巨噬細胞極化與動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的研究進展①

劉 理 謝燕飛 余 軍 （江西中醫(yī)藥大學醫(yī)學轉(zhuǎn)化中心，南昌 330004）

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，其主要病變表現(xiàn)為部分動脈脂質(zhì)沉積，并伴有平滑肌細胞和纖維基質(zhì)增生，逐漸發(fā)展為動脈粥樣硬化斑塊，斑塊破裂往往伴隨纖維帽變薄、脂質(zhì)池增大、炎癥活動增加、蛋白水解酶含量增加等現(xiàn)象［1］。巨噬細胞可分為M1 型和M2 型，分別釋放促炎因子及抑炎因子，促炎因子可促進斑塊形成，反之抑炎因子減緩斑塊形成。同時，巨噬細胞兩種表型可在一定條件下相互轉(zhuǎn)換［2］。研究表明，斑塊病變處存在大量不同表型巨噬細胞，穩(wěn)定斑塊中以M2 型巨噬細胞為主，不穩(wěn)定斑塊中以M1 型巨噬細胞為主［3］。綜上，巨噬細胞及其極化狀態(tài)對斑塊的穩(wěn)定性具有重大影響，以極化為切入點可能是治療動脈粥樣硬化的有效途徑。因此，本文從巨噬細胞表型、巨噬細胞極化對斑塊的影響以及表型機制調(diào)節(jié)等方面進行綜述。

1 巨噬細胞極化

巨噬細胞極化主要受微觀環(huán)境影響，不同刺激可導致巨噬細胞向不同表型轉(zhuǎn)化。目前主要將巨噬細胞分為兩大類，即促炎M1 型及抗炎M2 型，前者由Th1 細胞因子誘導，后者由Th2 細胞因子誘導［4］。兩種細胞亞型功能、表面標志物、趨化因子等方面各不相同（表1）。

表1 巨噬細胞不同表型及其特點Tab.1 Phenotypes and characteristics of macrophage

M1 型巨噬細胞主要發(fā)揮促炎作用，能產(chǎn)生TNF-α、IL-6 等炎癥因子及CXCL9、CXCL10 等標志物［5］。M1 型巨噬細胞還能產(chǎn)生活性氧、一氧化氮合酶等物質(zhì)，誘導組織損傷并阻礙傷口愈合［6］。

M2 型巨噬細胞可進一步分化為M2a、M2b、M2c、M2d 4 種亞型。M2a 巨噬細胞由IL-4、IL-13 誘導，具有組織重塑、內(nèi)吞功能；M2b 巨噬細胞由免疫復合物與IL-1β 或脂多糖聯(lián)合誘導，主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；M2c 巨噬細胞由IL-10、TGF-β 或糖皮質(zhì)激素誘導，發(fā)揮細胞外吞作用；M2d巨噬細胞由TLR以及腺苷A2A受體激動劑共同誘導［5，12-13］。所有M2型巨噬細胞均能發(fā)揮一定抗炎效應，主要表現(xiàn)為IL-12 低表達、IL-10 和TGF-β 高表達，但每種亞型都有其特定標志物，并表現(xiàn)不同特性（表1）。

除M1、M2型巨噬細胞外，近年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其他不同亞型巨噬細胞，如M（Hb）、Mhem、Mox、M4等，其中Mhem 是對HA-mac 重新定義的結(jié)果，具有抑制氧化應激、抗炎效果（表1）［14-21］。

2 不同表型巨噬細胞在斑塊中的定位

動脈粥樣硬化往往伴隨炎癥反應，炎癥因子可刺激巨噬細胞分泌MMP-2和MMP-9，降解細胞外基質(zhì)，影響纖維帽厚度，從而影響斑塊穩(wěn)定［22］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-MMP10-/-小鼠斑塊中M1 型巨噬細胞極化標志物IL12a、NOS2和TNF-α表達減少，小鼠炎癥程度較低，斑塊表型更穩(wěn)定［23］。隨著對斑塊的深入研究發(fā)現(xiàn)，斑塊中存在不同巨噬細胞表型，且存在分布差異。斑塊中M1、M2 型巨噬細胞數(shù)量均較外周正常組織明顯增多。CHO等［3］在此基礎(chǔ)上進一步研究斑塊中巨噬細胞分型，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定斑塊中M2 型呈高分布，而不穩(wěn)定斑塊中以M1 型居多。與M2型相比，M1型多分布于內(nèi)膜易破裂的肩部區(qū)，M1型巨噬細胞增多促進斑塊破裂，導致血栓形成。

3 不同巨噬細胞表型對斑塊的影響

3.1 M1 和M2 巨噬細胞 剪切力、維生素D 受體、LPS、IFN-γ 等均可誘導巨噬細胞向M1 型極化，并釋放促炎因子如IFN-γ、IL-1β、TNF-α。炎癥因子可破壞內(nèi)皮細胞，促進平滑肌細胞、巨噬細胞凋亡，凋亡細胞堆積形成脂核，進一步加速斑塊形成［7-8］。另外，研究證實M1型巨噬細胞釋放的促炎因子TNF-α在動脈斑塊中高表達，尤其在不穩(wěn)定斑塊內(nèi)膜與中膜［24］。研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化病變中的M1 型巨噬細胞通過活化NF-κB 信號通路增加C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）表達，且斑塊中M1 型巨噬細胞數(shù)與CRP 水平呈正相關(guān)［15］。因此，誘導巨噬細胞從M1 型向M2 型轉(zhuǎn)變或許可減少CRP 的有害作用，并減緩粥樣硬化斑塊中的炎癥反應。與M1 型巨噬細胞相反，M2 型巨噬細胞分泌的IL-10 等抑炎因子能增強斑塊穩(wěn)定性［25］。LIU 等［26］取頸動脈斑塊患者和正常人外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分化為巨噬細胞，檢測兩組PBMCs 源巨噬細胞基因表達差異，結(jié)果表明，與正常組比較，頸動脈斑塊患者低表達LXRα，進一步過表達LXRα 發(fā)現(xiàn)，M2 型標志物CD163、CD206、Arg1表達升高，M1型標志物TNF-α、IL-6、IL-10表達降低。提示LXRɑ過表達促使PBMCs源巨噬細胞向M2型極化。

3.2 M4、Mox、Mhem、M（Hb）型巨噬細胞 研究者發(fā)現(xiàn)了與斑塊穩(wěn)定相關(guān)的M4 型巨噬細胞，這種表型的巨噬細胞由血小板趨化因子CXCL4 誘導［20］。OKSALA 等［21］進一步研究發(fā)現(xiàn)，人頸動脈斑塊中所有M4 巨噬細胞標志物均與MMP12和組蛋白去乙?；?（HDAC9）相關(guān)。表明M4 巨噬細胞可能是HDAC9和MMP-12在晚期人類斑塊中表達的來源。

KADL 等［18］在小鼠斑塊中發(fā)現(xiàn)了Mox 型巨噬細胞，與傳統(tǒng)的M1 或M2 表型相比，這種巨噬細胞由氧化磷脂誘導，顯示出弱的吞噬能力和趨化特性，氧化還原調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 參與調(diào)控其形成過程。這種類型巨噬細胞主要通過上調(diào)Nrf2、增加Hmox1 蛋白表達及轉(zhuǎn)錄、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（FPN）轉(zhuǎn)錄引起鐵潴留，從而促進動脈粥樣硬化發(fā)展［19］。血紅素（hemoglobin，Hb）刺激的巨噬細胞也稱為M（Hb）型巨噬細胞，這種巨噬細胞高表達MR/CD163［14］。FINN 等［14］發(fā)現(xiàn)，與泡沫細胞相比，M（Hb）型巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減少。同時，M（Hb）型巨噬細胞內(nèi)含鐵量減少，促使ROS減少，進一步使LXRα受體驅(qū)動膽固醇外排基因ABCA1表達增加，最終增加膽固醇外排，延緩動脈粥樣硬化發(fā)展，與Mox型巨噬細胞鐵表型促進鐵潴留和脂質(zhì)累積恰恰相反。另一種巨噬細胞——斑塊出血區(qū)的Mhem 細胞可通過轉(zhuǎn)錄激活因子1（transcription factor 1，ATF-1）影響動脈粥樣硬化發(fā)展。如BOYLE 等［15］指出斑塊內(nèi)出血區(qū)的HA-mac/Mhem共表達p-ATF-1、HO-1 以及LXR 的靶基因ApoE 和ABCA1，減少泡沫細胞變化，從而減輕斑塊內(nèi)出血。

綜上，巨噬細胞極化與微環(huán)境緊密相關(guān)，極化狀態(tài)以及極化后的分布對斑塊穩(wěn)定性尤為重要。因此，治療動脈粥樣硬化時可通過調(diào)節(jié)M1/M2 型巨噬細胞比例使巨噬細胞向M2 型極化，或誘導巨噬細胞向其他增加斑塊穩(wěn)定性的表型分化，延緩動脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)生。此外，雖然M1 型及M2 型巨噬細胞對動脈粥樣硬化的作用已明確，但M2 型巨噬細胞各亞型在動脈粥樣硬化中的作用及具體機制還有待闡明。

4 巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)機制

4.1 miRNAs miRNAs是一種小的、內(nèi)源性的非編碼RNA，長度為22～26 個核苷酸，廣泛參與癌癥、肥胖、動脈粥樣硬化等多種疾病發(fā)生發(fā)展［27］。研究表明miR-33、miR-155、miR-223、miR-27 等均可影響巨噬細胞極化［28-31］。NAZARI-JAHANTIGH 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 在動脈粥樣斑塊及促炎型巨噬細胞中上調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-155 通過抑制轉(zhuǎn)錄因子BCL-6 表達促進NF-κB 信號轉(zhuǎn)導，增加趨化因子CCL2 表達，促進動脈粥樣硬化發(fā)展。DONNERS等［32］將miR155-/-及野生型小鼠骨髓移植到LDLR-/-小鼠中，研究miR-155對動脈粥樣硬化的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，miR-155-/-組小鼠斑塊面積增大，血脂水平升高，且動脈粥樣病變處中性粒細胞、巨噬細胞增加，T 細胞減少，提示miR-155 具有抗動脈粥樣硬化作用。OUIMET 等［30］為研究miR-33 與巨噬細胞炎癥的關(guān)系，將骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）分別用IFN-γ/LPS或IL-4處理24 h后檢測miR-33水平，結(jié)果顯示，與M2 型相比，M1 型巨噬細胞miR-33表達更高，提示miR-33 可能參與巨噬細胞M1 型極化，進一步過表達miR-33 后發(fā)現(xiàn)，M1 型巨噬細胞標志物（如IL-6、NOS2 和IL-1β）轉(zhuǎn)錄水平升高，同時M2 型巨噬細胞標志物CD206 和Fizz1/Retnla 轉(zhuǎn)錄水平降低。

miR-216a 可通過靶向Smad/NF-κB 信號通路發(fā)揮促炎作用［33］。YANG 等［34］在此基礎(chǔ)上研究miR-216a對巨噬細胞極化的影響，發(fā)現(xiàn)miR-216a能夠通過Smad/NF-κB 信號通路誘導巨噬細胞中端粒酶激活，并促進巨噬細胞向M1 型極化。由此看來，靶向miR-216a 開展治療對穩(wěn)定斑塊、治療動脈粥樣硬化或?qū)⑵鸬椒e極作用。

4.2 轉(zhuǎn)錄因子 STAT6作為STAT家族成員在細胞分化和細胞因子產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用［35］。據(jù)報道，高脂喂食ApoE-/-小鼠建立動脈粥樣硬化模型后，易損斑塊中CD86、iNOS 表達升高，Arg-1、TGF-β 表達降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，易損斑塊中STAT6 及磷酸化STAT6 表達降低，穩(wěn)定斑塊中STAT6 及M2 型標志物CD163上升［36］。STAT6在動脈粥樣化中的作用在其他報道中也得到了證實。王凌等［37］研究脂連蛋白對動脈粥樣硬化小鼠的作用，發(fā)現(xiàn)脂連蛋白可能通過上調(diào)p-STAT6 表達誘導脂肪組織巨噬細胞M2型極化，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

糖原合酶激酶-3α（glycogen synthase kinase-3α，GSK-3α）參與糖原合酶合成及細胞增殖、分化［38］。MCALPINE 等［39］建 立 了 骨 髓 特 異 性 敲 除GSK3α（LMαKO）的LDLR-/-小鼠模型，結(jié)果表明，LMαKO小鼠巨噬細胞中GSK3α 缺失可顯著增強STAT3 和STAT6 磷酸化，最終減弱M1 型標志物CD36 表達，同時促進M2 型標志物Arg-1、Pgc1 表達，提示巨噬細胞GSK3α對斑塊的穩(wěn)定可能有影響。

轉(zhuǎn)錄因子Mafb 屬于Maf 家族，Mafb 在造血骨髓細胞中高表達，對單核巨噬細胞譜系建立和維持起重要作用［40］。KIM 等［41］通過慢病毒技術(shù)將Mafb 導入小鼠骨髓來源巨噬細胞，檢測不同表型巨噬細胞標志物表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mafb 抑制M1 型巨噬細胞標志物表達，促進M2 型標志物表達，進一步研究表明，Mafb 通過IL-4/STAT6 通路調(diào)節(jié)巨噬細胞向M2型極化，在RAW264.7 巨噬細胞中也得出了同樣結(jié)果，提示Mafb 可能對動脈粥樣硬化斑塊進展起保護作用。其他轉(zhuǎn)錄因子如同源盒A5（homeobox A5，HOXA5）是同源盒轉(zhuǎn)錄因子之一，與巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換密切相關(guān)［41］。最近研究證實HOXA5 通過激活頸動脈轉(zhuǎn)錄輔激活子1（mediator subunit 1，MED1）促進動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)換，延 緩 動 脈 粥 樣 硬 化 進 展［42］。Krüppel 樣 因 子4（KLF4）是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，屬于KLF4 轉(zhuǎn)錄因子家族。已有研究表明KLF4 可調(diào)節(jié)巨噬細胞極化［43］。LIAO 等［44］研究卡利司?。↘S）這種組織激肽酶結(jié)合蛋白和絲氨酸蛋白酶抑制劑時，發(fā)現(xiàn)KS通過激活KLF4 調(diào)節(jié)巨噬細胞M1/M2 比例延緩ApoE-/-小鼠斑塊形成速度。

4.3 核受體 過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）是核激素受體家族中的配體激活受體，具有抗炎活性［45］。研究表明，PPAR-γ 能促進單核細胞向M2 型巨噬細胞分化［46］。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)瑞舒他汀通過激活PPAR-γ 促進人外周血單核細胞中M2 型標志物CD206、IL-10、CCL18 表達增加，從而治療動脈粥樣硬化［47］。

NR4A 家族核受體Nurr1、Nur77 和NOR1 在人動脈粥樣硬化病變的巨噬細胞中表達［48-49］。研究表明，LDLR-/-小鼠中Nur77缺失可促進巨噬細胞向M1型極化，從而導致動脈粥樣硬化病變增加［49］。NOR1 高表達于人動脈粥樣斑塊中CD68+CD206+（M2 型巨噬細胞）富集區(qū)域，沉默NOR1 后，M2 型標志物CD206、IL-1Ra、CD200R、F13A1、IL-10 水平降低。另外，全基因組芯片分析顯示，在M2 巨噬細胞中沉默NOR1后，MMP-9上調(diào)較為明顯。提示NOR1可誘導人巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化，并通過調(diào)控MMP-9影響斑塊穩(wěn)定性。

4.4 硫氧還原蛋白 Thioredoxin-1（Trx-1）是一種分子量為12 kD、高度保守的氧化應激抑制蛋白，具有抑炎、抗凋亡等作用［50］。Trx-1 能減少過氧化，下調(diào)IL-4 刺激的巨噬細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p16INK4a 表達，或在LPS 誘導的巨噬細胞中降低AP-1 和Ref-1 表達，最終調(diào)節(jié)巨噬細胞向M2型極化。動物實驗表明，Trx-1 與M2 型巨噬細胞共定位于動脈粥樣硬化病變部位，顯著減緩動脈粥樣硬化病變，提示Trx-1 可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞向M2 型極化延緩動脈粥樣硬化發(fā)展［51］。近年Trx-1 的截短形式Trx-80對動脈粥樣硬化的作用也有研究。Trx-80是由1～80 或1～84 個N-端氨基酸組成的C 端截短形式，具有細胞激酶樣活性，被未知的酶在細胞表面切割，具有細胞因子樣活性［52］。據(jù)報道，巨噬細胞會切割全長Trx-1 產(chǎn)生Trx-80。MAHMOOD 等［53］證實Trx-80 可促進M1 型巨噬細胞分化并促進動脈粥樣硬化發(fā)展。

4.5 KCa3.1 通道 KCa3.1 即中間電導鈣激活鉀通道，是信號級聯(lián)的一部分，在許多免疫細胞（包括T細胞、B細胞、小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞）活化、增殖、細胞因子分泌和體積調(diào)節(jié)過程中調(diào)控相對全局和長時間的鈣升高［54］。RENDE 等［55］為探究KCa3.1通道在巨噬細胞極化中的作用及其與動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的關(guān)系，采用聯(lián)合結(jié)扎ApoE-/-小鼠左腎動脈和左頸總動脈的方法建立斑塊不穩(wěn)定模型，發(fā)現(xiàn)在人單核細胞向巨噬細胞分化過程中，KCa3.1表達顯著上調(diào)，阻斷KCa3.1可抑制STAT-1磷酸化，顯著降低巨噬細胞極化過程中促炎基因表達，抑制巨噬細胞向M1型分化，動物模型中，KCa3.1阻斷治療可顯著降低與M1 巨噬細胞極化相關(guān)標志物表達，增強動脈粥樣硬化病變中M2 型標志物表達，降低頸動脈斑塊破裂和管腔血栓發(fā)生率。

4.6 免疫蛋白酶體 26S 蛋白酶體復合物是UPS的蛋白水解中心，通常由3個催化亞基β1（PSMB6）、β2（PSMB7）和β5（PSMB5）組成，LMP10 是β2 受炎癥刺激后的誘導形式［56］。研究報道，LMP10 缺失顯著降低了主動脈巨噬細胞浸潤，M2/M1 升高，同時促炎M1 細胞因子MCP-1、IL-1 和IL-6 表達降低，抗炎M2 細胞因子IL-4 和IL-10 表達增加，斑塊壞死核心面積明顯減少［57］。ox-LDL 誘導的體外泡沫細胞形成過程中，LMP10 缺失減弱了巨噬細胞極化和炎癥，與IκBα降解和NF-κB激活降低有關(guān)。免疫蛋白酶體亞基LMP10 可能通過調(diào)節(jié)NF-κB 介導的巨噬細胞極化和炎癥，促進飲食誘導的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化。靶向LMP10 可能是動脈粥樣硬化的治療方法。

4.7 HIF-1α/PDK4途徑 最近研究發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終產(chǎn)物刺激巨噬細胞極化后會促進動脈粥樣硬化發(fā)展。其中缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的兩種關(guān)鍵蛋白。進一步研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病ApoE-/-小鼠頸動脈中AGEs 表達和M1 巨噬細胞數(shù)量增加，此外，AGE-牛血清白蛋白通過HIF-1α/PDK4 軸誘導RAW264.7向M1型轉(zhuǎn)化［10］。因此，靶向巨噬細胞的HIF-1α 或PDK4降低M1型巨噬細胞表達，可能有助于糖尿病動脈粥樣硬化治療。

4.8 其他 SIRT2 是一種NAD+依賴性脫乙酰酶，參 與 調(diào) 節(jié) 巨 噬 細 胞 極 化。ZHANG 等［58］用 雌 性LDLR-/-小鼠研究SIRT2 對動脈粥樣硬化的作用，發(fā)現(xiàn)SIRT2 能抑制LDLR-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊進展和增強斑塊穩(wěn)定性，其作用與抑制巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化有關(guān)。

高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）能夠清除細胞中多余的膽固醇，對動脈粥樣硬化起保護作用。SANSON等［59］用IL-4及HDL聯(lián)合IL-4分別處理小鼠原代巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)HDL、IL-4 共處理組M2 型標志物Arg-1 和Fizz-1 轉(zhuǎn)錄水平更高，iNOS、IFN-γ 轉(zhuǎn)錄水平降低。進一步提取STAT6-/-小鼠巨噬細胞檢測各組轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)IL-4 或HDL 作用被抑制［58］。說明HDL 增加M2 型標志物表達、發(fā)揮抗炎作用需要STAT6參與。

肝 細 胞 生 長 因 子（hepatocyte growth factor，HGF）也稱肝細胞生長素，廣泛表達于各種組織和細胞，具有保護血管內(nèi)皮細胞、抗炎、抗凋亡等作用。張亮等［60］用新西蘭兔建立動脈粥樣硬化模型研究HGF 對巨噬細胞表型及斑塊穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，HGF 可抑制M1 型巨噬細胞浸潤，誘導M2 型巨噬細胞分化，增加斑塊膠原纖維和VSMCs含量，增強斑塊穩(wěn)定性，延緩動脈粥樣硬化發(fā)展。但HFG 如何促進M1 型向M2 型轉(zhuǎn)化的機制有待進一步研究。

5 小結(jié)

綜上，巨噬細胞極化狀態(tài)，尤其是M1/M2 比例對斑塊的穩(wěn)定性影響重大。研究已證實一定條件下，使M1 型巨噬細胞向M2 型巨噬細胞轉(zhuǎn)換有利于提高斑塊穩(wěn)定性，但M2 型中不同亞型細胞對斑塊的作用是否一致還不明確，相關(guān)機制也有待進一步研究。此外，巨噬細胞其他表型如M4、Mox、Mhem、M（Hb）型均與斑塊穩(wěn)定性相關(guān)（圖1）。鑒于巨噬細胞的可塑性及其在動脈粥樣硬化中的關(guān)鍵作用，以巨噬細胞表型調(diào)控為切入點或許能為動脈粥樣硬化靶向治療或新藥研發(fā)提供新的思路。

圖1 巨噬細胞不同表型對斑塊的作用Fig.1 Effects of different phenotypes of macrophages on plaque