牛蒡子苷元對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病的治療作用及機(jī)制①

李家駒 黃佑?jì)?李遠(yuǎn)迪 何可可 蘇 敏 （貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種由腸黏膜上皮破壞引起的慢性、復(fù)發(fā)性炎癥疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）和克羅恩?。–rohn's disease, CD）。IBD 是環(huán)境和遺傳因素相互作用的結(jié)果，通常導(dǎo)致腸道黏膜免疫反應(yīng)異常和腸道炎癥發(fā)生［1-2］。此外，腸道表面由黏膜組成，主要由緊密連接（tight junction，TJs）覆蓋，而TJs是腸道的主要屏障［3］。TJs 蛋白的異常表達(dá)與IBD密切相關(guān)［4］。我國IBD 的發(fā)病率顯著上升，然而其發(fā)病機(jī)制和病因尚未闡明。目前用于治療IBD的藥物存在明顯的不良反應(yīng)，如全身免疫抑制、頭痛、惡心和疲勞［5-6］。因此，探索可用于治療IBD 的藥物具有重要意義。

許多天然產(chǎn)物由于具有抗炎作用和相對(duì)低的毒性而獲得了相當(dāng)多的關(guān)注。牛蒡子是菊科牛蒡?qū)僦参锔稍锍墒斓墓麑?shí)，是一種傳統(tǒng)中藥，廣泛用于治療風(fēng)熱邪咳嗽、咽喉腫痛等。牛蒡子苷元是從牛蒡子中提取分離而來的木質(zhì)素類化合物。作為牛蒡子的主要活性成分，牛蒡子苷元被發(fā)現(xiàn)具有抗病毒和抗炎等作用。據(jù)報(bào)道，牛蒡子苷元能抑制炎癥和氧化應(yīng)激，但其在IBD 中的作用還有待研究［7］。本研究旨在探究牛蒡子苷元對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導(dǎo)的人腸道細(xì)胞Caco-2 和葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型的作用及其相關(guān)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8 周齡C57BL/6J 雄性小鼠（20～22 g，SPF 級(jí)）購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Caco-2 細(xì)胞購自中國科學(xué)院科學(xué)細(xì)胞庫（上海，中國）；牛蒡子苷元（純度≥98%；分子量372.411 7）購自上海源葉生物科技有限公司。胎牛血清和DMEM 購自美國Gibco公司；DSS購自美國Sigma公司；ELISA 試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；磷酸化細(xì)胞核因子κB p65（nuclear factor kappa-B p65，NF-κB p-p65）、緊密連接蛋白（zonula occludens-1，ZO-1），GAPDH 抗體均購自美國Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自上海碧云天生物科技有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；蛋白電泳凝膠儀和The Trans-Blot Turbo 蛋白轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad 生物有限公司；OLYMPUS AX70顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠IBD 模型建立 采用DSS 建立IBD 小鼠模型［8］。C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為4 組：空白對(duì)照組、模型組、牛蒡子苷元低劑量組（10 mg/kg）和牛蒡子苷元高劑量組（40 mg/kg）。對(duì)照組小鼠自由飲用自來水，其余各組小鼠通過連續(xù)飲用4%（wt./vol）DSS 7 d制備小鼠IBD模型。模型鼠在造模第3～4天后，小鼠會(huì)表現(xiàn)出明顯的疾病跡象，包括駝背、皮毛隆起、腹瀉和黏液膿血便。隨機(jī)挑選3只模型鼠，處死后取出結(jié)腸組織，通過組織病理學(xué)觀察可見潰瘍、隱窩膿腫、杯狀細(xì)胞丟失、黏液層丟失和大量中性粒細(xì)胞浸潤到固有層，表明造模成功。小鼠在造模前連續(xù)灌胃牛蒡子苷元2 d，于第3 天進(jìn)行DSS 造模，各給藥組均連續(xù)灌胃給予相應(yīng)藥物10 d，1次/d，對(duì)照組和DSS 組給予等體積生理鹽水。給藥期間，小鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食、自由飲水。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2016-0003。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2 細(xì)胞（1×105個(gè)/ml）接種于96 孔板，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的PRMI1640 中，并置于37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中。當(dāng)96 孔板中的Caco-2細(xì)胞貼壁后，分為4 組：空白對(duì)照組、LPS 組、LPS+10 μmol/L 牛蒡子苷元組，LPS+40 μmol/L 牛蒡子苷元組。Caco-2 細(xì)胞與牛蒡子苷元（10、40 μmol/L）孵育1 h，然后37 ℃下用LPS（1 μg/ml）刺激24 h，與對(duì)照組比較差異顯著，表明建模成功［9］。

1.2.3 ELISA 測(cè)定各組細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 和SOD 水平 在洗凈的小鼠結(jié)腸中加入3 倍的生理鹽水，采用超聲粉碎法將結(jié)腸組織勻漿，按試劑盒說明書方法操作，ELISA 對(duì)小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 和SOD 的 含 量 進(jìn) 行測(cè)定。

1.2.4 Western blot 分析 使用RIPA 裂解液提取細(xì)胞和組織中的蛋白；取20 μl 蛋白樣品采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（120 V，2 h）；電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜（250 mA，2 h）；10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育2 h。凝膠成像儀檢測(cè)蛋白條帶，Image-Pro Plus軟件分析條帶灰度值。

1.2.5 HE 染色 采用HE 染色評(píng)價(jià)結(jié)腸組織病理學(xué)變化。在實(shí)驗(yàn)完成后，小鼠被處死，移除每只小鼠的整個(gè)結(jié)腸。將5 mm 長的結(jié)腸用4%多聚甲醛中過夜固定。隨后，將石蠟包埋的結(jié)腸切片用蘇木精和伊紅進(jìn)行HE 染色。采用顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.2.6 胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)計(jì)算 將各組中的小鼠脫頸椎處死后稱量體質(zhì)量（g）。無菌條件下剪開腹腔摘取小鼠的胸腺和脾臟。使用濾紙吸干胸腺和脾臟的殘血后，稱重（mg）。計(jì)算胸腺指數(shù)=（胸腺重量mg/小鼠體質(zhì)量g）×10；脾臟指數(shù)=（脾臟重量mg/小鼠體質(zhì)量g）×10。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡子苷元抑制LPS誘導(dǎo)的人腸道細(xì)胞Caco-2炎癥因子分泌 ELISA 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，LPS 處理后，Caco-2 細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6 分泌顯著增加（P＜0.05）；與LPS 組比較，牛蒡子苷元治療24 h 后降低了炎癥因子的分泌，而高劑量牛蒡子苷元（40 μmol/L）的治療效果明顯優(yōu)于低劑量牛蒡子苷元（10 μmol/L）（P＜0.05）。見圖1。2.2 牛蒡子苷元減輕LPS誘導(dǎo)的人腸道細(xì)胞Caco-2氧化應(yīng)激 ELISA 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，LPS處理后，Caco-2細(xì)胞中SOD 含量顯著下降，MDA含量顯著上升（P＜0.05）；而10 μmol/L 或40 μmol/L牛蒡子苷元處理顯著增加了SOD 含量，減少了MDA含量（P＜0.05）。見圖2。

圖1 牛蒡子苷元抑制Caco-2細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)Fig.1 Arctigenin inhibits expressions of inflammatory factors in Caco-2 cells

圖2 牛蒡子苷抑制Caco-2細(xì)胞中氧化應(yīng)激Fig.2 Arctigenin inhibits oxidative stress in Caco-2 cells

2.3 牛蒡子苷元抑制LPS 誘導(dǎo)的人腸道細(xì)胞NF-κB 通路激活 Western blot 結(jié)果顯示，LPS 誘導(dǎo)Caco-2 細(xì)胞后，NF-κB p65 蛋白的磷酸化水平顯著升高，其下游蛋白ZO-1 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；10 μmol/L 或40 μmol/L 牛蒡子苷元處理后，逆轉(zhuǎn)了LPS 誘導(dǎo)的NF-κB p65 蛋白磷酸化水平上升和ZO-1表達(dá)水平降低。見圖3。

圖3 牛蒡子苷元抑制Caco-2細(xì)胞中NF-κB通路激活Fig.3 Arctigenin inhibits activation of NF-κB pathway in Caco-2 cells

2.4 牛蒡子苷元減輕DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠炎癥因子分泌 與對(duì)照組比較，DSS 誘導(dǎo)的IBD 模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量顯著增加（P＜0.01）。牛蒡子苷元低和高劑量組（10 mg/kg 和40 mg/kg）TNF-α、IL-1β 和IL-6 含 量 明 顯 降 低，40 mg/kg牛蒡子苷元組效果更為顯著（P＜0.01）。見表1。

表1 牛蒡子苷元對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織炎癥因子含量的影響（±s，n=6，pg/mg）Tab.1 Effect of arctigenin on content of inflammatory factors in colon tissues of mice induced by DSS（±s，n=6，pg/mg）

表1 牛蒡子苷元對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織炎癥因子含量的影響（±s，n=6，pg/mg）Tab.1 Effect of arctigenin on content of inflammatory factors in colon tissues of mice induced by DSS（±s，n=6，pg/mg）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.01； compared with model group， 2）P＜0.01； compared with 10 mg/kg Arctigenin， 3）P＜0.01.

Groups Control Model 10 mg/kg Arctigenin 40 mg/kg Arctigenin F TNF-α 26.75±12.51 366.83±28.131）229.07±19.752）IL-1β 55.01±7.30 303.82±28.441）205.52±16.392）IL-6 72.79±6.22 163.48±14.701）136.28±11.522）110.42±12.333）66.34 108.22±9.263）370.40 91.09±8.553）255.60

2.5 牛蒡子苷元減輕DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠的氧化應(yīng)激 與對(duì)照組比較，DSS 處理的小鼠結(jié)腸組織中SOD 活性降低，而10 mg/kg 或40 mg/kg 牛蒡子苷元可顯著提高SOD 活性（P＜0.01）。與對(duì)照組小鼠相比，DSS 誘導(dǎo)的IBD 模型組小鼠MDA 濃度顯著增加，而10 mg/kg 或40 mg/kg 牛蒡子苷元治療小鼠的MDA濃度明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 牛蒡子苷元對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織MDA和SOD含量的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of arctigenin on contents of MDA and SOD in colon tissues of mice induced by DSS （±s，n=6）

表2 牛蒡子苷元對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織MDA和SOD含量的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of arctigenin on contents of MDA and SOD in colon tissues of mice induced by DSS （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.01； compared with model group，2）P＜0.05，3）P＜0.01；compared with 10 mg/kg Arctigenin，4）P＜0.01.

SOD/（U·mg-1）29.71±3.52 18.67±1.581）21.89±1.172）28.53±2.544）29.60 Groups Control Model 10 mg/kg Arctigenin 40 mg/kg Arctigenin F MDA/（nmol·mg-1）1.32±0.16 2.81±0.091）2.26±0.133）1.46±0.074）212.20

2.6 牛蒡子苷元抑制DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠NF-κB通路激活 與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB p-p65 蛋白表達(dá)增加，ZO-1 表達(dá)下降（P＜0.05）；10 mg/kg 和40 mg/kg 牛蒡子苷元組逆轉(zhuǎn)了DSS 誘導(dǎo)的NF-κB p-p65 表達(dá)增加和ZO-1 表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 牛蒡子苷元抑制DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠NF-κB 通路激活Fig.4 Arctigenin inhibits DSS-induced activation of NFκB pathway in IBD mice

2.7 牛蒡子苷元增強(qiáng)免疫功能和減輕結(jié)腸組織損傷 免疫功能的強(qiáng)弱可通過胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)反映。與對(duì)照組相比，DSS誘導(dǎo)后，小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；10 mg/kg 或40 mg/kg牛蒡子苷元治療后，小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)升高（P＜0.01）。見表3。HE 染色結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，組織絨毛排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤和壞死。IBD 模型組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞浸潤絨毛排列紊亂，黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，有中性粒細(xì)胞浸潤跡象，個(gè)別區(qū)域細(xì)胞壞死明顯。10 mg/kg 牛蒡子苷元組小鼠結(jié)腸組織損傷程度減輕，組織結(jié)構(gòu)層次分明，局部組織炎癥細(xì)胞浸潤減少，組織形態(tài)較好。40 mg/kg 牛蒡子苷元組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)基本完整，腸腺排列整齊，黏膜上皮細(xì)胞淋巴細(xì)胞浸潤顯著減少。見圖5。

表3 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)（±s，n=6）Tab.3 Thymus index and spleen index （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.01； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with 10 mg/kg Arctigenin， 3）P＜0.05.

Spleen index 0.006 16±0.000 57 0.004 08±0.000 391）0.004 77±0.000 432）0.005 42±0.000 483）21.29 Groups Control Model 10 mg/kg Arctigenin 40 mg/kg Arctigenin F Thymus index 0.001 83±0.000 12 0.001 31±0.000 181）0.001 52±0.000 142）0.001 74±0.000 183）24.79

圖5 牛蒡子苷元對(duì)DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響Fig.5 Effect of arctigenin on colonic histopathology of DSS-induced IBD mice

3 討論

IBD 是消化道常見的一種復(fù)發(fā)性、長期性的炎癥性疾病，對(duì)患者的身心健康有害。此外，IBD 屬于自身免疫性疾病，可能增加結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)。目前用于改善IBD相關(guān)臨床癥狀和炎癥的藥物包括糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸、免疫抑制劑和其他生物制劑。然而，這些藥物也有副作用。因此，開發(fā)更安全、有效和靶向治療IBD的藥物是必要的。

越來越多的研究表明牛蒡子苷元具有多種生物功能。牛蒡子苷元已被報(bào)道可抑制小鼠免疫細(xì)胞防止急性肝炎引起的肝損傷［10］。HYAM 等［11］發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元通過抑制PI3K/AKT 通路將M1 巨噬細(xì)胞極化為M2 樣巨噬細(xì)胞來改善體外和體內(nèi)炎癥。ZHANG 等［12］發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元通過抑制MAPK、HO-1 和iNOS 的信號(hào)傳導(dǎo)，降低LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷，其分子機(jī)制可能與其抗炎和抗氧化應(yīng)激的能力有關(guān)。此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道牛蒡子苷元顯示出較高的抗癌活性，可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［13］。鑒于以上結(jié)果，本研究通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討牛蒡子苷元對(duì)IBD 的治療作用及機(jī)制。體外研究結(jié)果表明，LPS刺激人腸道細(xì)胞Caco-2后，炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 分泌顯著增加，SOD 活性降低，MDA 含量增加。牛蒡子苷元可明顯降低炎癥因子的分泌以及氧化應(yīng)激水平。本研究通過小鼠自由飲用4%DSS 溶液7 d 誘導(dǎo)潰瘍性IBD 小鼠模型，從而進(jìn)行體內(nèi)研究。造模3 d 后，小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，表明免疫功能被抑制；同時(shí)觀察到，小鼠結(jié)腸黏膜損傷，結(jié)腸組織中MDA和炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6水平均上升，SOD水平下降。高劑量牛蒡子苷元可明顯減輕DSS 誘導(dǎo)的腸黏膜損傷，抑制炎癥因子分泌和氧化應(yīng)激水平。

目前有關(guān)IBD的病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確。大量的文獻(xiàn)表明，IBD 的發(fā)病機(jī)制涉及復(fù)雜的炎癥反應(yīng)。IBD 時(shí)腸黏膜促炎細(xì)胞因子表達(dá)升高，而抑炎細(xì)胞因子分泌相對(duì)不足，使腸黏膜發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起腸道損傷［14-15］。氧化應(yīng)激在慢性炎癥過程中發(fā)揮直接作用，可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［16］。NF-κB 通路已被證明與炎癥反應(yīng)和IBD 密切相關(guān)。在IBD 中，miR-19b 通過上調(diào)Runx3、阻斷NF-κB 和PI3K/AKT信號(hào)通路緩解LPS 誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞炎癥損傷［17］。IBRAHIM 等［18］發(fā)現(xiàn)，PIK3R3 通過NF-κB 通路調(diào)控炎癥性腸病中ZO-1 表達(dá)，抑制PIK3R3 使NF-κB 通路失活，ZO-1表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而減輕IBD。以上研究表明，抑制NF-κB 通路的激活，可顯著改善IBD。已有研究對(duì)牛蒡子苷元與NF-κB 通路的關(guān)系進(jìn)行了探究。ZHOU 等［19］發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元通過抑制小鼠PI3K/AKT 和NF-κB 信號(hào)通路，抑制炎癥因子的表達(dá)，從而防止骨關(guān)節(jié)炎。牛蒡子苷元通過HMGB1/TLR4-和TNF-α/TNFR1-介導(dǎo)的NF-κB 信號(hào)通路激活減輕神經(jīng)炎癥，發(fā)揮抗抑郁作用［20］。然而，牛蒡子苷元是否可以通過抑制NF-κB 激活減輕炎癥從而緩解IBD 尚未見報(bào)道。因此，本課題組對(duì)牛蒡子苷元進(jìn)行研究。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牛蒡子苷元通過降低NF-κB p-65 蛋白表達(dá)，抑制NF-κB 通路激活，促進(jìn)ZO-1表達(dá)，減輕IBD。

綜上所述，本研究結(jié)果表明了牛蒡子苷元通過調(diào)節(jié)NF-κB/ZO-1 通路抑制炎癥因子分泌和氧化應(yīng)激，從而對(duì)IBD有顯著的改善作用。