美洲大蠊提取物CⅡ-3 對荷S180 肉瘤小鼠抑瘤作用及機制初探

陸 麗，何 旭，張艷菊，彭 芳

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000；3.大理白族自治州人民醫(yī)院藥劑科，云南大理 671000；4.巍山縣大倉中心衛(wèi)生院，云南巍山 672401；5.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

肉瘤是一種罕見的腫瘤，常發(fā)生在結(jié)締組織，惡性程度較高，一般5年生存期低于20%，并且80%的患者在確診時已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。化療藥物的毒性反應(yīng)和耐藥性的產(chǎn)生一直是腫瘤疾病治療中難以解決的問題，而昆蟲體內(nèi)高效低毒的天然抗腫瘤活性成分對腫瘤疾病的治療有著獨特的優(yōu)勢〔1-4〕。

美洲大蠊Periplaneta americana，俗稱蟑螂，屬昆蟲綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲。現(xiàn)代藥理學(xué)研究〔5-6〕表明，美洲大蠊具有抗腫瘤、增強免疫、促進傷口愈合、改善微循環(huán)等作用。美洲大蠊提取物CⅡ-3是從美洲大蠊中提取、分離得到的以肽類為主的混合物〔7〕。胡艷芬等研究〔8〕發(fā)現(xiàn)，CⅡ-3 在體外對腫瘤細胞的增殖具有較好的抑制作用，為進一步探討CⅡ-3 體內(nèi)的抗腫瘤作用，本研究就CⅡ-3 對荷S180 肉瘤小鼠抑瘤作用及機制進行初探，旨在為CⅡ-3 抗腫瘤方面的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物和細胞株SPF 級雄性昆明種小鼠60只，體質(zhì)量（18±2）g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（滇）2011-0004。S180 細胞株由昆明醫(yī)科大學(xué)天然藥物藥理重點實驗室饋贈。

1.2 藥品與試劑 美洲大蠊提取物CⅡ-3 由大理大學(xué)藥學(xué)院劉光明教授提供，其制備工藝：乙醇提取→大孔樹脂分離→CⅡ-3；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：11020821）；無水乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號：090214）；p53 單克隆抗體（Enzolifesciences，批號：ADI-KAM-CC00-D）；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl asparate specific protease-3，Caspase-3）單克隆抗體（Enzolifesciences，批號：ALX-804-305-C100）；B 細胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2） 單克隆抗體（Abcam，批號：ab117115）；環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）單克隆抗體（Abcam，批號：ab179800）；微血管密度（microvessel density，MVD）多克隆抗體（Proteintech，批號：15331-1-AP）；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：H044-2-2）；端粒酶（telomerase，TE）ELISA 試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司，批號：SP14404）。

1.3 實驗儀器 EL-104 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KL-UP-UV-20KNSY1059 型艾柯超純水機（成都康寧實驗專用純水設(shè)備廠）；BMVⅢ型生物組織包埋機（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；IX-7 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；HH.B11.360 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；XB.K.25 型血球計數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司）；SN255939 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 無菌條件下，抽取第2 代荷S180 腹水瘤小鼠淡黃色癌性腹水，0.9%氯化鈉溶液調(diào)節(jié)S180 細胞懸液密度為1.5×107個/mL，0.2 mL/只，皮下接種于小鼠右側(cè)腋窩。接種次日將小鼠隨機分為模型組、陽性對照（CTX）組、CⅡ-3 高、中、低劑量組，另設(shè)正常對照組，每組10 只小鼠。陽性對照組隔日腹腔注射CTX，30 mg/kg，1 次/d；CⅡ-3 高、中、低劑量組灌胃CⅡ-3，劑量分別為200、100、50mg/kg，1 次/d；正常對照組和模型組均灌胃0.9%氯化鈉溶液，20 mL/kg，1 次/d。10 d 后處死小鼠，取血，并剝離瘤塊。

2.2 抑瘤率測定 將瘤塊稱重并測量長、短徑。瘤塊體積V（mm3）=ab2/2（a、b 分別為瘤塊的長、短徑）；抑瘤率（%）=〔（對照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/對照組平均瘤質(zhì)量〕×100%。

2.3 腫瘤組織病理切片的制備 取各組小鼠瘤塊，經(jīng)10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色、封片等步驟后進行鏡檢，觀察各組小鼠腫瘤組織的病理改變。

2.4 血清中VEGF 含量和TE 活力的測定 小鼠眼球取血后，將全血于冰水浴中靜置1.5 h，然后4 ℃下3 500 r/min 離心15 min，取上清液備用。ELISA板條樣品孔中，每孔加入上述上清液40 μL，抗-VEGF 抗體10 μL（或抗-TE 抗體10 μL），鏈霉親和素-HRP 50 μL，空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔按照試劑盒說明書操作，混勻后置于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃溫育60 min，棄混合液并洗板數(shù)次。每孔加顯色劑100 μL，37 ℃避光10 min 后，加終止液50 μL，空白對照調(diào)零，450 nm波長處測各孔吸光度（A）值，計算VEGF 濃度和TE活力。

2.5 小鼠腫瘤組織中p53、Bcl-2、Caspase-3、MVD和COX-2 蛋白表達檢測 采用免疫組織化學(xué)法分別測定各組小鼠腫瘤組織中p53、Bcl-2、Caspase-3、MVD 和COX-2 蛋白的表達水平。腫瘤組織經(jīng)10 %甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、烤片過夜。次日，二甲苯脫蠟，高濃度到低濃度乙醇脫水，片子漂洗干凈后用檸檬酸修復(fù)液進行抗原修復(fù)，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，流水沖洗，PBS 沖洗，滴加一抗工作液，37 ℃孵育1 h，流水沖洗，PBS 沖洗，滴加適當(dāng)?shù)亩构ぷ饕?，室溫下孵?0 min，流水沖洗，PBS沖洗，DAB 顯色劑顯色，流水沖洗，蘇木素復(fù)染，稀鹽酸分化，稀氨水返藍，再進行常規(guī)脫水、透明、封片。在光鏡下觀察細胞陽性表達率，陽性表達率與蛋白水平呈正相關(guān)。

2.6 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以（x± s）表示。方差齊，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；方差不齊則采用韋爾奇檢驗，組間兩兩比較選用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CⅡ-3 對荷S180 肉瘤小鼠抑瘤作用 與模型組相比，CTX組和CⅡ-3 高劑量組的瘤塊體積和腫瘤質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01），且CⅡ-3 高劑量組與CTX組作用相當(dāng)（P＞0.05）。CⅡ-3 高、中、低劑量組的抑瘤率分別為55.71%、44.28%、34.28%，均大于30.00%。見表1。

表1 CⅡ-3 對荷S180 肉瘤小鼠抑瘤作用（x±s，n=10）

3.2 荷S180 肉瘤組織病理切片觀察 模型組小鼠肉瘤細胞生長旺盛，核呈均勻分布；CTX組小鼠肉瘤細胞出現(xiàn)大量的核固縮和核碎片，并伴有壞死；CⅡ-3 高劑量組小鼠肉瘤細胞呈現(xiàn)大面積壞死；CⅡ-3 中劑量組小鼠肉瘤細胞壞死區(qū)域明顯，并出現(xiàn)微血管；CⅡ-3 低劑量組小鼠肉瘤細胞生長狀況良好，與模型組相當(dāng)。見圖1。

圖1 荷S180 肉瘤組織病理切片（×100）

3.3 CⅡ-3 對荷S180 肉瘤小鼠血清中VEGF 和TE的影響 與模型組相比，CⅡ-3 高劑量組小鼠血清中TE 的活力降低（P＜0.05），模型組與CⅡ-3 各劑量組小鼠血清中VEGF 含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 CⅡ-3 對荷S180 肉瘤小鼠血清中VEGF 和TE 的影響（x±s，n=10）

3.4 CⅡ-3 對荷S180 肉瘤小鼠腫瘤組織中p53、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達的影響 免疫組織化學(xué)染色中，p53 陽性著色部位在細胞核，棕褐色染色，呈散在分布。正常對照組未見p53 陽性著色，其余各組均有不同程度著色，以模型組著色區(qū)域最大。見圖2。Bcl-2 陽性著色部位在細胞漿，棕黃色染色，呈彌漫分布。正常對照組細胞排列緊密，未見Bcl-2陽性著色，模型組著色區(qū)域明顯大于CTX組和CⅡ-3高劑量組。見圖3。Caspase-3 陽性著色部位在細胞核和細胞質(zhì)，棕黃色染色，呈片狀分布。模型組和CⅡ-3 低劑量組著色區(qū)域明顯小于CTX組和CⅡ-3高、中劑量組。見圖4。與模型組相比，CTX組、CⅡ-3高、中劑量組小鼠腫瘤組織中Bcl-2、p53 的表達顯著降低（P＜0.01），Caspase-3 的表達顯著增加（P＜0.01）；CⅡ-3 高劑量組與CTX組p53、Bcl-2、Caspase-3 表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖2 p53 免疫組織化學(xué)染色圖（×400）

圖3 Bcl-2 免疫組織化學(xué)染色圖（×400）

圖4 Caspase-3 免疫組織化學(xué)染色圖（×400）

表3 CⅡ-3 對荷S180 肉瘤小鼠腫瘤組織中p53、Bcl-2、Caspase-3 的影響（x±s，n=10）

3.5 CⅡ-3 對荷S180 肉瘤小鼠腫瘤組織中MVD 及COX-2 蛋白表達的影響 免疫組織化學(xué)染色中，MVD 和COX-2 陽性著色部位在細胞質(zhì)，棕黃色染色。正常對照組細胞排列緊密，核體積較小，均未見MVD 和COX-2 陽性著色；模型組細胞質(zhì)MVD 和COX-2 陽性著色，著色區(qū)域均較大，細胞核較大；CTX組細胞質(zhì)MVD 和COX-2 陽性著色，呈彌漫分布，著色區(qū)域較??；CⅡ-3 高劑量組細胞質(zhì)MVD 和COX-2 陽性著色，細胞核較大并出現(xiàn)異型性；CⅡ-3中劑量組細胞質(zhì)和細胞核MVD 陽性著色，細胞質(zhì)COX-2 陽性著色，呈彌漫分布；CⅡ-3 低劑量組細胞質(zhì)MVD 和COX-2 陽性著色，細胞核較大，著色區(qū)域較大。見圖5～6。與模型組相比，CTX組和CⅡ-3 高、中劑量組小鼠腫瘤組織中MVD 和COX-2 蛋白的表達顯著降低（P＜0.01）。見表4。

圖5 MVD 免疫組織化學(xué)染色圖（×400）

4 討論

CⅡ-3 是從美洲大蠊中提取、分離得到的以肽類為主的混合物，灌胃給藥后顯示出一定的抗S180肉瘤作用，其發(fā)揮抗腫瘤作用的有效物質(zhì)尚不明確，這些有效物質(zhì)可能是環(huán)狀多肽類。環(huán)狀多肽的兩端通過化學(xué)鍵橋連成環(huán)，對多肽骨架產(chǎn)生構(gòu)象限制，柔韌性比線性多肽差，因而更難被消化酶水解〔9-10〕。

CⅡ-3 高、中、低劑量組對荷S180 肉瘤小鼠抑瘤率分別為55.71%、44.28%、34.28%，均大于30.00%，而且CⅡ-3 高劑量組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量顯著低于模型組，可見CⅡ-3 對S180 肉瘤的生長具有明顯的抑制作用。

VEGF 可誘導(dǎo)新生血管形成，從而促進腫瘤細胞、組織生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移，其特異性作用于內(nèi)皮細胞糖基化的細胞有絲分裂素〔11〕，在缺血部位高表達能夠?qū)π卵苌蛇M行誘導(dǎo)，使缺血部位恢復(fù)正常的血流供應(yīng)〔12〕，通過血管外周細胞基質(zhì)降解，血管內(nèi)皮細胞增殖遷移和毛細血管分化吻合來促進腫瘤血管形成〔13〕。TE 是人體細胞中延伸端粒的特異性反轉(zhuǎn)錄酶，可通過催化線性染色體末端添加DNA重復(fù)序列來維持端粒長度，限制端粒損耗〔14-15〕，在維持細胞活性、基因組完整性和機體穩(wěn)定性中起重要的調(diào)控作用〔16-17〕，然而，TE 的表達僅限于特定的細胞狀態(tài)或細胞類型，在正常人體的細胞中，除了生殖細胞、干細胞和造血細胞，大多數(shù)體細胞的TE活性處于失活狀態(tài)，但在細胞癌變過程中，TE 會被異常通路活化〔18〕，90%以上的癌細胞中TE 處于高活性狀態(tài)〔19〕。在本實驗中，模型組小鼠血清中TE活性最高，CⅡ-3 高劑量組能顯著降低荷瘤小鼠血清中TE 的活性，提示CⅡ-3 的抑瘤作用可能與抑制TE 的活性有關(guān)。

p53 是機體內(nèi)重要的抑癌基因，有突變型和野生型兩種，野生型p53 半衰期延長可轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃蚿53 基因，同時失去誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，在腫瘤組織中突變型p53 基因高表達，可以用免疫組織化學(xué)方法檢測〔20-21〕。Bcl-2 是機體內(nèi)抑制細胞凋亡的基因，可以抑制生理條件下致凋亡因素引起的細胞凋亡，為細胞中受損傷但不能被修復(fù)的DNA 發(fā)生突變提供前提，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生〔22-23〕。Caspase-3是Caspase 家族中重要的一員，參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)過程，通過一系列的調(diào)控最后促進凋亡小體的形成。Caspase-3 蛋白的低表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為特征密切相關(guān)〔24-25〕。MVD在腫瘤血管生成活性的評估中有很重要的作用，也是反映惡性腫瘤部分生物學(xué)行為的一個重要指標(biāo)〔26〕。COX-2 作為環(huán)氧合酶中的誘導(dǎo)型酶，在機體受到炎性反應(yīng)、癌蛋白、細胞因子等多種刺激下而誘導(dǎo)性表達，與機體炎性反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等病理變化密切相關(guān)〔27〕，在調(diào)控細胞增殖與抑制細胞凋亡、促進患者體內(nèi)血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移等多方面發(fā)揮作用〔28〕。本實驗結(jié)果表明，CⅡ-3 高、中劑量均能顯著降低腫瘤組織中p53、Bcl-2、MVD、COX-2的表達水平，同時增加Caspase-3 的表達。

綜上所述，CⅡ-3 對S180 實體瘤有顯著的抑制作用，其機制可能與降低TE 活性，減少p53、Bcl-2、MVD、COX-2 蛋白表達，增加Caspase-3 蛋白表達等途徑有關(guān)。具體的機制有待進一步研究。