腫瘤內微生物組的研究進展

李欣然，梁依依，屠 紅

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院上海市腫瘤研究所，腫瘤系統(tǒng)醫(yī)學全國重點實驗室，上海200032；

2. 復旦大學基礎醫(yī)學院，上海 200032

自20世紀20年代在人類腫瘤組織中首次培養(yǎng)出細菌以來，越來越多的證據(jù)［1-2］表明，腫瘤中存在著微生物群落。但由于腫瘤內微生物含量極豐度極低，難以排除實驗過程中外部細菌或細菌DNA的污染，因而實驗結果的可靠性在早年備受爭議。近年來，隨著高通量測序技術的發(fā)展，腫瘤中存在微生物群落的觀點逐漸受到認同。2020年，Nejman等［3］在一項全球多中心研究中，對7個癌種的1 010例腫瘤標本和516例癌旁標本進行了16S rRNA測序，發(fā)現(xiàn)這些癌種中均存在細菌DNA，包括與外界并不相通的卵巢癌、腦膠質瘤和骨肉瘤等。這一研究開啟了腫瘤微生物組學研究的新篇 章。

1 腫瘤內微生物組的種類、來源和作用

存在于腫瘤組織中并構成腫瘤微環(huán)境的微生物群體被稱為腫瘤內微生物組，包括細菌、真菌、病毒和支原體等，目前已在20余種惡性腫瘤中檢測到微生物的存在。在大多數(shù)癌種中，變形菌門和擬桿菌門比例較高，但不同癌種間也會有變化，如結直腸癌中豐度最高的是厚壁菌門和擬桿菌門（70% ～ 80%），而胰腺癌中則是變形菌門占主導地位（約80%）［3］。

腫瘤內微生物的來源可能有3 個途經：① “原住民”，即微生物來自于腫瘤起源的組織內部，例如，當口腔微生物組中的058型鏈球菌、口腔消化鏈球菌成為優(yōu)勢菌群時，可能與口腔鱗癌的發(fā)生相關［4］；當腸道菌群中的梭桿菌比例增加時，結直腸癌的發(fā)病風險上升［5］。② 血液運輸，即微生物隨血液循環(huán)到達腫瘤部位，這一過程也可與癌細胞的轉移相伴隨，例如，原發(fā)性結直腸癌中的細菌，可穿過被腫瘤破壞的腸道血管屏障，經門靜脈系統(tǒng)到達肝臟的繼發(fā)灶中［6］。③ 腸道逆流，即腸道菌群經膽總管、肝總管和主胰管等逆行至肝、膽、胰的腫瘤部位，例如，有研究［7］發(fā)現(xiàn)，胰腺癌微生物組與正常十二指腸微生物組的構成十分相似，由于胰總管開口于十二指腸乳頭部，這一現(xiàn)象提示細菌有可能沿管道逆行遷移至胰腺癌中。

腫瘤內微生物可能在癌前階段即已存在于病變組織中并參與了腫瘤形成。在反流性食管炎的食管組織中，彎曲桿菌的豐度增加，且白細胞介素（interleukin，IL）-8隨之上調，提示彎曲桿菌可能通過慢性炎癥及致癌代謝物的產生而誘發(fā)食管癌［8］。但更多研究者認為腫瘤內細菌可能是在癌形成后才遷移過來的。腫瘤新生血管內皮滲漏性增加，有助于外周循環(huán)中的細菌穿出血管進入腫瘤。腫瘤中獨特的缺氧環(huán)境，十分有利于厭氧菌的生長。而不斷壞死的腫瘤組織能為細菌的繁殖提供充足的養(yǎng)分。加之腫瘤微環(huán)境的高度免疫抑制狀態(tài)，這些都為細菌的長期生存創(chuàng)造了條件。

2 腫瘤微生物組的檢測方法

16S rRNA測序方法是腫瘤內微生物研究最常用的方法。該方法通過大通量測序，分析細菌16S rRNA基因的可變區(qū)序列以獲得各細菌的分類學特征。該方法可對樣品中的所有細菌進行分類學鑒定和定量，但對于種間差異較小的細菌，16S rRNA不能準確鑒定到種。此外，對于細菌以外的微生物，也無法通過16S rRNA測序進行鑒 定。

宏基因組學的發(fā)展使腫瘤內微生物組研究跨上了一個新臺階。宏基因組是指環(huán)境中所有微生物基因組的總和。與16S rRNA測序不同的是，宏基因組并不只針對某個特定微生物群（真菌、細菌或病毒）進行單一性的靶向測序，而是對所有微生物基因組的總和進行序列分析，因而其在物種的精確鑒定中具有優(yōu)勢，并能推測微生物組的功能特性。其不足之處在于序列的組裝和比對受微生物序列數(shù)據(jù)庫中參照序列條目的限制，且從腫瘤組織中提取的遺傳信息絕大部分是人類DNA，而低含量微生物的數(shù)據(jù)較為有限。

在細胞水平上，研究者通常使用針對革蘭氏陰性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸所進行的免疫組織化學證實腫瘤組織中細菌的存在。以特異性16S rRNA基因序列為探針的熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）也可確認瘤內細菌的存在。FISH聯(lián)合透射電鏡成像還能精確地鑒定細菌在癌細胞或浸潤性免疫細胞中的亞定位。目前，通過分離培養(yǎng)技術獲得腫瘤內活菌的研究較少。與宏基因組學相比，培養(yǎng)組學能夠獲得微生物的純培養(yǎng)物，有助于進一步研究菌株的生物學特性并構建體外模型。若能將宏基因組學和培養(yǎng)組學聯(lián)合應用，將能獲得更為客觀真實的研究結論。

3 腫瘤內微生物組在各類腫瘤中的研究進展

3.1 乳腺癌瘤內微生物組研究

3.1.1 乳腺及乳腺癌中的微生物

乳腺在傳統(tǒng)上被認為是一個無菌器官。但近年來研究［9］發(fā)現(xiàn)，哺乳期婦女的母乳樣本中存在著各種不同的細菌群落，且會受肥胖等因素的影響。以16S rRNA測序和細菌培養(yǎng)的方法，能檢測到乳腺組織中存在著大量不同類型的細菌，門水平以變形桿菌為主［10］。Nejman等［3］對乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤、骨肉瘤和腦膠質瘤等7種惡性腫瘤中的微生物組進行了分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌中的細菌種類最多，平均每個樣本中可檢測到17種細菌，而其他腫瘤中的細菌種類平均小于9種。

與正常乳腺相比，乳腺癌組織中普遍存在著微生物菌群失調現(xiàn)象。Banerjee等［11］還發(fā)現(xiàn)癌旁組織中的微生物顯著高于健康對照組，尤其是芽孢桿菌、腸桿菌、葡萄球菌、具核梭桿菌等的豐度較正常乳腺或乳腺良性病灶顯著增高，提示腫瘤內微生物可能會影響到鄰近組織，或乳腺癌中的微生物在癌前病變時已經存在。

此外，在乳腺癌中還發(fā)現(xiàn)了病毒（包括副痘病毒科、人乳頭狀瘤病毒、皰疹病毒科、反轉錄病毒科、多瘤病毒）、真菌和寄生蟲的存在，它們與細菌一起構成的腫瘤微生物組型別，具有臨床預后預測價值［12-13］。

3.1.2 乳腺癌內微生物對腫瘤的作用及機制

在小鼠乳腺癌模型中，瘤內注射人乳腺癌來源的細菌，能增強小鼠乳腺癌肺轉移的潛能；相反，應用抗生素清除瘤內細菌，則乳腺癌肺轉移病灶減少［14］。機制研究［14］表明，在腫瘤轉移過程中，攜帶有細菌的循環(huán)腫瘤細胞通過重塑肌動蛋白獲得了更強的抵抗流體剪應力的能力，從而促進了癌細胞的轉移。乳腺癌中的細菌還能與細胞外基質相互作用，通過對硫酸皮膚素的降解、肽聚糖的合成抑制及蛋白聚糖穩(wěn)定性的減弱［15］等途經，為癌細胞的侵襲、遷移創(chuàng)造有利條件。

乳腺癌內微生物多樣性降低或關鍵種群結構的改變，能影響腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的募集和活化。Tzeng等［16］發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌在乳腺癌中缺失，由于該菌豐度與T細胞激活相關基因的表達呈正相關，因而這一現(xiàn)象提示丙酸桿菌缺失可能通過抑制腫瘤局部T細胞免疫從而促進腫瘤的生長。此外，也有研究［17］發(fā)現(xiàn)，隨著乳腺癌瘤內微生物組菌群多態(tài)性的下降，細菌相關代謝產物也會發(fā)生相應變化，例如，石膽酸濃度降低后，其所誘發(fā)的細胞氧化應激凋亡效應減少，從而促進乳腺癌的進展。

具核梭桿菌存在于30%的乳腺癌標本中，在小鼠乳腺癌模型中，具核梭桿菌的致病因子Fap2能與乳腺癌細胞中高表達的半乳糖-N-乙酰半乳糖胺結合，使具核梭桿菌特異性定植于乳腺癌組織中，并抑制腫瘤浸潤T細胞積聚，促進乳腺癌的生長和轉移［18］。具核梭桿菌還能通過調節(jié)雌激素的生物利用度或誘導乳腺細胞DNA損傷，促進乳腺癌的發(fā)生［2］。

3.2 胰腺癌瘤內微生物組研究

3.2.1 胰腺及胰腺癌中的微生物

2017年，Geller等［7］對胰腺導管腺癌手術切除標本和20例正常胰腺對照標本進行了細菌16S rRNA的定量分析，發(fā)現(xiàn)胰腺癌樣本中細菌的檢出率顯著高于正常胰腺組織（76%vs15%，P＜0.005）。FISH和免疫組織化學檢測也均證實了人胰腺癌組織中存在細菌。胰腺癌組織中最常見的細菌是γ-變形菌綱中的腸桿菌科和假單胞菌科，約占細菌總數(shù)的51.7%。Pushalkar等［19］也發(fā)現(xiàn)胰腺癌中存在著13個門的細菌，其中以變形菌門（45%）、擬桿菌門（31%）和厚壁菌門（22%）最為豐富。胰腺癌中的細菌可能是從十二指腸逆行遷移而來的。用熒光標記的糞腸球菌對小鼠進行灌胃，可以直觀地觀察到細菌自腸道逆行至胰腺［19］。在臨床上，接受胰管固定術的患者腫瘤內的細菌明顯增多，也支持這一推測。但與腸道菌群相比，胰腺癌組織中的細菌仍有其獨特性，尤其是變形桿菌在從腸道向胰腺的移位過程中發(fā)生了選擇性富集［19］。

胰腺癌中另一個值得注意的微生物群是真菌。Aykut等［20］發(fā)現(xiàn)馬拉色菌屬等真菌在小鼠和人胰腺癌組織中大量存在，是正常胰腺組織的3 000倍。未來也可嘗試使用靶向真菌的抗生素來抑制胰腺癌的生長。

3.2.2 胰腺癌內微生物對腫瘤的作用及機制

細菌能促進胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。將p48Cre、LsL-KrasG12D（KC）小鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，以抗生素口服清理腸道菌群后，小鼠胰腺癌形成進程減緩。腸道重定植Pdx1Cre、LsL-KrasG12D和P53R172H（KPC）胰腺癌小鼠的糞菌后，KC小鼠胰腺癌生長速度恢復，但定植正常對照小鼠的糞菌則不能促進胰腺癌的生長。在胰腺癌原位模型中，口服抗生素清除瘤內細菌后，也能引起腫瘤縮小50%左 右［19］。

關于瘤內微生物促進胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制，目前研究主要集中于腫瘤微環(huán)境中細菌與免疫細胞間的交互作用。生存期長的胰腺癌患者，其腫瘤中所富集的糖多孢菌、革蘭氏芽孢桿菌和克勞西芽孢桿菌具有較強的免疫調節(jié)功能［21］。將抗生素處理過的小鼠胰腺癌原位腫瘤中浸潤T細胞分離后過繼給胰腺癌皮下瘤模型小鼠，結果能使瘤重下降50%左右［19］。在KPC小鼠中，抗生素處理能提高胰腺癌中CD8+/CD4+T細胞比例，增強CD8+T細胞的殺傷能力，并促進CD4+T細胞向Th1分化。細菌清除還能導致腫瘤微環(huán)境中髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）的減少和M1型巨噬細胞的增加［19］。

細菌代謝產物多胺可能也參與胰腺癌的進展。通過宏基因組分析KPC小鼠在胰腺癌發(fā)生過程中的微生物代謝途徑改變，發(fā)現(xiàn)其主要與腐胺、亞精胺和精胺的代謝通路相關［22］。胰腺癌患者血清中多胺水平顯著高于健康對照者［22］，進一步提示細菌代謝產物在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。腫瘤內部真菌也具有促胰腺癌生長的作用。通過口服兩性霉素B減少腫瘤中的真菌，能使小鼠胰腺自發(fā)瘤顯著縮小，小鼠生存期延長［23］。其機制可能為特定真菌刺激胰腺癌細胞分泌IL-33，招募并激活Th2細胞和Ⅱ型天然免疫細胞［23］。真菌促癌的另一種機制可能與激活補體級聯(lián)反應有關［20］。

3.3 肺癌瘤內微生物組研究

3.3.1 肺及肺癌中的微生物

2011年，Apostolou等［24］在肺癌樣本中首次發(fā)現(xiàn)了支原體、表皮葡萄球菌、鏈球菌和芽孢桿菌等的存在。隨后，越來越多的研究［25-28］證實了這一現(xiàn)象。在健康肺中，普雷沃菌、鏈球菌和奈瑟菌等最為豐富［26］，但Yu等［27］研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門在非惡性腫瘤的肺組織中占主導地位（約60%）。Jin等［28］則證實小鼠肺癌原位模型中草螺菌和鞘脂單胞菌在腫瘤組織中較為富集，肺癌組織中細菌菌群多樣性顯著低于正常肺組織。

Nejman等［3］比較了吸煙與非吸煙的肺癌患者腫瘤組織中的細菌富集通路，發(fā)現(xiàn)約半數(shù)通路與降解香煙中尼古丁、鄰苯甲醚、甲苯和苯酚等物質的通路相關，提示高濃度的香煙代謝物為這些細菌提供了良好的生存環(huán)境。參與香煙代謝過程的細菌主要屬于變形菌門、放線菌門和藍藻門。Greathouse等［29］研究發(fā)現(xiàn)，在TP53突變的肺鱗癌中存在獨特的細菌構成，如嗜酸菌屬豐度增加等，提示肺癌中微生物組的改變可能還與驅動基因突變存在關聯(lián)。

最近，Dohlman等［30］研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞中存在真菌，且吸煙患者中的瘤內真菌豐度更高、含更多的曲真菌和傘菌綱真菌。他們在兩個獨立的隊列中，證實以真菌作為標志物可有效地區(qū)分肺癌和健康對照，在肺癌的早期診斷中有一定的潛力。

3.3.2 肺癌瘤內微生物對腫瘤的作用及機制

肺癌共生菌具有促進肺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。LsL-KrasG12D、p53flox/flox（KP）小鼠在無菌（germ free，GF）條件下，肺部腫瘤生長減慢，數(shù)量減少，出現(xiàn)高級別癌前病變的比例顯著降低；令GF小鼠與無特定病原體小鼠共居，GF對KP小鼠的抑瘤現(xiàn)象消失，表明共生細菌具有促進肺癌發(fā)生、發(fā)展的作用［28］。

目前認為肺癌中細菌主要通過改變免疫微環(huán)境、調節(jié)局部免疫反應來影響腫瘤進程。細菌引起的慢性炎癥可促進肺癌的生長和轉移［26］，局部細菌負荷的增加和菌群組成的改變，可刺激髓系免疫細胞通過MyD88依賴性途徑產生IL-1β和IL-23，這些細胞因子刺激Vγ6+Vδ1+γδ T細胞活化和增殖，進而產生IL-17和其他效應分子促進炎癥和腫瘤發(fā)生［28］?？股仂F化吸入使小鼠肺部細菌數(shù)量減少后，能激活腫瘤浸潤T細胞和自然殺傷（natural killer，NK）細胞，并減少免疫抑制性的調節(jié)性T細胞數(shù)量，增強局部抗腫瘤免疫反應［31］。

3.4 其他腫瘤中的微生物組學研究

除胰腺癌、乳腺癌和肺癌外，幾乎所有常見惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有微生物組的存在。表1概括了這些腫瘤中微生物的種類及其對疾病發(fā)展的作用和機制。

4 腫瘤內微生物組的臨床應用

4.1 瘤內微生物組在腫瘤患者預后判斷中的作用

瘤內微生物群落的分布特征，有望成為新的腫瘤進展預測標志物［53］。Riquelme等［21］根據(jù)代表細菌群落多樣性的香農指數(shù)將胰腺癌患者分為高α-多樣性組和低α-多樣性組，結果顯示，前者的中位生存期達9.66年，而后者僅為1.66年（P＜0.001）?；诩冱S單胞菌、糖多孢菌、鏈霉菌和克勞西芽孢桿菌4種菌所構建的預測模型，受試者工作特征曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）在發(fā)現(xiàn)隊列和驗證隊列中分別可達0.98和0.99。Peters等［54］研究發(fā)現(xiàn)，肺癌癌旁組織中細菌的豐度和多樣性與無復發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）具有相關性。具體而言，紅藻科菌的豐度增加與RFS呈正相關，而糞桿菌和瘤胃球菌的豐度增加則與RFS呈負相關。

腫瘤內微生物也能影響藥物治療的敏感性。目前發(fā)現(xiàn)至少有13種細菌能引起癌細胞對吉西他濱耐藥，其中以γ-變形菌綱為主。由于胰腺癌組織中存在的細菌以γ-變形菌綱為主，Geller等［7］將胰腺癌標本中的細菌培養(yǎng)后處理腸癌細胞，結果使后者產生了吉西他濱耐藥。此外，有臨床研究［55］顯示，腫瘤內LPS可作為吉西他濱治療胰腺癌療效的預測因子。未來將特定抗生素與吉西他濱聯(lián)用，將有助于提高胰腺癌化療的有效性。

4.2 循環(huán)微生物DNA（circulating microbial DNA，cmDNA）在腫瘤診斷中的作用

cmDNA是指外周血中存在的微生物來源的游離DNA。迄今為止，cmDNA在肺癌、前列腺癌、結腸癌、胃癌、乳腺癌和肝癌中都顯示出較好的診斷價值。Poore等［56］對癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫信息進行整合分析后發(fā)現(xiàn)，cmDNA能較好地區(qū)分早期腫瘤和正常對照，尤其是在前列腺癌和肺癌的診斷中，AUC高達0.947 7和0.971 6。在結腸癌中，Xiao等［57］也發(fā)現(xiàn)有28個菌種在患者和正常對照血清中存在顯著差異。不過這些菌種在結腸腺瘤患者中也有相應改變，并不能很好地鑒別腫瘤的良惡性。Messaritakis等［58］研究發(fā)現(xiàn)，16S rDNA、大腸桿菌β-半乳糖苷酶、脆弱雙歧桿菌谷氨酰胺合酶及5.8S rDNA與結腸癌的轉移及總生存期顯著相關（P＜0.001）。Cho等［59］研究發(fā)現(xiàn)，與肝硬化和正常對照相比，肝癌患者血清中有7個屬的細菌豐度發(fā)生了顯著改變，尤其是葡萄球菌在肝癌患者血清中上升了4.3倍（P＜0.001）。基于5種細菌構建的評分模型，能有效地區(qū)分肝癌與對照組，AUC在發(fā)現(xiàn)隊列和驗證隊列中分別達0.879和0.875，提示cmDNA在肝癌診斷中具有潛在價值。

5 總結與展望

目前已證實，在腫瘤微環(huán)境中存在著細菌和真菌等微生物。這些微生物可游離于細胞外，也可寄居于腫瘤細胞或免疫細胞中，利用腫瘤細胞壞死提供的養(yǎng)分長期生存。這些微生物究竟是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的“驅動”因子，還是僅作為“旁觀者”存在，尚待更多研究進一步驗證。相對于腫瘤細胞而言，腫瘤內微生物在數(shù)量上占比很少，因此目前的研究在很大程度上依賴于深度測序技術，在微生物豐度極低的組織樣本中如何做到消除污染及精準分類仍具有挑戰(zhàn)性。由于共生菌與腫瘤間錯綜復雜的關系，也使得一些小樣本臨床研究所得出的結論重復性欠佳。

展望未來，瘤內共生菌的種類鑒定及臨床意義仍是研究重點。現(xiàn)有的機制研究主要集中于瘤內菌通過免疫介導發(fā)揮間接調控腫瘤的作用，有關共生菌對癌細胞本身的直接作用研究報道較少。將微生物組學與代謝組學、蛋白質組學、免疫組學等進行多組學整合分析，將有助于全面系統(tǒng)地了解微生物在腫瘤微環(huán)境中的作用?？傊?，腫瘤內微生物組這一全新概念，將進一步豐富人們對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的認識，也為腫瘤的臨床診治提供新的線索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。