蒲公英甾醇對(duì)2，4-二硝基氯苯誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎小鼠模型的改善作用①

馬天怡 毛 敏 吳秋月 趙 益 樸英實(shí) 金桂花 任香善

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室腫瘤研究中心，延吉 133002）

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見(jiàn)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，通常發(fā)生在兒童時(shí)期，臨床表現(xiàn)包括皮膚干燥、發(fā)作性急性濕疹、滲出性瘙癢性皮損［1］。AD 具有廣泛的癥狀和體征，會(huì)限制日?；顒?dòng)能力，造成較重的心理負(fù)擔(dān)［2］。AD 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，且尚未明確，不少學(xué)者認(rèn)為AD 的發(fā)病受遺傳和環(huán)境因素的雙重影響，與遺傳疾病、表皮屏障缺陷、免疫反應(yīng)改變以及皮膚微生物平衡破壞關(guān)系密切，其中以Th1/Th2 失衡最為關(guān)鍵［3-5］。AD 尚無(wú)有效的治愈方式，相關(guān)癥狀只能被緩解，避免疾病反復(fù)發(fā)作，其主要治療藥物為糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥物、抗生素、免疫抑制劑等，但這些藥物均伴隨一些不良反應(yīng)，如肝功能損傷、胃腸道不適、白細(xì)胞和血小板減少等［6-7］。為了更好地改善AD 患者的疾病狀況，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始研究中草藥有效成分對(duì)AD 的治療效果，以期找到治療效果好、副作用小、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的AD治療藥物［8-11］。

蒲公英（taraxasterol，Tar）作為一種傳統(tǒng)中草藥，有清熱解毒、利尿通淋、清肝明目的作用，臨床上常用于癰、腫等的治療。蒲公英甾醇是蒲公英中具有抗炎作用的重要活性成分之一［12-14］。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均有證實(shí)蒲公英甾醇通過(guò)降低炎癥因子TNF-α、IL-4、IL-6 等的水平治療結(jié)腸炎、肝損傷、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎損傷等相關(guān)疾?。?5-20］，但尚未見(jiàn)蒲公英甾醇治療AD 的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬初步探討蒲公英有效成分蒲公英甾醇對(duì)2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB）誘導(dǎo)的AD 小鼠模型的治療作用及可能的分子機(jī)制，為蒲公英甾醇的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以期拓寬AD 的治療途徑，尋求治療效果更好、副作用更少、更經(jīng)濟(jì)便利的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物 46 只6～8 周 齡SPF 級(jí) 雄 性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。動(dòng)物房溫度為（24±1） ℃，濕度為（45±10）%，由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。

1.1.2 藥物與試劑 DNCB（Sigma 公司，D1529）與基質(zhì)（丙酮∶橄欖油=1∶3）配成的0.5%、0.25%的DNCB 溶液常溫避光保存；潑尼松龍（SP8730）、羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl，CMC，C8621）（索萊寶生物科技有限公司）；蒲公英甾醇（純度99.9%，成都瑞芬思生物科技有限公司，P-002）；氯化鈉注射液（南華干牧，獸藥字270071460）；小鼠TNF-α、IL-4、IL-6 ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml002095、ml1002049、ml1002093）；HE 染色劑（北京中杉金橋公司，ZLI-9610）；重組Anti-CD4 抗體（Abcam，ab183685）；兔二步法試劑盒（PV-9000）、PBS 緩沖液（ZLI-9063）、免疫組化抗原修復(fù)緩沖液（ZLI-9067）、DAB 顯色試劑盒（ZLI-9018）均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，將46 只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、藥物毒性組（該組不做AD 建模，只給予蒲公英甾醇檢驗(yàn)藥物毒性）、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低濃度蒲公英甾醇組、高濃度蒲公英甾醇組。前兩組每組3 只，后四組每組10只。

采用JIN 等［21］和張茜等［22］DNCB 半抗原反復(fù)刺激的方法建立小鼠AD 模型。具體建模方法如下：于實(shí)驗(yàn)前1 d（Day 0）用電推剪進(jìn)行小鼠腹部剃毛，露 出 約2 cm×2 cm 大 小 的 皮 膚。實(shí) 驗(yàn) 第1 天 將0.5%DNCB涂于小鼠左耳（20 μl）及腹部（100 μl）剃毛處皮膚進(jìn)行初次致敏，第5、7、9、11、13 天改用0.25%DNCB 涂于小鼠左耳（20 μl）及背部（100 μl）剃毛處皮膚進(jìn)行激發(fā)，即隔日刺激1 次，持續(xù)10 d（圖1）。空白對(duì)照組和藥物毒性組僅涂DNCB 的溶劑，涂抹時(shí)間及涂抹劑量與模型組相同。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食、飲水，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則給予人道主義關(guān)懷。

圖1 小鼠AD建模及各組處理方法Fig.1 Mice AD modeling and treatments in each group

1.2.2 給藥方法 小鼠分為藥物毒性組、空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、蒲公英甾醇組。DNCB涂抹建模后Day15開(kāi)始以口服灌胃方式進(jìn)行14 d的治療。陽(yáng)性對(duì)照組每天給予潑尼松龍10 mg/kg［23］；蒲公英甾醇濃度參考文獻(xiàn)［24-26］，分別采用5 mg/kg、10 mg/kg 兩個(gè)濃度，藥物毒性組、空白對(duì)照組、模型組每天給予等體積CMC（圖1）。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 建模指標(biāo) AD 小鼠模型造模成功后皮膚開(kāi)始出現(xiàn)明顯的紅斑、水腫和結(jié)痂等表現(xiàn)，左耳厚度明顯增厚，搔抓次數(shù)明顯增加，分值越高表明模型建立越成功。

1.2.3.2 小鼠皮損程度評(píng)分 Day 14 肉眼觀察激發(fā)部位皮膚，參考臨床特應(yīng)性皮炎積分（SCORAD）指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠皮損程度進(jìn)行評(píng)價(jià)［27］。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：重度紅斑、水腫、鱗屑、表皮脫落計(jì)3 分；中度紅斑、水腫、鱗屑、表皮脫落計(jì)2 分；輕度紅斑、水腫、鱗屑、表皮脫落計(jì)1分；正常皮膚計(jì)0分。

1.2.3.3 小鼠左耳厚度的記錄及變化程度評(píng)分Day 0 開(kāi)始用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠左耳中部厚度并進(jìn)行記錄，DNCB 激發(fā)后于Day 7、Day 14 再次測(cè)量、記錄，計(jì)算小鼠左耳中部厚度差距。根據(jù)厚度分級(jí)：刺激前后耳朵厚度明顯增加計(jì)1 分；刺激前后耳朵厚度無(wú)明顯變化計(jì)0分。

1.2.3.4 小鼠搔抓次數(shù)的記錄及評(píng)分 記錄Day 0、Day 7、Day 14小鼠的搔抓次數(shù)。測(cè)定方式為將小鼠單獨(dú)置于安靜環(huán)境中，拍攝并統(tǒng)計(jì)10 min 內(nèi)小鼠搔抓耳部及腹部的次數(shù)，后肢連續(xù)搔抓耳部及腹部視為1次搔抓活動(dòng)，當(dāng)后爪落地或被舔舐時(shí)代表本次搔抓結(jié)束，連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間搔抓記為1 次。根據(jù)小鼠搔抓次數(shù)評(píng)分：刺激前后搔抓次數(shù)明顯增加計(jì)1分；刺激前后搔抓次數(shù)無(wú)明顯變化計(jì)0分。

1.2.4 治療指標(biāo)

1.2.4.1 小鼠皮損程度評(píng)分 Day 28 觀察表皮剝脫、出血、滲出、紅斑、結(jié)痂的變化。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)同

1.2.3.2。

1.2.4.2 小鼠左耳厚度記錄 Day 15 開(kāi)始給予處理措施后，于Day 21、Day 28再次用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠左耳中部厚度并進(jìn)行記錄，計(jì)算小鼠左耳中部厚度差距，根據(jù)厚度分級(jí)：小鼠耳朵厚度無(wú)明顯改變計(jì)1分；小鼠耳朵厚度明顯降低計(jì)0分。

1.2.4.3 小鼠搔抓次數(shù)記錄 記錄Day 21、Day 28的小鼠搔抓次數(shù)。根據(jù)小鼠搔抓次數(shù)評(píng)分：小鼠搔抓次數(shù)無(wú)明顯減少計(jì)1 分；小鼠搔抓次數(shù)明顯減少計(jì)0分。分值越低表明藥物治療效果越好。

1.2.4.4 稱(chēng)重計(jì)算小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù) Day 29將小鼠安樂(lè)死，取胸腺、脾臟（用濾紙吸干多余的血液）稱(chēng)重（精確到0.1 mg）并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺重量（mg）/體重（g）×10；脾臟指數(shù)（mg/g）=脾臟重量（mg）/體重（g）×10。

1.2.4.5 ELISA 檢測(cè)炎癥因子 Day 29 按照試劑盒說(shuō)明將小鼠眼球摘除取血1 ml，室溫下自然凝固10～20 min。4 ℃、2 000～3 000 r/min 離心20 min，取血清，儲(chǔ)存于-20 ℃。ELISA 檢測(cè)各組TNF-α、IL-4、IL-6三種炎癥因子水平。

1.2.4.6 HE 染色 Day 29 將小鼠安樂(lè)死，取小鼠距耳緣約5 mm 處耳部皮損組織和腹部皮損組織用10%甲醛固定48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切4 μm 厚片，45 ℃烤片烘干，二甲苯脫蠟，蘇木精-伊紅染色，乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察表皮間隙有無(wú)水腫，表皮有無(wú)角化過(guò)度或角化不全，棘層及顆粒層厚度，真皮炎癥細(xì)胞（以嗜酸性粒細(xì)胞為主）浸潤(rùn)情況。

1.2.4.7 免疫組化 ①脫蠟和水化：切片置于60 ℃烤箱中烘烤2 h，而后依次浸入二甲苯15 min 2 次，無(wú)水乙醇15 min 2 次，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；②抗原修復(fù)：置于EDTA 溶液中，95 ℃加熱10 min，室溫降溫，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；③內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉：加入阻斷性?xún)?nèi)源性過(guò)氧化物酶適量反應(yīng)10 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，每次3 min；④抗原抗體結(jié)合：免疫組化筆描邊后，每張玻片加入100 μl一抗反應(yīng)，4 ℃過(guò)夜，第2 天加入反應(yīng)增強(qiáng)液，37 ℃反應(yīng)20 min，隨后加入二抗，37 ℃反應(yīng)20 min；⑤顯色：加入新鮮配制的DAB 顯色液，室溫孵育1 min 左右，自來(lái)水沖洗；復(fù)染：自來(lái)水沖洗，蘇木素染色液孵育30 s，分化、沖洗反藍(lán)，隨后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并觀察CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0及Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD 建模結(jié)果 空白對(duì)照組評(píng)分為0，建模各組評(píng)分均＞4 分，建模小鼠皮膚均出現(xiàn)明顯的紅斑、水腫、結(jié)痂、角皮脫落、左耳厚度增加、搔抓次數(shù)增多等表現(xiàn)。與空白對(duì)照組相比，AD 建模各組評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示AD 小鼠模型建立成功（P＜0.01，圖2A、B、表1）。

表1 小鼠AD情況評(píng)分比較（±s）Tab.1 Comparison of AD condition scores in mice （±s）

表1 小鼠AD情況評(píng)分比較（±s）Tab.1 Comparison of AD condition scores in mice （±s）

Note：1） P＜0.01 vs blank control group；2）P＜0.01 vs model control group；3） P＜0.01 vs L-Tar group.

Groups Atopic dermatitis in mice Post modeling scoring 0 4.750±0.4331）4.714±0.4511）4.700±0.4581）4.889±0.3141）Post treatment score 0 4.625±0.4841）1.429±0.4951）2）3）3.500±0.5001）2）1.444±0.4971）2）3）Blank Model Positive L-Tar H-Tar

圖2 給藥后小鼠生理改變Fig.2 Physiological changes of mice after administration

2.2 各組小鼠耳厚、搔抓次數(shù)統(tǒng)計(jì) 隨著DNCB 的刺激，與空白對(duì)照組相比，建模各組小鼠耳厚明顯增厚（P＜0.01），搔抓次數(shù)明顯增加（P＜0.01）。給予藥物干預(yù)后，小鼠AD 情況得到改善。與模型組相比，低、高濃度蒲公英甾醇組小鼠耳厚明顯變?。≒＜0.01），搔抓次數(shù)減少（P＜0.01），與潑尼松龍陽(yáng)性對(duì)照組表現(xiàn)相符，高濃度蒲公英甾醇組較低濃度蒲公英甾醇組降低程度更加明顯（P＜0.01，圖3）。

圖3 小鼠耳厚、搔抓次數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistics of mouse ear thickness and scratching times

2.3 小鼠治療評(píng)分 給予藥物治療后，小鼠AD 皮損情況明顯改善。與模型對(duì)照組相比，小鼠皮損情況好轉(zhuǎn)，皮膚結(jié)痂，無(wú)紅斑，無(wú)出血，毛發(fā)開(kāi)始正常生長(zhǎng)，左耳厚度明顯變薄，搔抓次數(shù)明顯減少（P＜0.01），皮炎情況評(píng)分明顯降低，且與藥物濃度呈正相關(guān)（P＜0.01）。見(jiàn)圖2A、B、圖3、表1。

2.4 各組臟器指數(shù)比較 與模型組相比，低、高濃度蒲公英甾醇可明顯降低AD 模型小鼠的胸腺指數(shù)（P＜0.01，圖4A），其效果與潑尼松龍陽(yáng)性對(duì)照組的免疫抑制作用一致；低、高濃度蒲公英甾醇亦可顯著降低小鼠脾臟指數(shù)（P＜0.01，圖4B），推測(cè)可能與抑制被過(guò)度激活的B淋巴細(xì)胞有關(guān)。臟器指數(shù)的降低與藥物濃度呈正相關(guān)。

2.5 各組皮損組織病理變化 與模型組相比，蒲公英甾醇治療組小鼠鏡下可見(jiàn)表層增厚水腫、過(guò)度角化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、棘層肥厚等情況明顯減輕。隨著蒲公英甾醇濃度升高，治療效果明顯增強(qiáng)（圖5A），且對(duì)肝腎無(wú)明顯毒性（圖5B、C）。提示蒲公英甾醇能明顯改善小鼠AD的皮膚狀況，促進(jìn)恢復(fù)。

圖5 給藥后小鼠病理改變Fig.5 Pathologic changes of mice after administration

2.6 各組免疫組化結(jié)果 給予藥物后，CD4+T 細(xì)胞浸潤(rùn)情況好轉(zhuǎn)。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、低濃度蒲公英甾醇組、高濃度蒲公英甾醇組、病變周?chē)鶦D4+T 細(xì)胞減少，表明蒲公英甾醇具有治療效果，可以降低AD 炎癥程度（圖6），提示蒲公英甾醇可以減輕CD4+T細(xì)胞的炎癥浸潤(rùn)情況，促進(jìn)恢復(fù)。

2.7 各組血清中炎癥水平檢測(cè) 兩種不同濃度給藥組血清中炎癥因子TNF-α 含量的平均值分別為171.44、166.44，與模型組（243.78）相比明顯降低；同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組、低濃度蒲公英甾醇組、高濃度蒲公 英 甾 醇 組 中IL-4（8.72、7.96）、IL-6（23.29、21.98）含量相比模型組（17.50；45.13）顯著降低（P＜0.01）且與藥物濃度呈正相關(guān)（P＜0.01，圖7）。提示蒲公英甾醇能夠顯著降低血清中炎癥因子TNF-α、IL-4、IL-6水平。

3 討論

AD 是一種與遺傳和過(guò)敏相關(guān)的，表現(xiàn)為皮膚干燥、劇烈瘙癢的皮膚病。AD 的發(fā)病機(jī)制包括免疫系統(tǒng)功能障礙和表皮屏障功能障礙，與遺傳、免疫、環(huán)境等多重因素相關(guān)［1］。該疾病多發(fā)生于嬰兒期，患病率呈逐年上升趨勢(shì)［28］。雖然AD 具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但Th1/Th2 細(xì)胞失衡被認(rèn)為是AD發(fā)生的主要原因之一。在AD 的發(fā)病中，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加、Th2 相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)B 細(xì)胞活化使免疫球蛋白E（IgE）水平顯著升高，且Th2 相關(guān)細(xì)胞因子可在誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞活化增加的同時(shí)抑制Th1細(xì)胞。增加的IgE 與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞相關(guān)受體反應(yīng)是AD 發(fā)生的主要機(jī)制。IL-4、IL-6 等炎癥因子可誘導(dǎo)CD4+向Th2 分化，Th2 分泌IL-4 在B 細(xì)胞向IgE 轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Th1 和Th22 分泌的TNF-α是公認(rèn)的細(xì)胞促炎癥因子，被認(rèn)為是AD的誘因。因此調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡可以改善疾?。▓D8）［29-31］。

圖8 蒲公英甾醇改善AD的相關(guān)機(jī)制Fig.8 Mechanism of dandelion sterol improving AD

當(dāng)前治療AD 的藥物主要有皮質(zhì)類(lèi)固醇和免疫抑制劑，但這些藥物均有較為嚴(yán)重的副作用。因此，愈來(lái)愈多的學(xué)者開(kāi)始從中草藥中探索新的AD治療藥物，以期找到療效顯著、服用方便、副作用小的新型藥物［8-11］。蒲公英甾醇是蒲公英的主要活性成分之一，研究表明，該成分對(duì)肝損傷、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎損傷等多種疾病模型均有治療作用，其中最為顯著的是抗炎作用［15］。蒲公英甾醇已被證明可通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8 等的產(chǎn)生抑制潰瘍性結(jié)腸炎［17］；通過(guò)調(diào)節(jié)κB 抑制劑、IκB 激酶和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子活化激酶1（transform growth factor β activated kinase 1，TAK1）抑制 核 因子-κB（NF-κB）激活以抑制IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［18］；通過(guò)調(diào)控TLRs/NF-κB 和Bax/Bcl-2 等炎癥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善肝損傷等炎癥［20］。

本研究中，蒲公英甾醇的應(yīng)用劑量參考文獻(xiàn)［24-26］，采用了5 mg/kg 和10 mg/kg 濃度。本研究結(jié)果表明，蒲公英甾醇能明顯改善AD 小鼠模型的皮膚病理狀態(tài)，降低皮膚厚度，減少搔抓次數(shù)，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)AD 具有良好的治療作用，且對(duì)肝、腎無(wú)明顯藥物毒性，副作用少。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示，應(yīng)用蒲公英甾醇的各組小鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6 水平顯著降低。提示蒲公英甾醇可能通過(guò)調(diào)節(jié)這3種炎癥因子調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡紊亂，減少I(mǎi)gE轉(zhuǎn)化，從而抑制AD的發(fā)展，緩解AD情況。因此蒲公英可能是治療AD 的具有發(fā)展前景的一類(lèi)中草藥。本研究為臨床使用蒲公英甾醇治療AD 提供了部分理論支持，但蒲公英甾醇治療AD 的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。