胞內(nèi)寄生菌對巨噬細胞免疫逃逸的研究進展①

田 麗 吳顯偉 周 偉 張惠勇 張少言 鹿振輝 （上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200030）

病原微生物侵襲機體后，機體內(nèi)固有免疫系統(tǒng)首先啟動。巨噬細胞通過定位于細胞表面、囊泡或細胞質(zhì)基質(zhì)的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識別病原微生物感染，通過吞噬體的內(nèi)吞作用迅速吞噬病原微生物，再與溶酶體融合形成吞噬溶酶體。吞噬溶酶體具有酸性、氧化性等利于降解微生物的管腔，含有多種抗菌分子，如蛋白酶、活性氧（reactive oxide species，ROS）、活性氮等，具有強大的殺傷微生物能力。而很多病原微生物發(fā)展出逃避巨噬細胞消化、消除的能力，從而在宿主細胞內(nèi)長期存活。

細胞內(nèi)病原體通常分為兼性胞內(nèi)菌和專性胞內(nèi)菌兩類［1］。兼性胞內(nèi)菌既可在宿主細胞內(nèi)繁殖、存活，又可在體外無生命的培養(yǎng)基中生長；專性胞內(nèi)菌僅能在宿主活細胞內(nèi)生長繁殖［2］。根據(jù)病原體逃逸生存環(huán)境又可分為液泡病原體和胞質(zhì)病原體，液泡病原體利用宿主膜運輸在液泡中構(gòu)建特定生態(tài)位，胞質(zhì)病原體是從液泡逃逸至細胞質(zhì)基質(zhì)的病原體，在細胞質(zhì)基質(zhì)增殖并可擴散到鄰近細胞［3］。這些病原體具有一系列毒力因子以及復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子網(wǎng)絡(luò)，通過在吞噬細胞內(nèi)復(fù)制或分泌效應(yīng)子改變宿主細胞，創(chuàng)造適宜自身增殖的環(huán)境，逃避宿主免疫應(yīng)答和抗生素攻擊。本文對胞內(nèi)感染常見的細菌和真菌對巨噬細胞的免疫逃逸策略進行簡要概述（表1）。

表1 胞內(nèi)感染常見的細菌和真菌對巨噬細胞的免疫逃逸策略Tab.1 Immune escape strategies of common intracellularly infected bacteria and fungi against macrophages

1 細菌免疫逃逸

細胞內(nèi)細菌通常是臨床相關(guān)病原體，幾乎感染宿主機體發(fā)現(xiàn)的每種細胞類型，尤其是巨噬細胞。巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的哨兵，第一時間將入侵的細菌吞噬并清除，而結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Listeria）、沙門菌（Salmonella）、衣原體（Chlamydia）和立克次體（Rickettsia）等細菌通過多種策略逃避宿主巨噬細胞吞噬，在宿主細胞中復(fù)制和長期存活，引起感染性疾病。

1.1MTBMTB通過操縱宿主效應(yīng)機制，包括抑制吞噬體成熟、吞噬體和溶酶體融合、自噬和氧化代謝途徑等建立持久感染。MTB具有含甲基支鏈脂肪酸的復(fù)雜細胞膜，可保護自身免受宿主酶傷害［4］。此外MTB的結(jié)構(gòu)特征及其菌絲體組成抑制巨噬細胞吞噬體成熟和酸化［5］。MTB還通過運輸毒素脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）以及依賴鈣調(diào)素的PI3P抑制吞噬體和溶酶體融合過程［6］。Mycothiol是MTB的一種主要硫醇，具有抗氧化活性，可幫助MTB抑制宿主細胞內(nèi)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生免疫逃逸，延長MTB在巨噬細胞中的存活時間。而一些MTB菌株在巨噬細胞的內(nèi)吞泡內(nèi)無法適應(yīng)存活時，這些MTB可通過激活磷脂在細胞質(zhì)中創(chuàng)造有利生存條件［7］。非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）也被證明可調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，包括防止吞噬體酸化和成熟或從吞噬體逃逸到營養(yǎng)豐富的細胞質(zhì)基質(zhì)，從而在宿主細胞內(nèi)長期存活［8］。

1.2S.aureusS.aureus是一種革蘭陽性機會致病菌，輕者導(dǎo)致皮膚感染，嚴重者可造成危及生命的菌血癥和腦膜炎。S.aureus是皮膚和軟組織感染以及院內(nèi)和社區(qū)獲得性肺炎最常見的病原體之一［9］。巨噬細胞可吞噬多數(shù)入侵的S.aureus，并采用多種殺傷機制殺死S.aureus。但一些S.aureus可在中性粒細胞和巨噬細胞吞噬后存活，還可逃避和操縱巨噬細胞，其兼性細胞內(nèi)寄生的特點和表面生物膜保護其免受宿主免疫應(yīng)答和抗生素作用，甚至可在多種非吞噬細胞，如上皮細胞、成纖維細胞、成骨細胞和肥大細胞等細胞內(nèi)長期存活［10-11］。一旦進入巨噬細胞，S.aureus就會利用宿主細胞新陳代謝調(diào)節(jié)細胞代謝通量，消耗宿主細胞葡萄糖和氨基酸確保其自身增殖。S.aureus還可在宿主細胞吞噬體或細胞質(zhì)內(nèi)自由復(fù)制，逃脫專業(yè)和非專業(yè)吞噬細胞的吞噬小體，破壞自噬，誘導(dǎo)細胞凋亡和膿毒壞死等死亡機制，甚至可誘導(dǎo)吞噬細胞抗凋亡程序。MSCRAMMs（識別黏附基質(zhì)分子的微生物表面成分）的蛋白質(zhì)黏附素使S.aureus黏附于宿主細胞產(chǎn)生的各種細胞外基質(zhì)蛋白或直接黏附于宿主細胞［12］。

1.3ListeriaListeria是革蘭陽性菌，是一種機會性食源性感染病原體，可引起嚴重的局部和全身感染［13］。Listeria是一種典型的胞質(zhì)內(nèi)病原體，可侵襲巨噬細胞和非吞噬細胞，如胃腸道上皮細胞［14］?？赏ㄟ^入侵腸道上皮M 細胞穿透宿主，被宿主巨噬細胞捕獲。Listeria主要依賴于典型的Sec 易位系統(tǒng)分泌毒力因子，其分泌的毒力因子溶血素幫助Listeria逃離吞噬體［15-16］。轉(zhuǎn)錄因子PrfA是Listeria毒力的主要調(diào)節(jié)劑，可誘導(dǎo)伴侶PrsA2 和伴侶/蛋白酶HtrA 分泌。兩者的蛋白折疊和穩(wěn)定功能可促進Listeria在巨噬細胞感染期間適應(yīng)和存活［9］。Listeria還可利用肌動蛋白裝配誘導(dǎo)蛋白ActA 誘導(dǎo)細菌表面肌動蛋白聚合驅(qū)動細菌，并在成孔毒素ListeriolysinO（LLO）與磷脂酶C（PI-PLC和PC-PLC）幫助下逃離吞噬細胞液泡，逃逸至胞質(zhì)內(nèi)存活。LLO 還導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，阻止晚期核內(nèi)體和/或溶酶體與含病原體液泡融合［3］。CadA是一種具有鎘抗性的外排泵，CadC是CadA 的序列特異性、DNA 結(jié)合和鎘依賴性調(diào)節(jié)劑。Listeria可通過CadC調(diào)節(jié)鎘外流、微調(diào)脂蛋白定位逃避宿主免疫應(yīng)答并促進感染［17］。

1.4SalmonellaSalmonella是桿狀兼性厭氧菌，是一種最常見的食源性病原體。Salmonella可通過巨噬細胞引發(fā)自身吞噬作用并被包裹在含Salmonella的液泡SCV 中，逃避細胞外各種免疫應(yīng)答［18-19］。SPI是沙門氏菌編碼毒力相關(guān)基因特定區(qū)域，其編碼效應(yīng)子在Salmonella侵入巨噬細胞和上皮細胞中起重要作用，可幫助Salmonella感染期間的膜侵襲，還可促發(fā)SCV，降低溶酶體酶活性，干擾內(nèi)體到溶酶體的運輸，阻止兩者融合。SPI 的編碼效應(yīng)子還可掩蓋細菌表面抗原，導(dǎo)致吞噬細胞表面PRRs 無法識別。此外還可抑制固有免疫，減少促炎介質(zhì)產(chǎn)生，導(dǎo)致吞噬細胞清菌效率低下［19］。致病性Salmonella菌株表達2 個Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SSs），包括T3SS1 和T3SS2。研究表明，細菌內(nèi)化初期T3SS2表達隨時間增加，與SCV 成熟一致［20］。T3SS2 易位的效應(yīng)蛋白將局部黏著斑激酶（FAK）和蛋白激酶B（Akt）招募到SCV 表面，Akt 活化后可通過磷酸化mTORC1 抑制巨噬細胞自噬［21］。

1.5ChlamydiaChlamydia是一種革蘭陰性專性胞內(nèi)菌，可引起人類和動物嚴重感染［22］。其中曲霉衣原體是一種性傳播細菌感染的病原體，還是導(dǎo)致致盲性沙眼的病原體［23］；而肺炎衣原體經(jīng)常引起社區(qū)獲得性肺炎。Chlamydia以細菌基本體（element basic，EB）形式附著并侵入宿主細胞中［24］。新生的吞噬細胞區(qū)室被衣原體衍生的蛋白迅速修飾，產(chǎn)生稱為包涵體的寄生液泡，從而避免與溶酶體融合，使Chlamydia在感染早期就從宿主巨噬細胞的內(nèi)吞途徑逃離。EB進入細胞后，將Ⅲ型分泌效應(yīng)器易位肌動蛋白募集磷酸蛋白（translocation actin recruits phosphoproteins，TARP）轉(zhuǎn)移到宿主細胞膜，利用宿主細胞骨架發(fā)揮其優(yōu)勢，促進包涵體生成，并助其從細胞膜擠出，使之從宿主細胞中排出［25-27］。包涵體中，EB 迅速分化成網(wǎng)狀體（reticulate body，RB）進行復(fù)制，通過細胞裂解和/或擠出釋放最終與宿主巨噬細胞分離，引發(fā)新一輪感染［28］。胞內(nèi)Chlamydia還可通過干擾宿主細胞信號阻斷固有免疫信號傳導(dǎo)抑制細胞凋亡。

1.6RickettsiaRickettsia是革蘭陰性專性胞內(nèi)細菌，可入侵各種真核生物。Rickettsia同Listeria、志賀菌（Shigella）、伯克霍爾德菌（Burkholderia）和弗朗西斯菌（Francisella）等細菌一樣，通過巨噬細胞吞噬內(nèi)在化，隨后病原體逃逸到宿主細胞質(zhì)存活［29］。作為一種專性細胞內(nèi)細菌，Rickettsia需要黏附并入侵靶細胞從而獲得營養(yǎng)豐富的細胞質(zhì)生態(tài)位，促進自身在宿主細胞內(nèi)增殖、復(fù)制和傳播，從而在宿主中成功建立感染。Rickettsia通過一種“拉鏈狀”誘導(dǎo)內(nèi)吞過程進入哺乳動物宿主細胞，其入侵宿主需要特異性受體配體參與，入侵的關(guān)鍵分子為表面細胞抗原（Scas）［30］。入侵還需宿主特異性信號級聯(lián)劫持，最終導(dǎo)致宿主肌動蛋白細胞骨架和膜動力學(xué)重排，幫助細菌入侵。內(nèi)吞后不久，Rickettsia利用其分泌性膜溶解效應(yīng)物，包括溶血素和磷脂酶，破壞吞噬體膜，并逃逸到宿主細胞質(zhì)避免吞噬體-溶酶體融合，在宿主細胞質(zhì)中完成生長和復(fù)制，隨后直接進入鄰近細胞進行新一輪感染［31］。

2 真菌免疫逃逸

全球真菌有350 萬～510 萬種，其中約600 多種真菌可感染人類并引起疾病［32-33］。多數(shù)人一生中都會遭遇淺表真菌感染，如感染指甲的皮膚癬菌以及感染皮膚或黏膜的念珠菌屬。每年也有數(shù)百萬人會感染危及生命的侵襲性真菌，具有易誤診、治療周期長和病死率高等特點。侵襲性真菌感染大多由4 種真菌屬引起：煙曲霉（Aspergillus fumigatu，A.fumigatu）、白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）、隱球菌（Cryptococcus）和耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovrcii）［34］。這些侵襲性真菌感染人體后能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)識別和清除，在宿主體內(nèi)散播并造成持續(xù)感染。

2.1A.fumigatuA.fumigatu是一種普遍存在的腐生菌，經(jīng)呼吸道吸入定植于肺部，可導(dǎo)致免疫缺陷個體致命的肺部感染，90%以上侵襲性曲霉病由A.fumigatu導(dǎo)致。A.fumigatu分生孢子細胞壁表面主要由疏水棒狀蛋白和二羥基萘（DHN）-黑色素構(gòu)成［35］。棒狀蛋白層和黑色素均被認為是免疫惰性分子，可掩蓋病原體相關(guān)分子模式，避免自身被吞噬細胞表面PRRs 識別［36-37］。黑色素還可抑制吞噬細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生，保護其免受宿主細胞內(nèi)氧化應(yīng)激干擾，并抑制吞噬體酸化以及吞噬體溶酶體融合，從而抑制吞噬細胞吞噬作用，減弱宿主固有免疫效應(yīng)［38］。LC3 相 關(guān) 自 噬（C3-associated phagocytosis，LAP）在吞噬細胞殺傷A.fumigatu的免疫效應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其發(fā)揮作用需要NADPH 氧化酶激活。黑色素可通過去除吞噬體中的1 個亞單位p22phox而抑制NADPH 氧化酶依賴性LAP 激活，從而阻斷LAP 通路，抑制NADPH 氧化酶激活［39］。Ca2+和CaM是自噬關(guān)鍵調(diào)控因子，Ca2+-CaM信號可調(diào)節(jié)LAP通路。黑色素還可將Ca2+在吞噬小體內(nèi)隔離，阻斷CaM 募集和LAP通路，抑制巨噬細胞自噬效應(yīng)發(fā)生［40］。

2.2C.albicans念珠菌屬是最常見的人類病原真菌。C.albicans是人類侵襲性病原真菌，可引起免疫功能低下患者黏膜感染以及致命的散播性感染，50%以上念珠菌屬感染由C.albicans導(dǎo)致。C.albicans酵母-菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)換能力是其逃避巨噬細胞等固有免疫細胞吞噬所必需的［41］。C.albicans可通過劫持典型的炎癥小體-GSDMD 軸介導(dǎo)的焦亡、表達念珠菌素Ece1 進行細胞打孔以及形成菌絲等策略促進自身逃離巨噬細胞［42］。C.albicans還可抑制胞內(nèi)ROS 生成和超氧化物歧化酶等解毒酶產(chǎn)生進而抵消巨噬細胞內(nèi)氧化/亞硝化反應(yīng)［43-44］。此外，C.albicans可通過誘導(dǎo)宿主精氨酸酶活性阻斷巨噬細胞中NO產(chǎn)生，逃避巨噬細胞免疫清除［45-46］。

2.3Cryptococcus隱球菌屬新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）和格特隱球菌（Cryptococcus gattii）是擔(dān)子菌門最重要的兩個侵襲性病原真菌，在環(huán)境中廣泛存在。Cryptococcus孢子或干燥細胞可經(jīng)呼吸道被人體吸入，在健康人群中引起肺部感染，并散播至腦，導(dǎo)致危及生命的隱球菌性腦膜炎。Cryptococcus可通過形成體積巨大的泰坦細胞或通過真菌表面莢膜抗吞噬細胞特性避免巨噬細胞攝?。?7］。莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPs）被認為是Cryptococcus neoformans和Cryptococcus gattii的重要毒力因子，通過覆蓋真菌表面特定病原體相關(guān)模式分子（pattern recognition recepters，PAMPs）避免被抗原提呈細胞識別實現(xiàn)免疫逃避［48］。Cryptococcus還可分泌漆酶和黑色素中和吞噬細胞內(nèi)ROS 和pH值，使其適應(yīng)吞噬細胞內(nèi)惡劣的環(huán)境，幫助其自身在宿主細胞中定植，并在吞噬細胞中自由復(fù)制［49］。Cryptococcus還可通過非溶性胞吐作用促進在宿主中的存活，將其液泡與細胞膜融合，逃避巨噬細胞溶酶體降解［50］。

2.4Pneumocystis jirovrcii肺孢子菌（Pneumocystis）是一種機會性真菌病原體，定植于人類肺部的為Pneumocystis jirovrcii，可在免疫功能低下患者中引起危及生命的肺孢子菌肺炎（Pneumocystispneumonia，PCP），發(fā)病率逐年上升。宿主PRRs 的C 型凝集素受體（C-type lectin receptor，CLRs）中的葡聚糖受體Dectin-1 可識別Pneumocystis細胞表面β-葡聚糖，在固有免疫信號傳導(dǎo)和真菌清除中發(fā)揮重要作用［51］。Pneumocystis細胞表面的主要糖蛋白（major surface glycoprotein，MSG）可降低Dectin-1 表達，抑制CLR對其的識別，逃避巨噬細胞吞噬［52］。研究發(fā)現(xiàn)Pneumocystis細胞表面缺乏幾丁質(zhì)、外鏈N-甘露聚糖，而表面β-葡聚糖常被Msg和其他表面蛋白掩蓋。幾丁質(zhì)、外鏈N-甘露聚糖以及β-葡聚糖都是已知的PAMPs，其缺失或掩蓋有助于逃避或延遲固有免疫系統(tǒng)對Pneumocystis的識別［53］。

3 總結(jié)

綜上，巨噬細胞作為主要的免疫哨兵細胞，在識別和吞噬入侵病原體、發(fā)揮免疫效應(yīng)方面具有重要作用。細胞內(nèi)病原體被巨噬細胞吞噬后，進化出多種防御機制，躲避宿主免疫攻擊，并在宿主細胞內(nèi)長期存活。其中細胞內(nèi)細菌主要通過抑制吞噬體成熟、吞噬溶酶體融合、自噬及氧化反應(yīng)，還可重排或利用細胞骨架促進其對巨噬細胞的逃逸；細胞內(nèi)真菌的巨噬細胞免疫逃逸策略主要為通過細胞壁表面成分掩蓋PAMPs，避免被PRRs 識別躲避巨噬細胞吞噬。還可通過毒力因子和改變自身形態(tài)或大小增強在宿主細胞的存活能力。目前雖已明確以上幾種常見胞內(nèi)寄生菌的免疫逃逸機制，但對其認識仍處于探索階段，有待進一步研究。