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    試析PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的運(yùn)用策略

    2023-11-24 10:37:46鄒曉花方瑞雪
    現(xiàn)代食品 2023年16期
    關(guān)鍵詞:探針特異性引物

    ◎ 鄒曉花,方瑞雪

    (西部第三方檢測集團(tuán)(寧夏)有限公司,寧夏 銀川 750021)

    本文旨在試析PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)在食品微生物檢測中的運(yùn)用策略。通過系統(tǒng)研究PCR 技術(shù)的原理、步驟和應(yīng)用案例,探討了如何選擇合適的微生物目標(biāo)、優(yōu)化前處理步驟、設(shè)計(jì)特異性引物和探針,并優(yōu)化PCR 反應(yīng)條件,以提高食品微生物檢測的準(zhǔn)確性和效率。

    1 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)

    1.1 優(yōu)勢

    ①PCR 技術(shù)具有高度的靈敏性和特異性,可以檢測微生物目標(biāo)的低濃度。由于PCR 反應(yīng)能夠擴(kuò)增目標(biāo)DNA 序列,即使微生物目標(biāo)在食品樣品中的濃度非常低,也能夠通過PCR 放大到足夠的數(shù)量進(jìn)行檢測。同時(shí),通過正確設(shè)計(jì)引物和探針,可以確保PCR 反應(yīng)的特異性,只檢測特定的微生物目標(biāo),避免誤報(bào)和交叉反應(yīng)。②PCR 能夠在短時(shí)間內(nèi)完成目標(biāo)DNA 的擴(kuò)增和檢測。PCR 反應(yīng)的周期時(shí)間可以在幾小時(shí)內(nèi)完成,有效提升食品微生物檢測速度,提供及時(shí)的結(jié)果。③PCR 技術(shù)可以通過前處理步驟去除樣品中的抑制物質(zhì),并通過擴(kuò)增目標(biāo)DNA 的方法,克服復(fù)雜樣品的困難,提供更可靠的檢測結(jié)果[1]。

    1.2 挑戰(zhàn)

    ①食品樣品的復(fù)雜性和多樣性,是PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中面臨的挑戰(zhàn)之一。不同食品樣品的成分和特性各不相同,可能導(dǎo)致樣品前處理和DNA 提取過程困難。②樣品中的抑制物質(zhì)和基質(zhì)干擾可能影響PCR 反應(yīng)的效果,導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。因此,在PCR 技術(shù)中,檢測人員需要考慮抑制物質(zhì)的存在,并采取相應(yīng)措施減輕其影響,如優(yōu)化DNA 提取方法和使用特殊試劑來消除抑制物質(zhì)。③PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中需要特定的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和技術(shù)要求,包括溫控設(shè)備、PCR儀器、核酸提取設(shè)備和引物設(shè)計(jì)軟件等。④PCR 技術(shù)需要熟練的試驗(yàn)操作和技術(shù)知識(shí),以確保PCR 反應(yīng)的可靠性和重復(fù)性[2]。

    2 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的戰(zhàn)略應(yīng)用

    PCR 技術(shù)作為一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)工具,已經(jīng)在食品微生物檢測領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景。其在食品安全保障中的戰(zhàn)略性應(yīng)用,不僅可以提高檢測的靈敏度和特異性,還可以加速檢測過程,從而更好地滿足快速鑒定和檢測的需求。

    2.1 靶標(biāo)選擇與設(shè)計(jì)策略

    2.1.1 靶標(biāo)基因的重要性與選擇原則

    在食品微生物檢測中運(yùn)用PCR 技術(shù)時(shí),靶標(biāo)基因的選擇是確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵因素。具體而言,靶標(biāo)基因作為PCR 擴(kuò)增的目標(biāo),在決定檢測靈敏度和特異性的同時(shí),也影響著分析的可行性和實(shí)用性。合理選擇靶標(biāo)基因可以使PCR 技術(shù)更好地適應(yīng)不同食品樣品的微生物檢測需求。通常情況下,選擇在目標(biāo)微生物中具有高度保守性和特異性的基因片段作為靶標(biāo)是必要的。其中,保守性指的是基因在不同菌株中的序列保持相對穩(wěn)定,以確保在多樣的微生物群體中同樣能被擴(kuò)增;特異性是確保引物和探針僅與目標(biāo)微生物的基因序列匹配,避免與其他非目標(biāo)微生物的DNA 片段發(fā)生交叉反應(yīng)。作為一個(gè)成功的靶標(biāo)基因,16S rRNA 基因在大多數(shù)細(xì)菌中具有高度保守性,因此被廣泛應(yīng)用于微生物鑒定。這一基因區(qū)段在細(xì)菌中扮演重要的生物學(xué)功能,其序列在不同菌株之間的變異性相對較小,使其成為微生物分類學(xué)和鑒定的理想選擇。

    2.1.2 引物與探針設(shè)計(jì)的考慮因素

    靶標(biāo)基因片段的交叉反應(yīng),是在PCR 技術(shù)中需要謹(jǐn)慎考慮的重要問題之一。在食品微生物檢測中,可能存在多種微生物種類,其基因組中的某些片段可能相似,導(dǎo)致引物與非目標(biāo)微生物的DNA 產(chǎn)生交叉反應(yīng)。這種交叉反應(yīng)可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果,從而誤導(dǎo)檢測結(jié)果。因此,在選擇引物時(shí),檢測人員需要特別關(guān)注其獨(dú)特性和特異性。其中,引物的獨(dú)特性和特異性可以通過生物信息學(xué)工具進(jìn)行預(yù)測和分析。在引物設(shè)計(jì)的初期,檢測人員可以使用多序列比對分析,比較目標(biāo)微生物和非目標(biāo)微生物的基因序列,找到具有較高特異性的區(qū)域作為引物的擴(kuò)增目標(biāo)。探針設(shè)計(jì)應(yīng)考慮以下因素。①特異性結(jié)合:探針的序列應(yīng)該與引物擴(kuò)增產(chǎn)物的特定區(qū)域相匹配,從而實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合。這可以通過確保探針序列僅與目標(biāo)基因序列的特異性部分匹配來實(shí)現(xiàn)。②獨(dú)特性:與引物一樣,探針的序列應(yīng)該在目標(biāo)微生物和非目標(biāo)微生物中具有足夠的獨(dú)特性,以避免交叉反應(yīng)。生物信息學(xué)工具可以用來分析可能的交叉反應(yīng)情況。③標(biāo)簽的選擇:探針上的熒光標(biāo)簽和探針的修飾,對于檢測的靈敏度和特異性有影響。熒光標(biāo)簽應(yīng)具有穩(wěn)定性和高信號強(qiáng)度,以確保在PCR反應(yīng)中可靠地檢測到信號。

    2.2 樣本處理與前處理策略

    2.2.1 樣本來源與處理的挑戰(zhàn)

    在食品微生物檢測中,樣本的來源和處理是影響PCR 技術(shù)應(yīng)用的重要因素之一。食品樣本的復(fù)雜性可能對PCR 的準(zhǔn)確性和靈敏度產(chǎn)生影響。不同食品類型的樣本可能包含不同的成分,如脂肪、蛋白質(zhì)、糖類等,這些成分可能干擾PCR 反應(yīng),影響檢測結(jié)果的可靠性。此外,食品樣本中可能還存在各種抑制因子,如多種化學(xué)物質(zhì)、酶抑制劑等,也可能阻礙PCR 擴(kuò)增的進(jìn)行。這些樣本復(fù)雜性帶來的挑戰(zhàn)需要在樣本處理過程中克服,以確保PCR 反應(yīng)的可靠性和準(zhǔn)確性。否則,可能會(huì)導(dǎo)致假陰性或假陽性的結(jié)果,影響食品微生物檢測的準(zhǔn)確性[3]。

    2.2.2 去除抑制因子的方法與策略

    為了克服食品樣本中的抑制因子,樣本前處理過程至關(guān)重要。當(dāng)前,有多種方法和策略可以幫助減少抑制效應(yīng),保障PCR 檢測的準(zhǔn)確性[4]。①使用特定的提取試劑盒:不同的提取試劑盒可以針對不同食品類型的樣本特性,選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行核酸提取,以有效分離核酸,并去除一些抑制因子。②酶處理:酶的加入可以在核酸提取過程中分解一些抑制性物質(zhì),如蛋白質(zhì)酶、脂肪酶等,有助于減少抑制效應(yīng),提高PCR 反應(yīng)的成功率。③離心:通過離心操作,可以將樣本中的固體顆粒沉淀,分離出液相,從而降低抑制性物質(zhì)的含量。④稀釋樣本:對于特別濃縮或含有高濃度抑制因子的樣本,可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?,從而降低抑制效?yīng)。⑤內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的使用:內(nèi)標(biāo)物質(zhì)是已知的DNA 片段,與待測的目標(biāo)基因一起擴(kuò)增。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的存在可以幫助判斷PCR 反應(yīng)是否受到抑制,從而驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。

    2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化策略

    2.3.1 溫度循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化與穩(wěn)定性

    PCR 反應(yīng)的溫度循環(huán)參數(shù)對于擴(kuò)增效率和產(chǎn)物特異性具有重要影響。①在PCR 過程中,溫度循環(huán)通過不同溫度階段的切換來實(shí)現(xiàn)DNA 的變性、退火和延伸。因此,優(yōu)化這些溫度循環(huán)參數(shù)可以顯著提高PCR 反應(yīng)的效率和準(zhǔn)確性。通過調(diào)整退火溫度,可以確保引物在目標(biāo)DNA 序列上結(jié)合的特異性。②延伸時(shí)間的優(yōu)化也至關(guān)重要。延伸時(shí)間應(yīng)足夠長,以確保DNA 聚合酶充分?jǐn)U增目標(biāo)序列,同時(shí)也應(yīng)避免過長的延伸時(shí)間,以免引起非特異性擴(kuò)增或引物的降解。③擴(kuò)增周期數(shù)的選擇取決于起始DNA 模板的初始濃度以及所需的擴(kuò)增量。適當(dāng)?shù)闹芷跀?shù)可以在不引起副產(chǎn)物的情況下達(dá)到足夠的擴(kuò)增。

    2.3.2 反應(yīng)體系組成的調(diào)控與優(yōu)化

    ①PCR 反應(yīng)體系的組成是影響PCR 反應(yīng)效率和產(chǎn)物穩(wěn)定性的重要因素之一。合理的反應(yīng)體系組成可以確保引物和核酸模板之間的充分結(jié)合,以及酶的高效催化。在反應(yīng)體系中,核酸模板的濃度應(yīng)該處于合適的范圍內(nèi),以確保擴(kuò)增的效率和特異性。引物和探針的濃度也需要經(jīng)過優(yōu)化,以避免過高或過低的濃度對反應(yīng)的影響。②反應(yīng)體系中,緩沖液的選擇和濃度影響pH 值的穩(wěn)定,從而影響酶的活性。適當(dāng)添加酶抑制劑可以防止酶在PCR 反應(yīng)開始前不受控制的活性,從而保證反應(yīng)的穩(wěn)定性[5]。

    2.4 數(shù)據(jù)分析與結(jié)果解釋策略

    2.4.1 分析PCR 產(chǎn)物的方法與工具

    當(dāng)前,有多種方法和工具可以用于分析PCR 產(chǎn)物。①凝膠電泳是一種常用的分析方法,通過將PCR 產(chǎn)物在凝膠中進(jìn)行電泳分離,可根據(jù)產(chǎn)物的大小判斷PCR擴(kuò)增是否成功。然而,凝膠電泳能夠提供關(guān)于PCR 產(chǎn)物大小的信息,但無法進(jìn)行定量分析。②毛細(xì)管電泳是一種高效分離和定量分析PCR 產(chǎn)物的方法。它通過在毛細(xì)管中進(jìn)行電泳分離,根據(jù)PCR 產(chǎn)物的大小和電荷來分析樣品。③實(shí)時(shí)熒光PCR 是一種廣泛應(yīng)用于PCR 分析的技術(shù)。它可以提供實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR 產(chǎn)物積累量的信息,通過熒光信號的強(qiáng)度來反映目標(biāo)基因的豐度。實(shí)時(shí)熒光PCR 可以用于定量分析,計(jì)算閾值周期數(shù)(Ct 值),從而比較不同樣本中目標(biāo)基因的數(shù)量。④數(shù)據(jù)分析工具和軟件,在PCR 產(chǎn)物分析中扮演著重要角色。這些工具可以用于解釋實(shí)時(shí)熒光PCR 的結(jié)果,繪制熒光曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算Ct 值以及進(jìn)行樣品間和批次間的比較與分析。

    2.4.2 結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性的驗(yàn)證

    為了確保PCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,需要進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證步驟。①陽性和陰性對照樣本:陽性對照樣本可以包含已知目標(biāo)基因序列,用于驗(yàn)證PCR 的靈敏度和特異性。同時(shí),陰性對照樣本可以用于檢測是否存在潛在的污染。②重復(fù)性試驗(yàn):進(jìn)行多次獨(dú)立的PCR試驗(yàn),可以驗(yàn)證結(jié)果的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。通過比較不同試驗(yàn)之間的結(jié)果,可以評估PCR 反應(yīng)的一致性和穩(wěn)定性。③平行試驗(yàn):同時(shí)進(jìn)行多個(gè)平行試驗(yàn),可以評估試驗(yàn)的一致性,幫助排除試驗(yàn)中可能的隨機(jī)誤差。通過上述驗(yàn)證步驟,可以確保PCR 檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性,有助于排除假陽性和假陰性結(jié)果,提高PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的可信度和應(yīng)用價(jià)值。

    3 結(jié)語

    綜上所述,PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中具有巨大的潛力和廣泛的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn),PCR 技術(shù)將在食品微生物檢測中發(fā)揮越來越重要的作用,為人們提供更加可靠和高效的食品安全保障。

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