神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-β誘導(dǎo)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究

羅影　單偉　張俏

摘要：目的 研究神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-β（GMFB）對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活化的作用及相關(guān)機(jī)制。方法 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，采用腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，55 mg/kg）制備糖尿病模型后分為STZ組、STZ+AAV-GMFB組和STZ+AAV-GMFB+K252a組，每組15只。另取15只正常大鼠作為CON組。STZ+AAV-GMFB組和STZ+AAV-GMFB+K252a組大鼠于成模8周后玻璃體腔單次注射AAV-GMFB腺病毒載體5 μL。STZ+AAV-GMFB+K252a組在注射腺病毒基礎(chǔ)上給予腹腔注射25 ?g/（kg·d）的K252a。12周后，免疫熒光檢測(cè)GMFB在Müller細(xì)胞中的表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)視網(wǎng)膜膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)視網(wǎng)膜炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6的表達(dá)，Western blot檢測(cè)GMFB、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）及磷酸化酪氨酸激酶受體B（p-TrkB）蛋白相對(duì)表達(dá)水平。HE染色檢測(cè)視網(wǎng)膜病理改變。結(jié)果 GMFB在Müller細(xì)胞中大量表達(dá)。與CON組比較，STZ組GMFB、GFAP表達(dá)及TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加，BDNF、p-TrkB蛋白表達(dá)減少，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）排列紊亂，數(shù)量減少；與STZ組比較，STZ+AAV-GMFB組GMFB、GFAP表達(dá)及TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，BDNF、p-TrkB蛋白表達(dá)增加，RGC排列整齊，數(shù)量增加。TrkB抑制劑K252a能大部分逆轉(zhuǎn)AAV-GMFB的保護(hù)作用。結(jié)論 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜GMFB表達(dá)增加，誘導(dǎo)了Müller細(xì)胞活化，加重了炎癥反應(yīng)，該作用與抑制BDNF/TrkB信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿??；糖尿病視網(wǎng)膜病變；炎癥；神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-β；Müller細(xì)胞；BDNF/TrkB信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R587.1，R774.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221106

Study on the mechanism of glial maturation factor-β induced inflammatory response of retinal Müller cells in diabetes rats

LUO Ying SHAN Wei ZHANG Qiao

1 Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University， Jinzhou 121001， China;

2 Department of Anatomy， Jinzhou Medical University

△Corresponding Author E-mail： 594926970@qq.com

Abstract： Objective To study the activation and its related mechanisms of glial maturation factor-β（GMFB） on retinal MüLler cells in diabetes rats. Methods Sixty SPF grade male SD rats were divided into the streptozotocin （STZ） group， the STZ+AAV-GMFB group and the STZ+AAV-GMFB+K252a （TrkB inhibitor） group with 15 rats in each group. Another 15 normal rats were taken as the CON group. Rats in the STZ+AAV-GMFB group and the STZ+AAV-GMFB+K252a group were injected with AAV-GMFB adenovirus vector 5 μL in vitreous cavity 8 weeks after modeling. The STZ+AAV-GMFB+K252a group received intraperitoneal injection of K252a （25 ?g·kg-1·d-1）. After 12 weeks， the expression of GMFB in Müller cells was detected by immunofluorescence， the expression of glial fibrillary acidic protein （GFAP） in retina was detected by immunohistochemistry， and the retinal inflammatory factor tumor necrosis factor- α （TNF-α）， interleukin （IL）-1β and IL-6 were detected by ELISA. The relative expression levels of GMFB， brain derived neurotrophic factor （BDNF） and its tyrosine kinase receptor B （p-TrkB） were detected by Western blot assay. HE staining was used to detect the pathological changes of retina. Results GMFB was expressed in Müller cells. Compared with the CON group， the expression levels of GMFB， GFAP and TNF-α， IL-1β， IL-6 levels increased， the number of retinal ganglion cells （RGC） and the expression levels of BDNF， p-TrkB decreased in the STZ group. Compared with the STZ group， the expression levels of GMFB， GFAP and TNF-α， IL-1β and IL-6 levels decreased， the expression of BDNF， p-TrkB and the number of RGC were increased in the STZ+AAV-GMFB group. However， K252a can largely reverse the protective effect of AAV-GMFB. Conclusion The expression of GMFB in the retina of rats with diabetes is increased， which can induce the activation of Müller cells and aggravate the inflammatory response. This effect is related to the inhibition of BDNF/TrkB signal pathway.

Key words： diabetes mellitus; diabetic retinopathy; inflammation; glial maturation factor-β; Müller cells; BDNF/TrkB signaling pathway

Müller細(xì)胞為視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)維持視網(wǎng)膜功能尤為重要。高血糖會(huì)引起視網(wǎng)膜環(huán)境的紊亂，進(jìn)而影響正常Müller細(xì)胞的功能，最終影響整個(gè)視網(wǎng)膜功能［1-2］。研究顯示，高血糖狀態(tài)下，Müller細(xì)胞活化會(huì)釋放多種炎性因子，產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙，引起新生血管形成［3］。神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-β（glial maturation factor-β，GMFB）是一種生長(zhǎng)分化因子，介導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的生長(zhǎng)和成熟。研究顯示，GMFB在多種神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性疾病中表達(dá)上調(diào)并加重神經(jīng)變性和神經(jīng)炎癥［4-5］。目前，有關(guān)GMFB在糖尿病誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞活化中影響的研究較少。在高血糖狀態(tài)下，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）在視網(wǎng)膜中表達(dá)降低，表明糖尿病性視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病可能與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺乏有關(guān)［6］。Müller細(xì)胞可以釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在維持視網(wǎng)膜穩(wěn)定方面起重要作用。然而，在高血糖狀態(tài)下，Müller細(xì)胞過(guò)度活化可導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子釋放減少，炎性因子釋放增加［7］。本研究旨在探討GMFB在糖尿病視網(wǎng)膜損傷下的功能定位及其對(duì)BDNF/TrkB通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠65只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2009-2021。鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TrkB抑制劑K252a（美國(guó)AbMole公司）；兔抗大鼠GMFB、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、BDNF、p-TrkB一抗，小鼠抗大鼠谷氨酰胺合成酶（GS）一抗，β-actin一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，熒光二抗及Western blot二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）及蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自上海MLBIO公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 50只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，建模前禁食水12 h，采用腹腔注射STZ（55 mg/kg）制備糖尿病模型。72 h后空腹血糖≥16.7 mmol/L為模型制備成功，其中模型成功45只。采用隨機(jī)數(shù)字表法分成STZ組、STZ+AAV-GMFB組和STZ+AAV-GMFB+K252a組，每組15只。另取15只正常大鼠作為CON組。STZ+AAV-GMFB組和STZ+AAV-GMFB+K252a組大鼠于成模8周后麻醉，解剖顯微鏡下用微量進(jìn)樣器于內(nèi)眥角膜緣后1.0 mm處進(jìn)針，玻璃體腔單次注射AAV2型GMFB敲低腺病毒載體（AAV-GMFB）5 μL（預(yù)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)AAV病毒稀釋液的安全性），注射后72 h內(nèi)大鼠出現(xiàn)出血、感染等并發(fā)癥時(shí)予以剔除；STZ+AAV-GMFB+K252a組在注射腺病毒基礎(chǔ)上給予腹腔注射K252a，劑量25 ?g/（kg·d）［8］；CON組和STZ組給予腹腔注射等劑量生理鹽水。AAV-GMFB由上海吉瑪生物有限公司設(shè)計(jì)完成，其靶序列為3′-ACACCGAAGACCTAACTGA-5′，滴度為1×1010 PFU/mL。各組均干預(yù)12周，期間均無(wú)大鼠死亡，實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2.2 標(biāo)本采集 模型制備12周后，用戊巴比妥鈉（10 g/L）麻醉大鼠。每組5只大鼠采用4%多聚甲醛灌流1.5～2.0 h，取眼球置于-4 ℃固定液中48 h，常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋，5 μm切片，用于免疫熒光、免疫組織化學(xué)染色和HE染色。5只大鼠取新鮮視網(wǎng)膜組織進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。5只大鼠進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.3 免疫熒光染色觀察Müller細(xì)胞中GMFB的表達(dá) 切片常規(guī)脫蠟水化。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，每次5 min，10%山羊血清+0.3% Triton-X 100室溫孵育2 h；加入GMFB（1∶300）、GS（1∶500）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，每次10 min，滴加Alexa 488和Alexa 594標(biāo)記的二抗（1∶500），室溫避光濕盒孵育2 h。PBS洗滌3次，每次10 min，抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下拍照觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色觀察視網(wǎng)膜GFAP表達(dá)分布 切片常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)后恢復(fù)至室溫，3% H2O2避光反應(yīng)10 min。PBS洗滌3次。滴加山羊血清工作液30 min。滴加一抗GFAP（1∶300）4 ℃孵育過(guò)夜。次日（＞18 h）復(fù)溫1 h，二抗（1∶500）孵育1 h，PBS洗滌，鏈霉素親和素孵育1 h。DAB顯色后蘇木素復(fù)染，梯度乙醇和二甲苯溶液脫水透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察，鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒為GFAP表達(dá)陽(yáng)性。

1.2.5 ELISA檢測(cè)視網(wǎng)膜炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6相對(duì)表達(dá)水平 取新鮮視網(wǎng)膜，加入裂解液，收集各組上清液，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，按照ELISA說(shuō)明書(shū)加液后37 ℃水浴60 min，棄去液體，每孔加入過(guò)氧化氫和3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺混勻后反應(yīng)15 min。加入終止液，以450 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度（OD）值。

1.2.6 Western blot檢測(cè)GMFB、BDNF、p-TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)水平 收集上清液同1.2.5。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，1% BSA封閉2 h。加入GMFB（1∶5 000）、BDNF（1∶8 000）、p-TrkB（1∶5 000）、β-actin（1∶5 000）4 ℃孵育過(guò)夜。18 h后TBST洗膜，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，ECL顯影。用Image J 1.8.0軟件分析各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 HE染色觀察視網(wǎng)膜病理變化 切片常規(guī)脫蠟水化后PBS洗3次；蘇木素浸染2 min，自來(lái)水沖洗；伊紅浸染1 min，自來(lái)水沖洗；脫水透明后封片，倒置顯微鏡拍照觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）在節(jié)細(xì)胞層的排列和數(shù)量變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GMFB在Müller細(xì)胞中的表達(dá) 通過(guò)GMFB和Müller細(xì)胞標(biāo)志物GS免疫熒光雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)，GMFB在Müller細(xì)胞中大量表達(dá)，見(jiàn)圖1。

2.2 各組GFAP表達(dá)分布情況比較 CON組GFAP僅表達(dá)于節(jié)細(xì)胞層，STZ組和STZ+AAV-GMFB+K252a組GFAP表達(dá)貫穿視網(wǎng)膜全層。STZ+AAV-GMFB組GFAP表達(dá)量介于CON組和STZ組之間，見(jiàn)圖2。

2.3 各組視網(wǎng)膜炎性因子表達(dá)水平比較 與CON組比較，STZ組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平增加（P＜0.05）。與STZ組比較，STZ+AAV-GMFB組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與STZ+AAV-GMFB組比較，STZ+AAV-GMFB+K252a組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平增加（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.4 各組BDNF/TrkB通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與CON組比較，STZ組GMFB相對(duì)表達(dá)水平增加，BDNF、p-TrkB相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與STZ組比較，STZ+AAV-GMFB組GMFB相對(duì)表達(dá)水平降低，BDNF、p-TrkB相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與STZ+AAV-GMFB組比較，STZ+AAV-GMFB+K252a組GMFB相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），BDNF、p-TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖3。

2.5 各組視網(wǎng)膜病理變化 與CON組比較，STZ組RGC排列紊亂，數(shù)量明顯減少。與STZ組比較，STZ+AAV-GMFB組RGC排列整齊，數(shù)量增加。與STZ+AAV-GMFB組比較，STZ+AAV-GMFB+K252a組RGC排列紊亂，數(shù)量明顯減少，見(jiàn)圖4。

3 討論

高血糖會(huì)引起嚴(yán)重的Müller細(xì)胞活化，導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子釋放減少，炎性因子釋放增加［1-2，7］。GMFB主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小腦中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及視網(wǎng)膜中的Müller細(xì)胞等神經(jīng)膠質(zhì)類細(xì)胞［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在出生后14 d的大鼠視網(wǎng)膜中可檢測(cè)到GMFB mRNA和蛋白，且GMFB的表達(dá)主要局限于大鼠視網(wǎng)膜中的Müller細(xì)胞［9］。本研究采用GMFB和Müller細(xì)胞標(biāo)志物GS免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)，GMFB與GS大量共存，且與CON組比較，STZ組大鼠視網(wǎng)膜GMFB表達(dá)明顯增加，表明高血糖會(huì)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜表達(dá)GMFB，提示GMFB的表達(dá)變化與糖尿病視網(wǎng)膜損傷密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，STZ+AAV-GMFB組GMFB相對(duì)表達(dá)水平較STZ組降低，提示敲低GMFB表達(dá)可抑制高血糖引起的Müller細(xì)胞活化，減輕細(xì)胞損傷程度。

現(xiàn)已確定糖尿病動(dòng)物模型Müller細(xì)胞會(huì)被激活，其明顯標(biāo)志之一是GFAP的表達(dá)增加［10］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠視網(wǎng)膜GFAP僅少量表達(dá)于節(jié)細(xì)胞層，而糖尿病大鼠GFAP呈現(xiàn)全細(xì)胞免疫陽(yáng)性［11］。Müller細(xì)胞活化后會(huì)釋放大量的炎性因子，且其是視網(wǎng)膜IL-1β產(chǎn)生的主要來(lái)源。在Müller細(xì)胞中，高血糖可強(qiáng)烈誘導(dǎo)IL-1β信號(hào)通路激活［1］。除IL-1β外，Müller細(xì)胞還產(chǎn)生TNF-α和IL-6等炎性因子［12-13］。這些炎性因子加重了糖尿病視網(wǎng)膜慢性炎癥，且隨病程延長(zhǎng)，炎癥進(jìn)展也促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷［3］。本研究結(jié)果也證實(shí)，STZ組視網(wǎng)膜GFAP、TNF-α、IL-1β、IL-6水平較CON組均增加，提示高血糖會(huì)引起Müller細(xì)胞處于極度活化狀態(tài)，這對(duì)視網(wǎng)膜是有害的。而注射AAV-GMFB后，上述指標(biāo)均降低，表明GMFB表達(dá)上調(diào)是介導(dǎo)的Müller細(xì)胞活化誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的重要原因之一。

BDNF具有神經(jīng)保護(hù)功能和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，可以促進(jìn)神經(jīng)再生，維持正常的神經(jīng)元功能［14］。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病時(shí)BDNF表達(dá)明顯降低，視網(wǎng)膜功能受損［15］。本研究結(jié)果顯示，與CON組比較，STZ組BDNF及其受體p-TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，提示糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞功能下降，炎癥反應(yīng)加重。而與STZ組比較，STZ+AAV-GMFB組BDNF和p-TrkB相對(duì)表達(dá)水平升高，提示下調(diào)GMFB表達(dá)可促進(jìn)BDNF及其受體TrkB的表達(dá)，保護(hù)視網(wǎng)膜。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BDNF/TrkB途徑在GMFB調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜損傷中的作用，本研究在給予AAV-GMFB的同時(shí)，給予TrkB受體抑制劑K252a，發(fā)現(xiàn)K252a大部分逆轉(zhuǎn)了AAV-GMFB的保護(hù)作用，再次證實(shí)GMFB在糖尿病視網(wǎng)膜損傷中的作用是通過(guò)BDNF/TrkB途徑實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜GMFB表達(dá)明顯上調(diào)，誘導(dǎo)了Müller細(xì)胞活化，進(jìn)而加重了炎癥反應(yīng)，GMFB表達(dá)上調(diào)可對(duì)視網(wǎng)膜造成損害。AAV-GMFB可抑制Müller細(xì)胞活化，降低炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，保護(hù)RGC，該保護(hù)作用機(jī)制與激活BDNF/TrkB途徑密切相關(guān)。然而，糖尿病機(jī)制復(fù)雜，GMFB調(diào)控此信號(hào)通路進(jìn)而對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（2022-07-14收稿 2022-09-29修回）

（本文編輯 陸榮展）