益心附葶飲對慢性心力衰竭心腎陽虛證大鼠HIF-1/VEGF信號通路的影響

陳銘欽,雷瑗琳,師瑞瑞,全依晨,周納納,陳晉玉,韓 茹

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽712046;2.西安市中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西 西安 710021)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是由于各種心臟疾病引起的心臟組織結(jié)構(gòu)及功能異常,致使機(jī)體心室充盈功能低下或心室泵血不足,不能滿足機(jī)體代謝需要,器官、組織血液灌注不足,出現(xiàn)肺循環(huán)和(或)體循環(huán)瘀血。CHF是各器質(zhì)性心臟病發(fā)展到終末期的臨床綜合征,是心血管疾病患者死亡的主要原因,且其具有發(fā)病率高、再入院率高、病死率高的特點(diǎn)[1]。CHF 住院率占同期心血管病的 20%,病死率占40%,隨著老齡化進(jìn)程加快,CHF 發(fā)病率也呈逐年上升趨勢,已成為威脅人類生命健康的最重要心血管病[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療慢性心力衰竭存在長期用藥的耐藥性問題、不良反應(yīng)等,影響心臟不良事件及預(yù)后獲益。中醫(yī)學(xué)能夠分時機(jī)、分階段對患者復(fù)雜多變的證候制定相應(yīng)的治療方案,并具有突出優(yōu)勢。益心附葶飲是雷瑗琳主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)制定的治療CHF終末期驗(yàn)方。前期臨床與實(shí)驗(yàn)觀察表明,益心附葶飲對慢性心力衰竭終末期具有良好的臨床療效,機(jī)制可能與調(diào)整心肌細(xì)胞能量代謝有關(guān),具有減少炎癥因子釋放,抑制心室重構(gòu),延緩心力衰竭發(fā)展的作用。近年研究發(fā)現(xiàn),缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1α)能夠促進(jìn) AS 斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)浸潤和平滑肌細(xì)胞增殖、遷移,低氧下集聚的 HIF-1 能夠激活血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體,促進(jìn)調(diào)節(jié)血管新生。諸多學(xué)者通過臨床觀察發(fā)現(xiàn),慢性心力衰竭晚期主要為心腎陽虛證、水飲上泛證,在選方用藥上益氣溫陽化瘀利水法應(yīng)用最為廣泛,如苓桂術(shù)甘湯、真武湯、桂枝茯苓丸等能有效改善心力衰竭心腎陽虛證患者的心功能[3-5]。多項(xiàng)中醫(yī)藥研究表明,益氣活血利水中藥通過影響不同信號通路延緩其發(fā)生發(fā)展[6-7]。本研究通過觀察益心附葶飲對實(shí)驗(yàn)小鼠心肌組織HIF-1α蛋白表達(dá)和HIF-1/VEGF信號通路抑制作用,探討其抑制炎癥反應(yīng)、減緩心肌重構(gòu)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:清潔級雄性SD大鼠60只,平均體重(200±20)g,均購自中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心;許可證[SCXK(陜)20119-001]。飼以實(shí)驗(yàn)動物專用飼料(購自西安天工生物醫(yī)藥研究所),自由進(jìn)食、飲水,平均溫度(22±2)℃,平均濕度(60±5)%,光照為12 h明-暗循環(huán),光照時段7:00～19:00,實(shí)驗(yàn)期間60只大鼠均未死亡。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:羥基脲(批號C13337589,上海麥克林生化科技股份有限公司),PBS 1X(批號GA22090372609,武漢賽維爾生物科技有限公司),N端前腦鈉肽(NT-proBNP,批號22090635N,上海科興商貿(mào)有限公司) ,超敏C反應(yīng)蛋白(批號22090641N,上?？婆d商貿(mào)有限公司),內(nèi)皮素1(批號22090645N,上?？婆d商貿(mào)有限公司),白介素6(批號22090642N,上?？婆d商貿(mào)有限公司),HIF-1α mRNA引物(上游批號A058407、下游批號A058408,武漢賽維爾生物科技有限公司),HIF-1α抗體(批號bs-0737R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司),蛋白定量試劑盒(批號BA1207,南京建成生物工程公司),PVDF膜(批號0000167004,德國Merck Millipore公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:低溫離心機(jī)(型號H2050R,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司),包埋機(jī)(型號Histo Star,武漢俊杰電子有限公司),病理切片機(jī)(型號HM 340E,上海徠卡儀器有限公司),組織攤片機(jī)(型號TKY-TKA,浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司),染色機(jī)(型號ST5010),高速組織研磨儀(型號OSE-Y30,武漢賽維爾生物科技有限公司),渦旋儀(型號QL-901,海門市其林貝爾儀器制造有限公司),低速離心機(jī)(型號TD4,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司),化學(xué)發(fā)光成像分析儀(型號Mini Chemi 500,北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 益心附葶飲:黑附片(先煎)、葶藶子、太子參、茯苓、丹參各30 g,白術(shù)、枳殼各15 g,川芎、桂枝各12 g,地黃24 g,砂仁9 g,以上藥物由西安市中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供顆粒劑。

1.2.2 建模、分組及給藥:將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為五組,每組12只,為防止動物死亡導(dǎo)致樣本量不足,每組多備2只,共計(jì)70只。術(shù)前禁食8 h,將大鼠放置麻醉箱中,調(diào)整麻醉系統(tǒng),異氟烷占異氟烷、氧氣混合氣體濃度4%～5%,大鼠持續(xù)吸氧3 min,麻醉后左前胸備皮后碘伏消毒、開胸,暴露心臟,在冠狀動脈起始2～3 mm處結(jié)扎左冠狀動脈前降支,關(guān)胸。術(shù)后1 d灌胃給予羥基脲300 mg/kg,1 次/d,連續(xù)14 d,建立心力衰竭心腎陽虛證模型。假手術(shù)組:只穿線,不結(jié)扎,灌胃給予0.9%氯化鈉溶液2.5 ml/kg,2次/d,4周。模型組:制備心力衰竭模型,成模后灌胃給予0.9%氯化鈉溶液2.5 ml/kg,2次/d,4周。中藥低劑量組:制備心力衰竭模型,成模后給予生藥0.25 g/ml,4周,2次/d。中藥高劑量組:制備心力衰竭模型,成模后給予生藥1 g/ml,4周,2次/d。纈沙坦組:制備心力衰竭模型,成模后灌胃給予纈沙坦1.14 mg/kg,2次/d,4周。

1.2.3 HE染色觀察心肌病理組織學(xué)變化:石蠟切片依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min,自來水洗。蘇木素染色:切片入蘇木素染液染3～5 min,自來水洗,分化液分化,自來水洗,返藍(lán)液返藍(lán),流水沖洗。伊紅染色:切片依次入85%、95%梯度乙醇脫水各5 min,入伊紅染液中染色5 min。脫水封片:切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min透明,中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢并圖像采集分析。

1.2.4 qPCR檢測心肌組織HIF-1 mRNA表達(dá):組織中加入Trizol試劑提取mRNA,加入60 μl氯仿,強(qiáng)力振搖15 s,靜置3 min,4 ℃、12000 r/min離心10 min,吸取水相即組織RNA提取物;加入100 μl異丙醇于水相靜置10 min,4 ℃、12000 r/min離心10 min,沉淀RNA,棄上清;加入200 μl用DEPC水配75%乙醇洗RNA,4 ℃、7500 r/min離心10 min,棄上清,干燥RNA5～10 min;加入20 μl DEPC水溶解RNA,通過RNA定量儀對其進(jìn)行定量,-80 ℃凍存。使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(Reverse transcription,RT)反應(yīng),將提取的mRNA合成為cDNA;反應(yīng)條件為37 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃。使用SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR),采用兩步法對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,并對其進(jìn)行熒光實(shí)定量,反應(yīng)條件為95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40個循環(huán)。引物終濃度為0.4 μmol/L,GAPDH為內(nèi)參,使用2-△△Ct方法計(jì)算相對表達(dá)量,并對產(chǎn)物的解鏈曲線進(jìn)行分析,確保反應(yīng)特異性,HIF-1上游引物5’-GGCGAAGCAAAGAGTCTGAAGT-3’、下游引物5’-TAGCACCATAACAAAGCCATCC-3’。

1.2.5 Western blotting檢測心肌組織HIF-1蛋白表達(dá):將組織用含有1%蛋白酶抑制劑的4 ℃預(yù)冷RIPA裂解緩沖液裂解,細(xì)胞裂解物在12000 r/min、4 ℃下離心10 min,收集上清液,保存待用。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度,10%的SDS-PAGE分離出等量蛋白質(zhì)20 μg轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;于室溫下用5%牛奶在TBST中封閉膜2 h,并于4 ℃與HIF-1一抗孵育過夜,再將膜與二抗于37 ℃孵育2 h;用ECL試劑盒對印跡進(jìn)行可視化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graph Pad Prim 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間均數(shù)的綜合比較采用方差分析,組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)比較 見圖1。HE染色后觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化,藍(lán)色箭頭所示為纖維組織。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠各心肌細(xì)胞間距明顯增寬,心肌纖維排列紊亂,有大量膠原纖維蛋白沉積,心臟纖維組織表達(dá)面積升高;與模型組比較,中藥組各心肌細(xì)胞間隙縮窄,排列較整齊致密,大鼠心肌組織中僅見少量膠原纖維蛋白沉積。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)比較(HE染色,×40)

2.2 各組大鼠射血分?jǐn)?shù)比較 見表1(圖2)。由超聲心動圖檢測可知,模型組射血分?jǐn)?shù)低于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),可見造模成功。中藥低劑量組、中藥高劑量組、纈沙坦組大鼠射血分?jǐn)?shù)均高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠心功能射血分?jǐn)?shù)比較(%)

圖2 各組大鼠超聲心動圖比較

2.3 各組大鼠心肌組織HIF-1α mRNA表達(dá)及蛋白水平比較 見表2(圖3)。模型組大鼠心肌組織HIF-1 mRNA及蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),可見造模成功。中藥低劑量組、中藥高劑量組、纈沙坦組HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)均高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠心肌組織HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)比較

圖3 各組大鼠HIF-1α蛋白電泳圖

2.4 各組大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6比較 見表3。模型組大鼠NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6低于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),可見造模成功。中藥低劑量組、中藥高劑量組、纈沙坦組大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6水平均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6水平比較

3 討 論

各種條件導(dǎo)致慢性缺血缺氧是心血管疾病發(fā)生的前提,對冠狀動脈疾病、心肌梗死、心力衰竭等的發(fā)生發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義[8]。缺氧狀態(tài)下,細(xì)胞的存活需要激活許多分子信號通路,以達(dá)到刺激血管生成、促紅細(xì)胞生成以及有利于糖酵解的代謝重組模式,這種生物反應(yīng)稱為缺氧適應(yīng)性反應(yīng)[9]。心臟在遭受缺血損害、神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂、炎癥細(xì)胞因子等慢性刺激后機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng),特征性的表現(xiàn)為心肌纖維化、心肌肥大和心肌細(xì)胞壞死凋亡,導(dǎo)致心肌重量、心室容量增加及心臟功能變化,即心室重構(gòu), 而心室重構(gòu)是目前公認(rèn)的誘導(dǎo)心力衰竭發(fā)生的緊要機(jī)制,也是心功能不全的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,所以如何及時有效的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)過程是改善慢性心力衰竭轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵所在,探索心室重構(gòu)發(fā)展進(jìn)程中的相關(guān)信號通路及各通路抑制劑在心室重構(gòu)的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用等也顯得尤為緊要。HIF-1是由α亞基和β亞基構(gòu)成的異源二聚體,α亞基編碼基因定位于第14 號染色體,為 HIF-1的活性亞基,受氧濃度變化的精確調(diào)節(jié),是缺氧信號主要的、也是最普遍表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。HIF-1α主要集中在心肌細(xì)胞上,HIF-1α不僅具有調(diào)節(jié)增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶的轉(zhuǎn)錄以改善葡萄糖利用率功能,還能通過抑制線粒體呼吸以減少氧的使用,建立糖酵解和氧化代謝間的平衡關(guān)系,在不增加活性氧水平的狀態(tài)下,達(dá)到腺苷三磷酸(ATP)的最高產(chǎn)量[10],且其在ECM重構(gòu)和缺血預(yù)適應(yīng)以及動脈粥樣硬化進(jìn)程中的作用已被證實(shí)。在一項(xiàng)小鼠心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)HIF-1治療心肌梗死,可縮小心肌梗死面積,改善左室重構(gòu)[11]。Li等[12]首次提出 HIF-1α對心臟的損害作用,當(dāng)心臟供血明顯受限,敲除 VHL 基因會導(dǎo)致 HIF-1α缺氧反應(yīng)通路的慢性激活,進(jìn)而出現(xiàn)一系列的組織學(xué)改變,包含心肌細(xì)胞喪失和心肌纖維化等,最終導(dǎo)致心力衰竭加重。目前,學(xué)者普遍認(rèn)為,HIF 激活在輕度缺氧時對心肌具有保護(hù)作用,但在慢性、重度缺氧狀態(tài)等終末心力衰竭中對心肌有損害作用。Hoscher等[13]也發(fā)現(xiàn)在心肌病晚期心力衰竭患者中,HIF-1α的表達(dá)增加并處于持續(xù)激活狀態(tài)。血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧,又是加速動脈粥樣硬化(AS)進(jìn)程的重要影響因素。另一項(xiàng)研究顯示,HIF-1α能夠促進(jìn) AS 斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)浸潤和平滑肌細(xì)胞增殖、遷移,低氧下積聚的HIF-1能夠激活血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和 VEGF 受體,促進(jìn)調(diào)節(jié)血管新生。白楊等[14]通過建立新生大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)模型,證明抑制 HIF-1α表達(dá)可能是辛伐他汀心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一,這種保護(hù)機(jī)制可能與辛伐他汀減少缺血/再灌注損傷后的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。以上研究顯示HIF-1α的雙向表達(dá)特征,即輕度缺氧時對心肌具有保護(hù)作用,但同時發(fā)現(xiàn)在慢性、重度缺氧狀態(tài)等終末心力衰竭中對心肌有損害作用。

“心力衰竭”屬于中醫(yī)心力衰竭病,曾按照“喘證”“胸痹”“水腫”“肺脹”等辨治?！端貑枴ゐ粽摗酚涊d:“心主身之血脈”,《素問·五臟生成篇》亦云:“諸血者, 皆屬于心?！倍呓蕴崾狙}的正常運(yùn)行是心的功能,若心之氣、陽虛衰,則血脈鼓動無力,血行不暢,進(jìn)而留而為瘀?！端貑枴つ嬲{(diào)論篇》:“若心氣虛衰,可見喘息持續(xù)不已。”《素問·臟氣法時論》說:“心病者,日中慧,夜半甚,平旦靜”[15]。可見血脈正常運(yùn)行有賴于心氣與心陽的推動。國醫(yī)大師鄧鐵濤[16]提出:心力衰竭就是因?yàn)樾年枤馓撍?功能不全,血脈運(yùn)行不暢,以致臟腑經(jīng)脈失養(yǎng),功能失調(diào),治療主張陰陽分治溫補(bǔ)為上,對心力衰竭終末期辨治意義重大。雷主任總結(jié)多年治療慢性心力衰竭經(jīng)驗(yàn),提出心氣、心陽是心主血脈功能正常發(fā)揮的動力之源[17-18]?！把焕麆t為水”,瘀血留滯可化水為飲,水飲為有形實(shí)邪,易阻無形之氣的運(yùn)行,因“氣為血之帥”,氣行則血行,氣滯則血瘀,水飲進(jìn)一步加重血瘀,水飲與血瘀互為因果,互為影響。心力衰竭的病機(jī)虛實(shí)夾雜,表現(xiàn)在虛、瘀、水三端,三者又互為因果,其中心氣虛、陽虛是內(nèi)因,是病理基礎(chǔ);貫穿于心力衰竭發(fā)生與發(fā)展始終,影響著CHF的預(yù)后,病機(jī)關(guān)鍵點(diǎn)為心氣心陽虛衰;痰濁、水飲和血瘀是主要病理產(chǎn)物[19]。故陽衰陰竭,水瘀互結(jié)是終末期心力衰竭的主要證候,助陽利水化飲通絡(luò)是中醫(yī)治療基礎(chǔ)?！耙嫘母捷泔嫛?在原真武湯基礎(chǔ)上創(chuàng)制,附子、葶藶子為君藥,輔助利水化瘀中藥,有助陽益陰、利水通絡(luò)的功效,臨床應(yīng)用多年,能快速緩解臨床癥狀,大大減少再次住院頻次,具有良好的社會和經(jīng)濟(jì)效益。附子中的烏頭堿會抑制心肌衰弱,起到保護(hù)心肌的作用[20]。葶藶子及其有效成分不僅能增加心肌細(xì)胞收縮能力,增加冠脈血流量,還具有顯著抗臟器纖維化作用[21]。前期研究顯示,益心附葶飲通過下調(diào)Collagen1、Collagen3蛋白表達(dá)和抑制NF-κB P65信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),抑制壓力性心力衰竭大鼠心肌纖維化[22]。同時可抑制壓力性心力衰竭大鼠心肌纖維化和心室重構(gòu),其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad信號通路過度激活有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),益心附葶飲特別在高劑量時,能有效提高心力衰竭小鼠射血分?jǐn)?shù),改善血流動力學(xué), 同時抑制炎癥因子,降低心肌纖維組織表達(dá)面積,降低心肌組織中HIF蛋白表達(dá)含量,抑制其異常過量沉積,發(fā)揮治療心肌纖維化作用,對CHF終末期精準(zhǔn)治療有積極的指導(dǎo)意義。

綜上,益心附葶飲可能是通過下調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)和抑制HIF-1/VEGF信號通路介導(dǎo)的抑制炎癥反應(yīng),降低心力衰竭大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6表達(dá)從而減緩心力衰竭大鼠心室重構(gòu)進(jìn)程。