤細(xì)胞最重要的特征，腫瘤細(xì)胞以及所有增殖細(xì)胞的代謝都會(huì)促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和吸收，以便于合成新生物質(zhì)（如脂質(zhì)、核苷酸和氨基酸）供細(xì)胞所需。缺氧是大多數(shù)惡性腫瘤中常見的現(xiàn)象，參與腫瘤耐藥及生長［19］。而腫瘤細(xì)胞在氧條件充足并可以支持線粒體氧化磷酸化的狀態(tài)下，也傾向于將葡萄糖糖酵解成乳酸。丙酮酸激酶同工酶M2（PKM2）作為介導(dǎo)糖酵解最關(guān)鍵的限速酶［20］，是Warburg 效應(yīng)的重要調(diào)控因子，可催化磷酸烯醇丙酮酸合成丙酮酸，促進(jìn)厭氧糖酵解，在腫瘤細(xì)胞中還可觸發(fā)獨(dú)特的有氧糖酵解進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，糖酵解終產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥密切相關(guān)。WANG 等［21］研究顯示，PKM2 在缺氧順鉑耐藥細(xì)胞分泌的外泌體中表達(dá)增加，缺氧誘導(dǎo)的外泌體PKM2 在體外及體內(nèi)將順鉑耐藥性傳遞給敏感的NSCLC 細(xì)胞，從而加劇了NSCLC 細(xì)胞的順鉑耐藥性。從機(jī)制上講：①缺氧誘導(dǎo)的外泌體PKM2可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的糖酵解產(chǎn)生還原代謝物，這可能中和順鉑誘導(dǎo)的活性氧生成增加。②缺氧誘導(dǎo)的外泌體PKM2 以PKM2-BCL2 依賴性方式抑制細(xì)胞凋亡。③缺氧誘導(dǎo)的外泌體PKM2 重編程癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞，以產(chǎn)生促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞增殖及順鉑耐藥的酸性微環(huán)境。既往研究顯示，紫草素對腫瘤特異性PKM2 有抑制作用，其中以烷烴素的抑制作用最強(qiáng)。DAI等［22］研究也發(fā)現(xiàn)紫草素是一種潛在的PKM2 抑制劑，能通過抑制NSCLC 細(xì)胞外泌體中PKM2的表達(dá)來抑制有氧糖酵解，進(jìn)而抑制NSCLC 細(xì)胞生長；也能通過抑制外泌體中PKM2 表達(dá)來減緩?fù)饷隗w耐藥性傳遞過程，進(jìn)而減緩NSCLC順鉑耐藥。

4 APS作用于外泌體治療NSCLC的機(jī)制

黃芪為多年生草本豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，主要活性成分為皂苷類、多糖類、氨基酸類和黃酮類等。APS 是黃芪多種多糖的統(tǒng)稱，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，通過靶向調(diào)控腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)，抑制腫瘤微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及逆轉(zhuǎn)化療耐藥性，從而達(dá)到抗腫瘤效果［23］。腫瘤微環(huán)境是腫瘤演化的關(guān)鍵因素，其由腫瘤細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫浸潤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、炎癥因子和低氧酸性環(huán)境構(gòu)成。炎癥反應(yīng)是機(jī)體應(yīng)對感染和組織損傷的適應(yīng)性反應(yīng)，以血管反應(yīng)、免疫細(xì)胞的募集及分子介質(zhì)的釋放為主要特征，而腫瘤相關(guān)性炎癥是癌癥的關(guān)鍵特征之一。脂多糖（LPS）是一種常見的內(nèi)毒素，TLR4 是Toll 樣模式識別受體一個(gè)亞型，LPS 是激活TLR4 常見的致炎因子。LPS 刺激TLR4 后，可以激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號通路，釋放大量炎癥因子，NFκB 信號通路可以調(diào)控PSMC3、PSMC5、PSMB4 等蛋白酶受體［24］。NAKANISHI 等［25］研究表明，TLR4 在慢性炎癥狀態(tài)下的NSCLC 中表達(dá)增強(qiáng)。DOMENIS研究表明［26］，TLR4 激活的腫瘤來源外泌體作用于T淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能，LPS 也可以改變層粘連蛋白分布，層粘連蛋白α1（LAMA1）及層粘連蛋白α5（LAMA5）是層粘連蛋白的2 個(gè)亞基，在細(xì)胞遷移黏附過程中起重要作用。纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）作為絲氨酸蛋白酶抑制劑，在多種不同的腫瘤中上調(diào)，并具有多種促腫瘤功能，包括支持細(xì)胞增殖和血管生成、抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)轉(zhuǎn)移等，腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中的組分均可以分泌PAI-1［27］。胡康蝶等［28］研究表明，LPS 引導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下NSCLC細(xì)胞外泌體釋放數(shù)目增多且多種蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，而經(jīng)APS 處理后，NSCLC 細(xì)胞外泌體釋放緩慢增加但蛋白結(jié)構(gòu)變化明顯減少，LAMA1、LAMA5等蛋白在LPS 處理的外泌體中表達(dá)下調(diào)，炎癥狀態(tài)下的PAI-1 在外泌體中表達(dá)上升；分析APS 作用后的外泌體差異蛋白后發(fā)現(xiàn)PSMC3、PSMB4、PSMC5等蛋白酶體關(guān)鍵蛋白表達(dá)均向?qū)φ战M回歸，提示APS 通過調(diào)節(jié)外泌體釋放來緩解腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞生長和遷徙。

綜上所述，PTX、桔梗皂苷、紫草素及APS 等中藥單體均能通過直接搭載或間接調(diào)節(jié)的方式作用于外泌體，進(jìn)而抑制NSCLC 細(xì)胞生長、遷移及耐藥性。本綜述仍存在以下問題：①某些機(jī)制方面存在一些爭議或尚未明確探知，缺乏細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)論證，有待進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)論證。②大部分?jǐn)?shù)據(jù)都來源于動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，缺少足夠的人體試驗(yàn)數(shù)據(jù)，有待轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)跟進(jìn)Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)，通過更多臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)論證以上觀點(diǎn)。