PM2.5 短期暴露誘導(dǎo)免疫耐受緩解實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的作用研究①

韓 冰 趙卓華 申玉霞 張 言 徐 妍 張 媛 （陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

近年大氣污染對(duì)人群健康的影響已成為全球重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。大氣污染物中的可吸入式懸浮細(xì)顆粒物是影響空氣質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，也是大氣污染影響健康的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［1］。不斷增多的流行病學(xué)證據(jù)表明，暴露于大氣中的PM2.5 會(huì)加重糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatic arthritis，RA）和多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）等自身免疫?。?-3］。PM2.5 暴露會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體炎癥因子失衡，引起炎癥反應(yīng)［4-5］。本團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)遺傳、細(xì)胞和藥理學(xué)等手段建立了長(zhǎng)期PM2.5 暴露通過(guò)TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化加劇神經(jīng)炎癥和髓鞘損傷的“PM2.5 暴露-細(xì)胞效應(yīng)-健康危害”全鏈條證據(jù)［6］。但隨著研究的深入，課題組發(fā)現(xiàn)PM2.5 的致病作用與其暴露時(shí)間窗、質(zhì)量濃度、粒徑、化學(xué)組分密切相關(guān)，具有異質(zhì)性，其致病機(jī)制的普適性和特殊性有待長(zhǎng)期觀察和系統(tǒng)評(píng)估。O'DRISCOLL 等［7］報(bào)道低劑量PM 暴露以依賴(lài)芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR）的方式抑制病理性T細(xì)胞反應(yīng)，從而減輕神經(jīng)炎癥發(fā)作，也證實(shí)了PM2.5 生理作用的復(fù)雜性。在研究PM2.5 與自身免疫病相關(guān)性的前期工作中，課題組發(fā)現(xiàn)了一個(gè)現(xiàn)象：與持續(xù)PM2.5暴露顯著加劇成年小鼠EAE 病理作用相反，短期PM2.5 暴露可有效延遲小鼠神經(jīng)炎癥發(fā)生和發(fā)展，顯著降低了臨床評(píng)分累積和峰值，推測(cè)可能與PM2.5 誘發(fā)機(jī)體免疫耐受相關(guān)，但這一“時(shí)間窗”效應(yīng)的作用機(jī)制尚不清楚，無(wú)法進(jìn)行針對(duì)性藥物干預(yù)。

本研究旨在探究短期PM2.5 暴露對(duì)小鼠EAE的影響，并探討其潛在作用機(jī)制，以期為預(yù)防和解決空氣污染造成的健康效應(yīng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)6～8周齡雌性C57BL/6品系小鼠購(gòu)自陜西師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，溫度（23±2） ℃，所有實(shí)驗(yàn)程序和方案均經(jīng)陜西師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：202312013），并按照批準(zhǔn)的機(jī)構(gòu)指南和法規(guī)進(jìn)行。MOG35-55多肽（Genescript，Piscataway）；百日咳毒素（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）；SRM1648A（Sigma）；O.C.T.包埋劑（Tissue-Tek， Sakura Finetek）；Fluoromyelin（Abcam，Cambridge）；CD45、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD80、CD86、IL-17、IFN-γ 和Foxp3 抗體（BD Biosciences，San Jose，CA）。

1.2 方法

1.2.1 EAE 模型制備 PBS 溶解MOG35-55多肽，與等體積完全弗氏佐劑（含5 mg/ml 結(jié)核分枝桿菌）混合，玻璃注射器推打至油包水狀的白色抗原乳劑。在小鼠背部?jī)蓚€(gè)位點(diǎn)皮下注射免疫，免疫當(dāng)天和2 d后分別腹腔注射百日咳稀釋液（200 ng/只）。免疫完成后每天對(duì)小鼠進(jìn)行EAE 評(píng)分，測(cè)量體質(zhì)量變化并記錄。

1.2.2 PM2.5 的來(lái)源及制備 大氣污染物組成復(fù)雜，單一成分暴露不能較好地模擬多種污染物共存的實(shí)際大氣污染環(huán)境對(duì)人群健康的影響，因此本研究選擇大氣細(xì)顆粒物混合物進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。但由于PM2.5 的毒性與其來(lái)源和組成密切相關(guān)，為保證實(shí)驗(yàn)的代表性和重復(fù)性，本研究選擇NIST標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)來(lái)源的商品化城市大氣微顆粒物SRM1648A進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該標(biāo)準(zhǔn)參考物主要成分（多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯同類(lèi)物、氯化農(nóng)藥和大氣顆粒物質(zhì)等）已由NIST 標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)提供了定性定量分析報(bào)告。在無(wú)菌PBS中超聲處理15 min，制備SRM1648A分散混懸液。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 PM2.5 暴露組：造模前3 d至造模后2 d，每天接受1次PM2.5［5 mg/（kg·d）］鼻咽吸入。PBS 組：同周齡小鼠接受相同時(shí)間PBS鼻咽吸入。

1.2.4 組織染色及病理評(píng)估 取造模第30 天小鼠，心臟灌注固定，取脊髓腰骶膨脹，室溫下立即用4%多聚甲醛固定24 h。其他組織用30%蔗糖溶液4 ℃脫水48 h 后用O.C.T.包埋劑包埋制作冰凍切片，使用Fluoromyelin 進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色，髓鞘密度定量：手動(dòng)選擇總白質(zhì)區(qū)域，Image-Pro Plus 軟件計(jì)算脫髓鞘面積（%）。HE 染色評(píng)估炎癥，LFB染色評(píng)估脫髓鞘。雙盲法對(duì)切片進(jìn)行炎癥評(píng)估和評(píng)分：0 分，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；1 分，脊髓實(shí)質(zhì)輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；2分，脊髓實(shí)質(zhì)中度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；3分，脊髓實(shí)質(zhì)重度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。髓鞘脫失評(píng)分：0 分，無(wú)髓鞘脫失；1分，1～3個(gè)髓鞘脫失；2分，大范圍髓鞘脫失；3分，大范圍髓鞘脫失且累及20%白質(zhì)區(qū)域。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 分離小鼠脾細(xì)胞和CNS 單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cell，MNC），將細(xì)胞與CD45、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD80 和CD86 抗體在冰上孵育30 min，進(jìn)行表面標(biāo)記染色。表面染色、固定、透化，IL-17、IFN-γ 或Foxp3 抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示為±s，通過(guò)方差分析（ANOVA）和t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。所有統(tǒng)計(jì)分析均以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5 短期暴露顯著延遲EAE 發(fā)生發(fā)展 與PBS 對(duì)照組相比，PM2.5 短期暴露可延緩EAE 發(fā)生并顯著降低疾病嚴(yán)重程度（P＜0.01，圖1A、B），但兩組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1C）。HE染色及LFB染色結(jié)果顯示，PM2.5短期暴露組小鼠炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘程度顯著低于PBS對(duì)照組（P＜0.05）。Fluoromyelin 免疫染色結(jié)果顯示，PM2.5短期暴露組EAE 小鼠胼胝體脫髓鞘面積明顯低于PBS 對(duì)照組（P＜0.001，圖1D、E）。提示短期PM2.5暴露顯著抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失，PM2.5 短期暴露可能通過(guò)抑制CNS 炎癥減少脫髓鞘損傷，進(jìn)而抑制EAE發(fā)展。

圖1 PM2.5短期暴露顯著延遲EAE發(fā)生發(fā)展Fig.1 Short-term exposure to PM2.5 significantly delays onset and development of EAE

2.2 PM2.5 短期暴露抑制EAE 小鼠CNS 炎癥 與對(duì)照組相比，PM2.5 短期暴露小鼠CNS 中CD45+白細(xì)胞、激活的巨噬細(xì)胞（CD11b+TNF-α+）（P＜0.01）和活化的樹(shù)突狀細(xì)胞（CD11c+CD80+和CD11c+CD86+）（P＜0.001）比例和數(shù)量明顯降低（圖2），CD4+Foxp3+（P＜0.001）Treg和具有致病性的CD4+IL-17+（P＜0.001）Th17 細(xì)胞被顯著抑制，致病性的CD4+IFN-γ+（P＞0.05）Th1 比例也有所下降（圖3），提示短期PM2.5暴露通過(guò)減少CNS 炎癥細(xì)胞數(shù)量從而抑制神經(jīng)炎癥緩解疾病發(fā)展。

圖2 PM2.5短期暴露抑制EAE小鼠CNS炎癥Fig.2 Short-term exposure to PM2.5 suppresses CNS inflammation in EAE mice

圖3 PM2.5短期暴露抑制致病性Th17細(xì)胞Fig.3 Short-term exposure to PM2.5 inhibits pathogenic Th17 cells

2.3PM2.5 短期暴露抑制EAE 小鼠外周炎癥 免疫后第30天收集EAE小鼠脾細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)PM2.5 短期暴露對(duì)小鼠外周炎癥細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PM2.5 短期暴露組小鼠脾臟CD4+T 細(xì)胞（P＞0.05）和Th1（CD4+IFN-γ+）細(xì)胞（P＞0.05）比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Th17（CD4+IL-17+）細(xì)胞比例（P＜0.000 1）顯著降低（圖4），表明短期PM2.5暴露抑制EAE小鼠外周炎癥反應(yīng)。

圖4 PM2.5短期暴露抑制EAE小鼠外周炎癥Fig.4 Short-term exposure to PM2.5 suppresses peripheral inflammation in EAE mice

3 討論

隨著工業(yè)化進(jìn)程飛速發(fā)展，全球環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，自身免疫性疾病發(fā)病率顯著上升，城市空氣中懸浮的大量高濃度微顆粒物是霧霾致病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［8］。多項(xiàng)流行病學(xué)研究共同指出空氣污染程度與MS 復(fù)發(fā)和惡化顯著相關(guān)［9-10］，但PM2.5 對(duì)疾病發(fā)生作用的復(fù)雜性和異質(zhì)性有待深入研究。PM2.5 暴露與自身免疫病相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)：與高濃度持續(xù)PM2.5 暴露顯著加劇成年小鼠神經(jīng)炎癥的病理作用相反，短期PM2.5 暴露可有效延遲小鼠神經(jīng)炎癥發(fā)生發(fā)展，顯著降低了臨床評(píng)分累積和峰值。與PBS 對(duì)照組相比，接受短期鼻腔滴注PM2.5的小鼠CNS 中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘病灶顯著減少，致病性Th1 及Th17 細(xì)胞分化和促炎細(xì)胞生成被抑制，耐受性Treg 募集增加，提示短期PM2.5 暴露可能誘發(fā)機(jī)體免疫耐受。研究報(bào)道感染性病原體可通過(guò)機(jī)體免疫耐受抑制過(guò)敏和自身免疫性疾?。?1-12］。滅活病毒疫苗就是采用少量滅活的完整而無(wú)致病性的病毒顆粒引起生物系統(tǒng)免疫，從而產(chǎn)生免疫記憶預(yù)防相關(guān)疾病。食物中少量病原體微生物可誘發(fā)人體免疫應(yīng)答而不致病，反而增強(qiáng)人體免疫力。研究表明細(xì)菌內(nèi)毒素LPS 可通過(guò)結(jié)合TLR4激活下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 等信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致一系列促炎細(xì)胞因子表達(dá)升高，出現(xiàn)炎癥損傷［13］；而ELLESTAD 等［14］發(fā)現(xiàn)幼鼠出生后3 d 和5 d 進(jìn)行短期LPS 暴露，可顯著降低成年大鼠EAE 發(fā)病率和嚴(yán)重程度。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PM2.5 在激活炎癥細(xì)胞方面具有類(lèi)LPS 作用，通過(guò)TLR-4/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活加劇神經(jīng)炎癥和脫髓鞘損傷，提示TLR-4/NF-κB 信號(hào)軸可能是PM2.5發(fā)揮作用的主要通路。表明人體免疫系統(tǒng)在少量病原體刺激下產(chǎn)生免疫應(yīng)答而產(chǎn)生“訓(xùn)練”效果，對(duì)該種病原體產(chǎn)生免疫耐受，與課題組觀察到的PM2.5暴露與疾病發(fā)展“時(shí)間窗”效應(yīng)相符。

盡管臨床上使用短期PM2.5 暴露實(shí)現(xiàn)疾病治療不可行，但闡明這一病理現(xiàn)象的作用機(jī)制有助于更深入了解疾病發(fā)生機(jī)制，從而尋找有效治療靶點(diǎn)和進(jìn)行相應(yīng)藥物干預(yù)。本研究顯示，PM2.5 短期暴露抑制了EAE 發(fā)生發(fā)展，并顯著降低了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失，短期暴露于PM2.5 的EAE 小鼠CD45+白細(xì)胞絕對(duì)數(shù)顯著減少，對(duì)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及致病性Th17 細(xì)胞均有抑制作用。提示短期PM2.5 暴露通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受而緩解疾病。

綜上，本研究觀察到短期PM2.5 暴露可顯著抑制EAE 進(jìn)程、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失，PM2.5 通過(guò)減少CNS 炎癥因子并抑制EAE 小鼠外周炎癥從而阻斷脫髓鞘，進(jìn)而抑制EAE 發(fā)展。后續(xù)研究將聚焦于探索短期PM2.5 暴露誘導(dǎo)免疫耐受這一“時(shí)間窗”效應(yīng)的具體作用機(jī)制，為闡明MS 和其他自身免疫病的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。