基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制

馮平，李曉峰，霍樂樂

河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院），鄭州 450016

近年來，骨質(zhì)疏松癥已成為老年人群和絕經(jīng)后婦女的重要公共衛(wèi)生問題之一。骨質(zhì)疏松癥會增加骨折風(fēng)險，因而在世界范圍內(nèi)越來越受到重視［1-2］。隨著老齡化進(jìn)程的加快，我國骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率逐年上升。據(jù)報道，2016年我國60歲以上人群骨質(zhì)疏松癥的患病率為36%，估計到2050年將有599萬以上的老年人出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折，給全社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和醫(yī)療負(fù)擔(dān)［3-4］。因此，迫切需要開發(fā)有效的治療策略來干預(yù)和治療骨質(zhì)疏松癥。

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，多味中藥已被證實在治療骨質(zhì)疏松癥、骨折、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種骨科相關(guān)疾病時具有療效較佳、不良反應(yīng)較少的優(yōu)點［5-7］。也有大量的研究表明，有些中藥能夠通過改善腸道對鈣離子的吸收、促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟、增強(qiáng)細(xì)胞的成骨活性以及抑制破骨細(xì)胞的形成來預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥［8-9］。因此積極尋找具有治療骨質(zhì)疏松癥作用的中藥并明確其有效成份是當(dāng)前的研究熱點之一。

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoder-masinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子實體，別名赤芝、木靈芝等，味甘，性平，歸心、肺、肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘的功效。目前已從靈芝中分離并鑒定出靈芝多糖、靈芝酮三醇等400多種化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，靈芝具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化、抗衰老等多種生物學(xué)活性［10］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載其“利關(guān)節(jié)，保神，益精氣，堅筋骨……久食輕身不老，延年神仙”［11］，提示其在骨質(zhì)疏松癥等衰老性疾病的治療中有巨大潛力。然而靈芝的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，其抗骨質(zhì)疏松作用的靶點及機(jī)制也有待深入研究，這在一定程度上限制了其在臨床上的推廣和應(yīng)用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在經(jīng)典藥理學(xué)、計算機(jī)技術(shù)和生物信息學(xué)等多學(xué)科交叉融合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，它可以從多個方面系統(tǒng)地研究藥物與人體之間的相互作用及規(guī)律。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有助于探索藥物發(fā)揮療效的多種作用途徑和（或）信號通路，該策略已被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥多成份、多靶點、多路徑、多功能研究及中藥配方分析、新藥開發(fā)等領(lǐng)域［7］?；诖耍狙芯客ㄟ^運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)地探討了靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的生物學(xué)機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 收集、篩選靈芝的活性成份及作用靶點

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/molecule.php?qn=7088），基于吸收、分布、代謝及排泄等藥代動力學(xué)參數(shù)，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥 物 相 似 性（drug-likeness，DL）≥0.18為限定條件篩選得到靈芝中的潛在活性成份。將獲得的活性成份輸入PubChem數(shù) 據(jù) 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到其相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)，并保存為SMILES格式。為了確定靈芝的潛在靶標(biāo)，將篩選得到的活性成份的SMILES文件逐一輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），限定物種為“homo sapiens”，通過整合去重后得到靈芝主要活性成份的預(yù)測靶點。應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對預(yù)測的靶點進(jìn)行人類基因名轉(zhuǎn)換。

1.2 骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點的篩選

以“osteoporosis”為關(guān)鍵檢索詞，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）中檢索并篩選骨質(zhì)疏松癥已知的疾病靶點，整合兩個數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果并刪除重復(fù)靶點，得到已知的與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)的疾病靶點。

1.3 構(gòu)建“靈芝活性成份-骨質(zhì)疏松癥-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)

將靈芝活性成份與骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件并構(gòu)建“靈芝活性成份-骨質(zhì)疏松癥-共同靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）

通過Bioinformatics and Evolutionary Genomics在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將靈芝主要活性成份的潛在作用靶點與骨質(zhì)疏松癥已知靶點進(jìn)行映射取交集，提取共同的靶基因。將共同的靶基因上傳到String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），物種選擇“homo sapiens”，獲取蛋白質(zhì)相互作用信息，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件，構(gòu)建PPI并進(jìn)行可視化展示，同時對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.5 靈芝治療骨質(zhì)疏松癥關(guān)鍵靶點通路與功能富集分析

將靈芝中活性成份和骨質(zhì)疏松癥共同靶點作為關(guān)鍵靶點，通過David數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），限定物種為“homo sapiens”，對關(guān)鍵靶點進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，得到共同靶點富集最具顯著性的生物學(xué)注釋。其中，GO分析包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能，以P＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)；KEGG分析以P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 靈芝活性成份及其作用靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到靈芝中的242種化學(xué)成份，經(jīng)篩選后得到61種靈芝活性成份。利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測靈芝中所有活性成份的作用靶點，去除無效和重復(fù)靶點后，61種活性成份共涉及107個作用靶點。

2.2 靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶點

通過檢索、合并、去重后共獲得478個骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點，將其與靈芝活性成份作用靶點相映射并繪制Venn圖（圖1），獲得21個共同靶基因，包 括NR3C1、AR、HSD11B1、PGR、NOS3、CYP19A1、TACR3、CYP17A1、LDLR、ESR1、ESR2、CNR1、CNR2、VDR、HIF1A、NR1I2、MMP1、PTPN11、GC、MAPK1、MAPK3。

圖1 靈芝活性成份作用靶點與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點的交集

2.3 “靈芝活性成份-骨質(zhì)疏松癥-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)

將靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的活性成份及作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，得到“靈芝活性成份-骨質(zhì)疏松癥-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖2）。結(jié)果表明，β-谷甾醇（beta-sitosterol）、環(huán)氧靈芝醇B （epoxyganoderiol B）、環(huán)氧靈芝醇C（epoxyganoderiol C）、麥角甾-4,7，22-三 烯-3，6-二 酮（ergosta-4,7,22-trien-3,6-dione）、靈芝酮三醇（ganodermatriol）、靈芝醇A（ganodermenonol）、Lucialdehyde A、Lucialdehyde B能與6個以上的靶點相連接，是靈芝治療骨質(zhì)疏松癥時的主要活性成份。

圖2 “靈芝活性成份-骨質(zhì)疏松癥-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.4 靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點蛋白

將靈芝與骨質(zhì)疏松癥映射得到的21個共同靶基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫并繪制靈芝-骨質(zhì)疏松癥的PPI（圖3）。在PPI中，去除2個孤立蛋白節(jié)點后，共有21個節(jié)點通過126條邊發(fā)生相互作用。通過分析拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，篩選得到MAPK3、MAPK1、NR3C1、ESR1、AR、CYP19A1、NOS3、HIF1A等共19個靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點蛋白（表1）。

表1 靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點蛋白

圖3 靈芝-骨質(zhì)疏松癥的PPI圖

2.5 GO分析和KEGG分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的21個共同靶基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。在GO分析中，選取富集程度最高的20個生物過程進(jìn)行展示（圖4），結(jié)果顯示靈芝主要涉及核受體的活性（nuclear receptor activity）、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、類固醇結(jié)合（steroid binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性（DNA-binding transcription activitor activity）、RNA特異性聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ-specific）等生物過程。

圖4 靈芝活性成份關(guān)鍵靶點GO生物過程富集分析

在KEGG分析中，按照P值大小進(jìn)行排序，選取富集程度最高的前20條信號通路展示（圖5），結(jié)果顯示靶基因主要富集在催乳素信號通路（prolactin signaling pathway）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma）、乳腺癌（breast cancer）等信號通路。

圖5 靈芝活性成份關(guān)鍵靶點的KEGG 代謝通路富集分析

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性代謝性骨病，其特征在于骨密度降低和脆性骨折風(fēng)險增加。隨著人類壽命延長和老齡化進(jìn)程加快，骨質(zhì)疏松癥已成為重要的健康問題之一［12］。目前臨床上所使用的降鈣素、雙膦酸鹽、雌激素等抗骨質(zhì)疏松藥物大多數(shù)通過抑制破骨細(xì)胞活性發(fā)揮作用［13］，長期應(yīng)用抗骨質(zhì)疏松藥物會增加乳腺癌、前列腺癌的患病風(fēng)險，并易導(dǎo)致下頜骨壞死等不良反應(yīng)［14］。因此，從中醫(yī)藥中尋找能夠有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的提取物是一種新的治療策略。

靈芝對免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)等都具有調(diào)節(jié)作用［10］。近年來，不少研究提示靈芝具有抗骨質(zhì)疏松的作用［15］，但靈芝活性成份復(fù)雜，其在體內(nèi)多成份、多靶點、多途徑的藥理特征尚未得到深入研究。本研究利用系統(tǒng)和規(guī)范的生物信息學(xué)方法來挖掘多種數(shù)據(jù)庫，整合和分析靶蛋白和化合物的信息，對闡明靈芝抗骨質(zhì)疏松的作用靶點及分子機(jī)制具有重要意義。

在本研究中，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過藥代動力學(xué)系統(tǒng)評估、PPI分析以及GO、KEGG分析，初步研究了靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的有效成份和潛在靶點。本研究共篩選得到61種活性成份、107個活性成份可能的作用靶點以及478個骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點?！办`芝活性成份-骨質(zhì)疏松癥-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)分析顯示β-谷甾醇、環(huán)氧靈芝醇B、環(huán)氧靈芝醇C、麥角甾-4，7，22-三烯-3，6-二酮、靈芝酮三醇、靈芝醇A、Lucialdehyde A、Lucialdehyde B等活性成份能協(xié)同作用于多個靶點，表明靈芝在治療骨質(zhì)疏松癥過程中具有多成份、多靶點交互作用的特性。進(jìn)一步對21個靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的共同靶基因進(jìn)行PPI分析，結(jié)果表明MAPK3、MAPK1、ESR1、NR3C1、AR、CYP19A1、NOS3、HIF1A在交互網(wǎng)絡(luò)中具有最高權(quán)重，提示其可能是靈芝治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點蛋白。MAPK3、MAPK1基因編碼的MAPK1和MAPK3屬于蛋白激酶，是MAPK信號通路中的重要分支之一，在細(xì)胞增殖、分化中起重要作用。MAPK1/MAPK3與細(xì)胞分化及骨形成密切相關(guān)。MAPK1/MAPK3被磷酸化后能夠調(diào)節(jié)成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子 RUNX2及其下游OSX基因的表達(dá)，上調(diào)成骨分化標(biāo)志物堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟及基質(zhì)的礦化［16-17］。雌激素受體（estrogen receptor，ER）屬于核受體超家族，主要存在于細(xì)胞核中，通過與雌激素結(jié)合而參與多種生理過程的調(diào)節(jié)。ESR1是ER的一個亞型，在皮質(zhì)骨中高表達(dá)。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，ESR1基因多態(tài)性與骨密度密切相關(guān)［18］。糖皮質(zhì)激素由于具有良好的抗炎作用而被廣泛用于自身免疫性疾病和炎癥性疾病的治療，然而長期過量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素會抑制成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。NR3C1能夠編碼糖皮質(zhì)激素受體，直接影響RANKL啟動子的活性及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致主要骨重塑途徑RANK/RANKL/OPG軸的失衡，骨吸收增加［19］。KEGG通路富集分析表明，靈芝中的生物活性成份可以通過多種途徑發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，其核心靶點主要涉及通路包括催乳素信號通路、雌激素信號通路、腎細(xì)胞癌、乳腺癌等。雌激素主要通過與ER結(jié)合來發(fā)揮其功能和作用，雌激素信號通路通常在骨質(zhì)疏松癥中出現(xiàn)失調(diào)，絕經(jīng)后女性會由于體內(nèi)雌激素水平的下降而發(fā)生骨重建失衡、骨吸收增加［20］。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選了靈芝中的活性成份及其潛在靶點，揭示了靈芝發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的潛在機(jī)制可能是基于其對潛在靶點和通路的直接或間接調(diào)控，體現(xiàn)了靈芝多成份、多靶點、多途徑的治療特點。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為靈芝治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的思路和方向，但仍需相關(guān)體外的細(xì)胞功能實驗、體內(nèi)的骨質(zhì)疏松模型實驗進(jìn)行驗證。