酸棗仁湯醇提取物與經(jīng)典方劑的非臨床安全性比較試驗

雷夏凌,林靖,柳璐,黃遠(yuǎn)鏗,郭健敏,楊威

(廣州灣區(qū)生物醫(yī)藥研究院,廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司,廣東省藥物非臨床評價研究企業(yè)重點實驗室,國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評價分中心,廣東省創(chuàng)新藥物評價與研究工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州 510990)

我國的二十大報告中提出了“推進(jìn)健康中國建設(shè),促進(jìn)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展”,中醫(yī)藥發(fā)展有著數(shù)千年的歷史,而經(jīng)典方劑在應(yīng)用上積累了豐富的經(jīng)驗,有著巨大的開發(fā)價值。經(jīng)典方劑為中醫(yī)經(jīng)典醫(yī)著《傷寒論》《金匱要略》《溫病學(xué)》所記載而獲名,我國史上有文字記載的古代經(jīng)典方劑有近10萬個,但僅很小部分進(jìn)行了現(xiàn)代的研究開發(fā),其主要原因為基礎(chǔ)研究不足,特別是非臨床研究數(shù)據(jù)的匱乏,多數(shù)常用中藥沒有科學(xué)、規(guī)范的現(xiàn)代毒理研究數(shù)據(jù)及比較試驗,以至于無法進(jìn)行科學(xué)、合理的質(zhì)控和風(fēng)險監(jiān)管。國務(wù)院在2017年發(fā)布的《關(guān)于深化審評審批制度改革鼓勵藥品醫(yī)療器械創(chuàng)新的意見》提出鼓勵運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究開發(fā)傳統(tǒng)中成藥,《中華人民共和國中醫(yī)藥法》(2017年)也指出古代經(jīng)典名方的中藥復(fù)方制劑,在申請藥品批準(zhǔn)文號時,可以僅提供非臨床安全性研究資料,積極推動了古代經(jīng)典名方傳承創(chuàng)新,拓展了古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑的內(nèi)涵。

來源于《金匱要略》的酸棗仁湯,用于治療肝血不足、虛熱內(nèi)擾引起的虛煩不得眠癥的經(jīng)典方劑,現(xiàn)代藥理研究也表明,酸棗仁湯具有治療失眠、抗焦慮、抗抑郁、神經(jīng)官能癥等作用,療效確切[1-3]。當(dāng)今睡眠障礙為全球性嚴(yán)重問題,直接影響人類身心健康,臨床治療以苯二氮類藥物為主,不良反應(yīng)較多,酸棗仁湯作為經(jīng)典方劑應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)且安全有效[4-7],具有臨床價值,但至今仍未廣泛應(yīng)用的中藥制劑[8]。本實驗受試物為酸棗仁湯醇提取物,應(yīng)用現(xiàn)代分離分析技術(shù)篩選、提取和分離出的有效部位正丁醇和多糖,具有質(zhì)量可控、減少服用量及藥效試驗效果顯著的優(yōu)勢,為了進(jìn)一步論證其安全性,開展酸棗仁湯醇提取物亞急性毒性試驗研究,并與傳統(tǒng)工藝的酸棗仁湯經(jīng)典方劑比較,為其進(jìn)一步的研究開發(fā)提供依據(jù),具有創(chuàng)造性價值。

1 實驗材料

1.1 藥物及制備酸棗仁湯醇提取物由酸棗仁、知母、川芎、茯苓、甘草組成,沈陽藥科大學(xué)提供,批號:201604001;臨床擬定用法或用量為口服,每天2～4次,每次39 g生藥。酸棗仁湯經(jīng)典方劑由原沈陽軍區(qū)總醫(yī)院配制,批號:20151212,8 g/袋。臨床用法或用量為開水沖服,一次1袋或1次1～2袋,睡前服用。酸棗仁湯醇提取物、酸棗仁湯經(jīng)典方劑均使用0.5% CMC-Na溶液配制所需濃度。

1.2 實驗動物SD大鼠,SPF級,購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,5周齡,體重150～220 g,72只,雌雄各半,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2016-0002,實驗動物質(zhì)量合格證明號:43004700038208、43004700022903。動物飼養(yǎng)于SPF級動物房,實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2015-0146,所有環(huán)境技術(shù)指標(biāo)均符合GB14925-2010屏障環(huán)境技術(shù)要求。本研究實驗動物的申請和使用已通過本機(jī)構(gòu)IACUC的同意和認(rèn)可。

1.3 儀器SYSMEX XT-2000i型血液分析儀;日立7020全自動生化分析儀;SYSMEX CA1500全自動血凝分析儀;BSA2201、BSA2202S、SQP PRACTUM5100-1CN、BSA423S電子天平。

2 實驗方法

2.1 酸棗仁湯醇提取物對SD大鼠亞急性毒性試驗試驗選取適應(yīng)性觀察合格的SD大鼠40只,按體重隨機(jī)均衡分成4組,分別為陰性對照組、酸棗仁湯醇提取物低、中、高劑量組,各組劑量分別為42.06、98.28、140.53 g·kg-1(生藥)組,140.53 g·kg-1(生藥)組原劑量為196.465 g·kg-1(生藥),按最大給藥劑量設(shè)置,可引致3/10例動物在給藥3 d后死亡,停藥2 d后,從第6天起劑量下調(diào)到140.53 g·kg-1(生藥),各組均以15 mL·kg-1灌胃給藥,每天2次,連續(xù)給藥28 d。試驗期間,按《藥物重復(fù)給藥毒性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》(2014.5)要求,每天觀察動物的外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便性狀、死亡情況等,每周測定動物攝食量及體重,每周按體重調(diào)整給藥量。在給藥第28天后處死動物,進(jìn)行血液學(xué)、血液生化學(xué)、病理學(xué)等各項檢查。

2.2 酸棗仁湯經(jīng)典方劑對SD大鼠亞急性毒性試驗試驗選取適應(yīng)性觀察合格的SD大鼠32只,按體重隨機(jī)均衡分成4組,分別為陰性對照組、酸棗仁湯經(jīng)典方劑低、中、高劑量組,各組劑量分別為56.12、140.29、224.46 g·kg-1(生藥)組,224.46 g·kg-1(生藥)為最大給藥劑量,140.29 g·kg-1(生藥)設(shè)置考慮與酸棗仁湯醇提取物高劑量組平行,各組均以15mL·kg-1灌胃給藥,各組每天灌胃給藥兩次,連續(xù)給藥28 d。試驗期間,按“2.1”項下要求觀察、測量、調(diào)整給藥量,并進(jìn)行各項檢查。

3 結(jié)果

3.1 酸棗仁湯醇提取物對SD大鼠亞急性毒性試驗

3.1.1 臨床觀察高劑量組從給藥第2天開始,全部動物陸續(xù)出現(xiàn)豎毛、少動、弓背、局部毛稀疏、肛門周圍附著褐色液體狀排泄物等癥狀;在第4天,3/10例動物(♀2、3、5)出現(xiàn)死亡。中劑量組從給藥第3天起開始,7/10例動物陸續(xù)出現(xiàn)豎毛、局部毛稀疏等癥狀。低劑量組從給藥第18天開始,3/10例動物陸續(xù)出現(xiàn)局部毛稀疏的癥狀。以上變化給藥期間未見恢復(fù)。

3.1.2 攝食量及體重各給藥組攝食量各檢測時間點未見明顯異常變化。高劑量組雌性動物在第7天體重呈現(xiàn)負(fù)增長且明顯輕于陰性對照組;高劑量組雄性動物在第7、21、28天的體重及末期增重均低于陰性對照組。

表1 酸棗仁湯醇提取物連續(xù)28 d經(jīng)口給藥對SD大鼠體重的影響

3.1.3 血液學(xué)檢查高劑量組雄性動物白細(xì)胞數(shù)(WBC)升高,紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白量(HGB)有所降低。高劑量組雌、雄性動物網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)(RET)及比率、中性粒細(xì)胞數(shù)(NEUT)升高。

表2 酸棗仁湯醇提取物連續(xù)28天經(jīng)口給藥對SD大鼠血液學(xué)的影響

3.1.4 生化學(xué)檢查高、中劑量組雌性動物及高劑量組雄性動物的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)有所升高,高、中劑量組雄性動物甘油三酯(TG)降低,以上變化在正常變化范圍內(nèi)。

3.1.5 臟器重量和臟器系數(shù)高、中劑量雌性動物肝臟有所增重,高、中劑量雄性動物胸腺減輕。

3.1.6 病理學(xué)檢查各組存活動物系統(tǒng)解剖均未見異常。死亡動物系統(tǒng)解剖發(fā)現(xiàn),2例動物出現(xiàn)肺部淤血、胃脹氣,1例動物出現(xiàn)胃脹氣的改變。對死亡動物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),1例動物(高劑量♀3)出現(xiàn)肝點灶性壞死;2例動物(高劑量♀3、♀5)出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞變性壞死、空泡變性。致死原因可能與腎功能障礙相關(guān),詳見圖1～3。

圖1 高劑量雌性3號:肝臟點灶性壞死(H-E染色,200×)

圖2 高劑量雌性3號:腎小管上皮細(xì)胞空泡變性壞死(H-E染色,100×)

圖3 高劑量雌性5號:腎小管上皮細(xì)胞空泡變性壞死(H-E染色,200×)

3.2 酸棗仁湯經(jīng)典方劑對SD大鼠亞急性毒性試驗

3.2.1 臨床觀察酸棗仁經(jīng)典方劑低、中、高劑量組動物臨床觀察中有個別動物出現(xiàn)軟便癥狀。

3.2.2 攝食量及體重給藥期間,酸棗仁經(jīng)典方劑湯低、中劑量組雌雄動物與陰性對照組攝食量相近,未見明顯差異。酸棗仁湯經(jīng)典方劑高劑量組雄性動物體重增長減慢。

表3 酸棗仁湯醇提取物連續(xù)28 d經(jīng)口給藥對SD大鼠生化學(xué)的影響

表4 酸棗仁湯醇提取物連續(xù)28 d經(jīng)口給藥對SD大鼠臟器重量、臟體系數(shù)、臟腦系數(shù)的影響

3.2.3 血液學(xué)檢查高劑量組雄性動物RET、RET%升高,高劑量組雌性動物RBC、HGB與HCT降低。

3.2.4 生化學(xué)檢查各劑量組各指標(biāo)均未見明顯異常。

3.2.5 臟器重量和臟器系數(shù)酸棗仁湯經(jīng)典方劑低、中劑量組可見雌性動物肝臟有所增重,但無劑量-反應(yīng)關(guān)系,且肝功能指標(biāo)未見異常,以上變化無生物學(xué)意義。

3.2.6 病理學(xué)檢查各組存活動物系統(tǒng)解剖均未見明顯異常改變。

表5 酸棗仁湯經(jīng)典方劑連續(xù)28 d經(jīng)口給藥對SD大鼠體重的影響

表6 酸棗仁湯經(jīng)典方劑連續(xù)28 d經(jīng)口給藥對SD大鼠血液學(xué)紅細(xì)胞的影響

表7 酸棗仁湯經(jīng)典方劑連續(xù)28 d經(jīng)口給藥對SD大鼠血清生化的影響

表8 酸棗仁湯經(jīng)典方劑連續(xù)28 d經(jīng)口給藥對SD大鼠臟器重量、臟器系數(shù)的影響

4 討論與結(jié)論

酸棗仁湯來源于醫(yī)圣張仲景的《金匱要略血痹虛勞病脈證并治》的失眠名方,現(xiàn)代研究表明其主要活性成分為多糖、黃酮、皂苷、生物堿、三萜等,具有抗抑郁、增強學(xué)習(xí)能力、治療失眠等藥理作用[9]。有關(guān)酸棗仁湯的動物毒性試驗文獻(xiàn)報道較少,王麗娟等[10-11]進(jìn)行酸棗仁油和酸棗仁提取物急性毒性、長期毒性試驗,研究結(jié)果均未見明顯異常。

本研究中酸棗仁湯提取物為酸棗仁湯醇提取液,按原方配比,五味中藥以現(xiàn)代分離方法提取其中的有效成分并進(jìn)行定量所得的有效部分,以期運用新技術(shù)新工藝的優(yōu)勢開發(fā)中藥創(chuàng)新藥;酸棗仁湯顆粒劑經(jīng)典方劑為酸棗仁湯方劑傳統(tǒng)水煎的濃縮液。本毒性試驗結(jié)果表明,酸棗仁湯醇提取物連續(xù)給藥28 d,以臨床用量的14倍即196 g生藥/kg給藥3 d致SD大鼠出現(xiàn)死亡,致死原因可能與腎功能障礙相關(guān),降低劑量為140 g生藥/kg即臨床用量的10倍動物仍出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng),其對SD大鼠的NOAEL為98.28 g生藥/kg;酸棗仁湯經(jīng)典方劑連續(xù)給藥28 d,酸棗仁湯顆粒劑經(jīng)典方劑以224 g生藥/kg、140 g 生藥/kg為臨床用量的16、10倍給藥1個月,動物未見出現(xiàn)死亡和明顯毒性反應(yīng),對SD大鼠的NOAEL為224.6 g生藥/kg;兩個受試物高劑量組動物均出現(xiàn)紅細(xì)胞數(shù)量的輕度減少及骨髓造血功能(紅細(xì)胞系)代償性升高,酸棗仁湯醇提取物非臨床安全性研究存在較大的安全性風(fēng)險,毒性反應(yīng)明顯大于經(jīng)典方劑。上述試驗結(jié)果提示,酸棗仁湯顆粒劑經(jīng)典方劑的毒性明顯高酸棗仁湯新工藝提取物,表現(xiàn)為輕度貧血和腎功能障礙,未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報道,具體機(jī)理不明確,酸棗仁湯出現(xiàn)了非傳統(tǒng)工藝下復(fù)方制劑的毒性,表現(xiàn)為方與藥毒性分離,分析產(chǎn)生的原因可能如下:經(jīng)典傳統(tǒng)方劑通過配伍、制劑、用量限制了單味藥的毒性,而新工藝提取有效部位可能引起配伍、制劑等失當(dāng),致全方毒性增強或出現(xiàn)單味中藥無關(guān)的毒性。

因此,酸棗仁湯以古代經(jīng)典傳統(tǒng)方劑進(jìn)行二次開發(fā)時,需考慮中藥多成分、多靶點、多效應(yīng)的物質(zhì)內(nèi)涵,往往工藝、用量等改變會影響其藥效與毒效,因此需深化非臨床安全性研究。由于酸棗仁湯新工藝提取物非臨床安全性研究存在較大的安全性風(fēng)險,需進(jìn)行研究開發(fā)策略的調(diào)整,本品不建議進(jìn)行中藥創(chuàng)新藥的注冊申報,但可開展古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑的申報的研究開發(fā),并繼續(xù)對酸棗仁湯的有效成分、作用機(jī)理及其代謝過程的繼續(xù)進(jìn)行深入的研究和探討,為臨床提供足夠的理論依據(jù)。