免疫親和柱凈化-親水液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中的三聚氰胺

◎ 尹玉云，曲凌玄，王雅楠，張培毅，凡 猛， 陶 健

（1.河南省食品和鹽業(yè)檢驗技術研究院，河南 鄭州 450003；2.河南省特殊食品工程技術研究中心，河南 鄭州 450003；3.國家市場監(jiān)管重點實驗室(食品安全快速檢測與智慧監(jiān)管技術)，河南 鄭州 450003）

乳制品作為日常飲食的大宗消費品，其安全狀況關乎每一個人的健康，2008 年曝光的中國奶制品污染事件使三聚氰胺引起社會的普遍關注和重視。三聚氰胺（C3H6N6）俗稱密胺、三聚氰酰胺、蛋白精，含氮量高達66.6%，在用凱氏定氮法測定氮含量進而折算出食物總蛋白質(zhì)含量時，三聚氰胺的加入可以造成高蛋白質(zhì)的假象。然而，三聚氰胺作為一種化工原料，長期攝入可引起嬰幼兒腎結石和腎衰竭。因此，我國不允許在食品中添加三聚氰胺。目前，乳及乳制品中的三聚氰胺已成為國家食品安全抽檢及省抽檢的必檢項目，力圖通過最嚴格的監(jiān)管來保障人民群眾“舌尖上的安全”。我國衛(wèi)生部等5 部門關于三聚氰胺在食品中的限量值的公告（2011 年第10 號）中明確規(guī)定，三聚氰胺在嬰兒配方食品中的限量值為1 mg/kg，在其他食品中的限量值均為2.5 mg/kg。

國標GB/T 22388—2008 《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》提供了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的幾種測定方法，即高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。此外，還有酶聯(lián)免疫吸附法[1]、膠體金免疫層析法[2]、拉曼光譜法[3-5]、紅外光譜法[6-7]、免疫親和凝膠柱檢測方法[8]等多種檢測方法。GB/T 22388—2008作為國家食品安全抽檢的指定檢驗方法，其HPLC 方法定量準確，但其定量限為2 mg/kg，如此高的定量限決定了其不適用于嬰兒配方乳粉及三聚氰胺含量低的樣品的檢測，且HPLC 所用流動相為離子對試劑，儀器至少需要平衡5 小時方能使基線平穩(wěn)，運行一個樣品一般至少需要20～25 min；LC-MS/MS 法需要先提取、去蛋白、離心后過固相萃取柱、氮吹等諸多操作，然后用基質(zhì)標曲外標法定量，操作煩瑣、基質(zhì)干擾強、回收率低；氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法需要硅烷化衍生，采用外標法定量，操作更加煩瑣。

本文建立了一種測定牛奶中三聚氰胺的免疫親和柱凈化、內(nèi)標法定量的親水液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，與GB/T 22388—2008 中的LC-MS/MS 方法相比，該方法具有樣品用量少、前處理簡單、檢測速度快、無基質(zhì)干擾、靈敏度高、準確度高等優(yōu)點，為牛奶中三聚氰胺的快速準確檢測提供了新思路、新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；乙酸銨（色譜純）；超純水；三聚氰胺免疫親和柱（柱容量≥1 500 ng，實驗室自制）；三聚氰胺標準物質(zhì)(99.05%, DR.Ehrenstorfer)；三聚氰胺-13C3 內(nèi)標標準物質(zhì)溶液（100.0 μg/mL, A ChemTek Inc.）。

1.2 儀器與設備

SCIEX Triple Qand 5500+三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國，AB SCIEX 公司）；ME204E 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]； Mili-Q 純水儀（美國，Millipore 公司）。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 三聚氰胺標準儲備液的配制

精密稱取三聚氰胺標準物質(zhì)50 mg（精確到0.000 1 g），用50% 甲醇水溶液（1 ∶1，V/V）溶解定容，配制成1 mg/mL 標準儲備液，4 ℃冷藏保存。

1.3.2 三聚氰胺標準中間液的配制

準確移取三聚氰胺標準儲備液100 μL，50%甲醇水溶液定容，配制成1 μg/mL 三聚氰胺標準中間液，4 ℃冷藏保存。

1.3.3 三聚氰胺內(nèi)標中間液的配制

準確移取三聚氰胺內(nèi)標標準溶液1.00 mL，用50%甲醇水溶液定容，配制成1 μg/mL 三聚氰胺內(nèi)標中間液，4 ℃冷藏保存。

1.3.4 三聚氰胺工作溶液的配制

用甲醇將三聚氰胺標準中間液（濃度為1 μg/mL）逐級稀釋，得到濃度分別為1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 ng/mL 的系列標準工作溶液，其中內(nèi)標含量均為20 ng/mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品預處理

準確稱取0.5 g 樣品，用7 mL 0.01 mol/L pH 7.4 的PBS 溶液稀釋混勻后備用。

1.4.2 免疫親和柱凈化處理

將免疫親和柱從4 ℃冰箱取出，恢復至室溫。將免疫親和柱的上端塞子和下端堵頭去掉，使柱子中的保護液自然流干，加入1.4.1 的備用樣液，控制流速不超過1 滴/m。待樣液滴完后，用10 mL 超純水分兩次淋洗，待淋洗液滴完后，抽干小柱，用1 mL 甲醇洗脫，供HPLC-MS/MS 測定。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：月旭 HILIC Amide 色譜柱（2.1×100 mm，5 μm）。柱溫箱溫度：35 ℃；進樣量5 μL；流動相：A 為5 mmol/L 乙酸銨溶液，B 為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，90% B；1～2.5 min，90%～60% B；2.5～3 min，60% B；3～3.1 min，60%～90% B；3.1～6 min，90% B；流速為0.5 mL/min。

1.4.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM），正離子掃描；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃ ；具體質(zhì)譜條件見表1。

表1 三聚氰胺及其內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)表

1.5 數(shù)據(jù)處理

檢測結果由AB 數(shù)據(jù)處理軟件自動計算。采用Origin 2023 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

參考GB/T 22388—2008 和SN/T 5118—2019 《進出口食用動物、飼料中三聚氰胺殘留測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中的離子對信息，并對離子源溫度、電噴霧電壓、去簇電壓DP、碰撞電壓CE、駐留時間等參數(shù)進行優(yōu)化。根據(jù)信號響應強度，確定具體質(zhì)譜參數(shù)（見表1）。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

用三聚氰胺及內(nèi)標濃度均為20 ng/mL 的標準溶液考察三聚氰胺及其內(nèi)標在Hilic 色譜柱和C18色譜柱上的峰形、出峰時間、信號響應（MRM 色譜圖分別見圖1、圖2），發(fā)現(xiàn)三聚氰胺及其內(nèi)標在C18色譜柱上不保留，出峰時間為0.91 min，出峰快、峰拖尾，信號響應遠低于在Hilic 色譜柱的信號響應，峰形嚴重不對稱，這是由于三聚氰胺屬于強極性小分子物質(zhì)，C18色譜柱適合分離非極性或弱極性的物質(zhì)，而Hilic 色譜柱是親水作用的色譜柱，它以極性物質(zhì)為固定相，高比例極性有機溶劑和低比例水相為流動相，非常適用于強極性化合物的分離[9-10]，故本試驗選擇Hilic 色譜柱作為分離柱。

圖1 三聚氰胺及其內(nèi)標在C18 色譜柱上的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖

圖2 三聚氰胺及其內(nèi)標在Hilic 色譜柱上的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖

2.3 樣品處理方法優(yōu)化

根據(jù)Design-expert 中心組合試驗設計原理，分析樣品稱樣量、上柱體積、沉淀劑用量單因素試驗結果，以三聚氰胺回收率為響應值（每份含100 ng 的三聚氰胺和20 ng 的三聚氰胺內(nèi)標），采用三因素三水平的響應面分析方法分析不同因素的交互影響。根據(jù)軟件設計的試驗組方案進行試驗后，測得三聚氰胺回收率結果如表2 所示。

表2 響應面設計方案與測定結果表

根據(jù)17 組試驗結果，使用軟件回歸擬合分析，得出3 種因素變量和三聚氰胺回收率關系，用函數(shù)表示：Y=98.92-0.037 5A+6.33B+0.262 5C-0.125 0AB+0.250 0AC-0.125 0BC+0.715 0A2-6.36B2-0.785 0C2，回歸方程R2=0.991 9，P＜0.000 1，說明回歸模型為極顯著。試驗結果表明，本試驗模型能可靠表示稱樣量、上柱體積、沉淀劑用量之間的交互關系?？梢杂迷摶貧w方程對試驗結果進行分析，根據(jù)交互項方差分析結果，三因素中上柱體積P<0.000 1，表明上柱體積對三聚氰胺回收率影響作用顯著，三因素之間交互作用并不明顯。

根據(jù)回歸方程方差分析結果，軟件分析得出擬合相應曲面圖，如圖3～5 所示。從中可明顯看出，上柱體積對三聚氰胺回收率含量有顯著的影響，而樣品稱樣量及沉淀劑用量對三聚氰胺回收率影響極小。三因素中的交互作用影響并不顯著。優(yōu)化后最佳上柱體積為7.5 mL。

圖3 稱樣量-上柱體積的交互影響圖

圖4 稱樣量-沉淀劑用量的交互影響圖

圖5 上柱體積-沉淀劑用量的交互影響圖

綜上，考慮到不同樣品三聚氰胺含量不同、不同的檢測目的和需求，綜合考慮試劑用量、成本、時間等因素，本試驗樣品前處理方法確定為：稱取樣品0.5 g，加入7 mL 0.01 mol/L pH 7.4 的PBS 溶液混勻后上柱。當樣品三聚氰胺含量太高時，可選擇減少稱樣量、減少上柱體積或者將上機液進一步稀釋的方法進行測定。同時，應注意不要超過免疫親和柱的柱容量，避免因親和柱過載造成檢測結果不準確。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準工作曲線線性范圍、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

用50%甲醇水溶液配制三聚氰胺濃度分別為1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 ng/mL 的系列標準工作溶液，其中內(nèi)標含量均為20 ng/mL，按照濃度從小到大的順序上LC-MS/MS 測定，以三聚氰胺濃度為橫坐標，三聚氰胺與其內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線見圖6。線性方程為：y=0.049 92x+0.033 12，r=0.999 89，r2=0.999 74。線性范圍為1～100 ng/mL。此時，線性良好，內(nèi)標信號響應穩(wěn)定，色譜柱無過載情況。用空白基質(zhì)加標法，以信噪比S/N≥3 確定三聚氰胺的最低檢出限（LOD）為0.000 10 mg/kg，以信噪比S/N≥10 確定三聚氰胺的定量限（LOQ）為0.000 24 mg/kg，定量限（LOQ）是GB/T 22388—2008 中LC-MS/MS 法的0.024 倍，大大提高了檢測靈敏度。

圖6 三聚氰胺標準曲線圖

2.4.2 回收率和精密度

準確稱取三聚氰胺陰性純牛奶樣品0.5 g，分別加入0.5、5、50 ng 的三聚氰胺標準溶液，其中三聚氰胺內(nèi)標上機濃度均為20 ng/mL，每個濃度樣品進行6次平行測試。測得樣品的回收率平均值和精密度（相對標準偏差relative standard deviation，RSD）見表3。結果顯示，該方法的回收率為98.1%～99.2%，RSD 為1.03%～2.94%，具有較高的準確度和精密度。

表3 加標回收結果表

2.4.3 質(zhì)控樣及實際樣品測定

用本文所述方法對2021、2022 年度本單位承擔的國家食品安全抽檢及河南省食品安全抽檢中，從河南省18 個地市抽檢的滅菌乳、巴氏殺菌乳樣品各80 份進行檢測，結果均未檢出三聚氰胺。為進一步驗證方法的準確性，分別對這160 份樣品進行加標回收試驗，加標濃度為50 ng，內(nèi)標上機濃度為20 ng/mL，回收率在97.4%～100.6%，說明該方法有較高的準確性和可靠性。

用本文所述方法對購自大連中食國實檢測技術有限公司的樣品編號CFAPA-QC550A-1 牛奶中三聚氰胺質(zhì)控樣品進行檢測，檢測結果為3.09 mg/kg，質(zhì)控樣品指定值為3.12 mg/kg，檢測結果依據(jù)“z-比分數(shù)”進行評價，∣z∣=0.12，∣z∣≤2，為滿意結果，可見該方法準確度較高。

3 結論與討論

本試驗所研究的三聚氰胺免疫親和柱凈化、內(nèi)標法定量的Hilic 色譜柱-HPLC-MS/MS 方法很好地消除了GB/T 22388—2008 中LC-MS/MS 方法存在的高基質(zhì)干擾的弊端，并將定量限（LOQ）由GB/T 22388—2008 中的0.01 mg/kg 降到了0.000 24 mg/kg，靈敏度提高了40 余倍，大大提高了牛奶中三聚氰胺檢測的準確度和靈敏度。同時，新開發(fā)的方法樣品經(jīng)簡單稀釋后即可直接過免疫親和柱，精簡了前處理過程，縮短了檢測時長，減少了有機試劑用量，節(jié)省了物料和人力。

基質(zhì)匹配的標曲可以在一定程度上提高檢測準確度，但是不同樣品基質(zhì)需要配制不同的基質(zhì)標曲，增加了檢測工作量，不利于多細類樣品的檢測，且對于基質(zhì)復雜的樣品，用于配制基質(zhì)標曲的相同基質(zhì)不易獲得。內(nèi)標法在LC-MS/MS 中具有廣泛應用，它在消除基質(zhì)效應、提高檢測準確度方面具有顯著作用[11-12]。在能獲得合適內(nèi)標的情況下，內(nèi)標法是提高方法準確度的最佳選擇。