β-血紅蛋白病的基因治療臨床試驗進(jìn)展*

劉倩宜, 陳曉琳, 劉思邈, 李欣瑜, 黃軍就△

1中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因功能與調(diào)控教育部重點實驗室(廣東廣州 510275); 2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科血液專科(廣東廣州 510120)

β-血紅蛋白病是一類由于編碼β珠蛋白的β-珠蛋白基因(HBB)基因致病變異引起的疾病,包括β-地中海貧血癥及鐮狀細(xì)胞病(sickle cell disease,SCD)等,是目前世界上最常見的單基因遺傳病之一。在我國境內(nèi),β-血紅蛋白病高發(fā)于南方地區(qū),其中廣東地區(qū)β-地中海貧血癥基因攜帶率約為3.8%,粵北地區(qū)的β-地中海貧血癥基因攜帶率可達(dá)6.34%[1-2]。β-血紅蛋白病的治療給患者、其家庭及社會均帶來沉重的經(jīng)濟與醫(yī)療負(fù)擔(dān),因此亟需開發(fā)高效可行的β-血紅蛋白病治愈性治療方案。本文將針對β-血紅蛋白病的基因治療思路展開陳述,并對其存在問題與未來應(yīng)用展開討論。

1 血紅蛋白及β-血紅蛋白病

1.1 血紅蛋白的組成 人類血紅蛋白是由紅細(xì)胞產(chǎn)生的含鐵蛋白質(zhì),在機體內(nèi)發(fā)揮運輸氧氣的功能。在胎兒時期至出生后早期,血紅蛋白主要是由2條α-珠蛋白鏈及2條γ-珠蛋白鏈構(gòu)成的胎兒血紅蛋白四聚體(fetal hemoglobin,Hb F,α2γ2),而在出生后6～24個月內(nèi)2條α-珠蛋白鏈及2條β-珠蛋白鏈構(gòu)成的成人血紅蛋白四聚體(adult hemoglobin,Hb A,α2β2)逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位,此時人體內(nèi)Hb F含量逐漸降低至約1%[3]。這一血紅蛋白轉(zhuǎn)換過程與11號染色體上β-珠蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān),其上線性排列的ε-珠蛋白基因(HBE1)、Gγ-珠蛋白基因(HBG2)、Aγ-珠蛋白基因(HBG1)、δ-珠蛋白基因(HBD)及HBB(圖1)會隨著胚胎發(fā)育及胎兒出生導(dǎo)致的個體生存環(huán)境中氧分壓變化,在基因座控制區(qū)(locus control region,LCR)的調(diào)控下順序轉(zhuǎn)錄,最終完成Hb F向Hb A的血紅蛋白轉(zhuǎn)換過程。

圖1 β-珠蛋白基因簇上相關(guān)基因排列示意圖

1.2 β-血紅蛋白病的病理生理學(xué) β-血紅蛋白病主要是由β-珠蛋白基因HBB變異導(dǎo)致,根據(jù)突變后造成的病理生理現(xiàn)象可將其進(jìn)一步分為SCD及β-地中海貧血癥。其中SCD患者的HBB基因上第6位密碼子從谷氨酸(GAG)突變?yōu)槔i氨酸(GTG),導(dǎo)致鐮狀血紅蛋白(sickle haemoglobin,HbS)生成。在脫氧狀態(tài)下,HbS通過疏水鍵聚集形成多聚體,進(jìn)而破壞紅細(xì)胞結(jié)構(gòu),使其逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殓牋罴t細(xì)胞,并引起血管閉塞、溶血性貧血及血管病變。β-地中海貧血則是由HBB基因發(fā)生點突變、短片段插入或缺失所致,其引起患者β-珠蛋白鏈合成減少(β+)或缺失(β0),進(jìn)而導(dǎo)致α-珠蛋白鏈與β-珠蛋白鏈合成失衡,冗余的α-珠蛋白鏈在紅細(xì)胞及其前體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自氧化并在細(xì)胞膜上沉積,造成細(xì)胞內(nèi)氧化損傷及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,最終導(dǎo)致機體發(fā)生溶血及無效造血。由于攜帶β-血紅蛋白病相關(guān)突變的人群體內(nèi)瘧原蟲生長受抑制,惡性瘧疾進(jìn)程緩解,所以HBB突變在瘧疾暴露環(huán)境中經(jīng)長期的自然選擇而得到富集,最終呈現(xiàn)為β-血

紅蛋白病與瘧疾的流行地區(qū)在地理分布上的高度重疊。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步,除非洲地區(qū)外的大部分地區(qū)瘧疾已得到控制,但β-血紅蛋白病的地區(qū)性流行已成為全球醫(yī)療衛(wèi)生的新負(fù)擔(dān)。

1.3 β-血紅蛋白病的常規(guī)治療手段 目前,β-血紅蛋白病的常規(guī)治療策略主要集中在輸血、藥物治療及造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)移植。輸血治療是臨床上最為常用的治療手段,但其需伴隨除鐵治療,以避免輸血及無效造血導(dǎo)致的鐵過載損傷機體心臟、肝臟、內(nèi)分泌器官等多種臟器。藥物治療通過誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)抑制SCD患者中βS-珠蛋白聚集,緩解β-地中海貧血癥患者中α-珠蛋白的冗余情況,從而緩解β-血紅蛋白病臨床表型。目前臨床常用藥物包括羥基脲、地西他濱、組蛋白脫乙酰酶抑制劑及沙利度胺等[4-6]。最近臨床使用的羅特西普可通過促進(jìn)紅細(xì)胞晚期成熟降低β-地中海貧血患者的輸血需求[7]。此外,通過減少鐮狀細(xì)胞脫水或鐮化(GBT440),或針對SCD患者易發(fā)生血管閉塞現(xiàn)象(Crizanlizumab)開發(fā)的多種藥物均已被證實具有臨床治療效果[8-9]。

與輸血及藥物治療不同,HSCs移植是目前β-血紅蛋白病僅有的治愈性治療手段,但由于供體來源有限,通常只有少數(shù)具有人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)相合同胞供體的患者有機會接受HSCs移植手術(shù)。對179例接受HLA相合同胞供體骨髓來源HSCs移植的重型β-地中海貧血癥患者術(shù)后情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),移植后罹患急性或慢性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的患者比例達(dá)到了38%及13%[10]。移植過程中患者還需面臨因免疫抑制引起的多種病毒、細(xì)菌及真菌的感染風(fēng)險,以及因化療導(dǎo)致的出血性膀胱炎等并發(fā)癥引起的致死風(fēng)險。HSCs移植手術(shù)通常耗費將近20萬元人民幣,其中近50%的費用用于購買與抑制免疫排斥及GVHD相關(guān)的藥物,這也為患者家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。

2 基因治療

基因治療指將外源重組核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)至靶細(xì)胞中,利用核酸序列本身或其基因表達(dá)產(chǎn)物調(diào)節(jié)、修復(fù)、替換、添加或刪除相關(guān)基因序列,從而達(dá)到疾病治療等作用。其中針對單基因遺傳病,基因治療的策略主要包括基因替代、基因沉默及基因編輯。基因替代療法主要通過外源提供具有正常功能的目的基因序列,彌補功能缺失的突變基因,適用于較小的隱形突變疾病治療?；虺聊煼▌t主要通過RNA干擾技術(shù)實現(xiàn)致病突變基因的沉默,適用于顯性突變疾病的治療。而基因編輯療法是利用不同的基因編輯工具實現(xiàn)靶位點的基因序列插入、刪除或替換,從而破壞、修復(fù)或激活目的基因的表達(dá),以達(dá)到疾病治療效果。

近年來,基因編輯工具的快速發(fā)展,為基因治療的推進(jìn)提供了有力的技術(shù)支持?，F(xiàn)有基因編輯工具已從早期蛋白質(zhì)介導(dǎo)靶序列識別的鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease,ZFN)及轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN),發(fā)展至RNA介導(dǎo)靶序列識別的CRISPR(clustered regularly interspaced palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated protein)系統(tǒng)。這些基因編輯工具介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks,DSBs)后,斷裂位點處發(fā)生非同源末端連接(nonhomologous end joining,NHEJ)介導(dǎo)的隨機插入或缺失(insertions and deletions,indels)并引起相應(yīng)靶序列的破壞,或在特定細(xì)胞周期中通過同源定向重組(homology directed repair,HDR)機制利用同源模板實現(xiàn)基因序列的精確修復(fù)或修改。

將失去或部分失去核酸酶活性的Cas蛋白(dCas或nCas)與胞嘧啶脫氨酶、腺苷脫氨酶或逆轉(zhuǎn)錄酶融合開發(fā)的胞嘧啶單堿基編輯器(cytidine base editor,CBE)、腺嘌呤單堿基編輯器(adenine base editor,ABE)及先導(dǎo)編輯器(prime editor,PE),可在不產(chǎn)生DSBs的情況下,實現(xiàn)精確的堿基編輯或短片段的插入、缺失或修改。這些新工具在豐富基因編輯類型的同時,減少了DSBs及NHEJ修復(fù)介導(dǎo)的副產(chǎn)物產(chǎn)生及相關(guān)細(xì)胞毒性[11-13]。Cas蛋白同系物或變體以其差異化的PAM識別序列及蛋白大小,進(jìn)一步拓展了基因編輯療法對不同致病突變的適用性,并優(yōu)化了基因編輯工具在臨床轉(zhuǎn)化上的可操作性[14-17]。

2.1 β-血紅蛋白病的基因治療策略 β-血紅蛋白病的基因治療策略指對患者來源HSCs進(jìn)行離體培養(yǎng)及基因修飾,以恢復(fù)其珠蛋白基因簇相關(guān)基因的正常表達(dá),隨后將修飾后的HSCs重新輸注回患者體內(nèi)。該策略不僅可以恢復(fù)患者體內(nèi)血紅蛋白的正常功能,還可以規(guī)避供體有限及GVHD等的限制(圖2),為β-血紅蛋白病的治愈性治療手段的完善提供了可行的思路。β-血紅蛋白病的基因治療策略主要集中于基因替代療法和基因編輯療法,目前多項研究已進(jìn)入臨床試驗階段。

注:①從患者骨髓或動員外周血收集自體HSCs;②對CD34+ 造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞(HSPCs)進(jìn)行體外純化及短期體外培養(yǎng);③基于基因替代療法或基因編輯療法對純化的CD34+ HSPCs進(jìn)行體外基因修飾,使其恢復(fù)珠蛋白基因簇相關(guān)基因的正常表達(dá);④在HSCs移植前,患者需接受由一種或多種化療藥物主導(dǎo)的預(yù)處理方案進(jìn)行化療;⑤在化療結(jié)束后的1～2 d內(nèi),將修飾后的自體HSCs重新輸注回患者體內(nèi),并在后期隨訪監(jiān)測臨床治療效果

2.2 基因替代療法 將具有正常功能的HBB基因轉(zhuǎn)入β-血紅蛋白病患者來源的HSCs以實現(xiàn)基因替代,能使紅系細(xì)胞內(nèi)β-珠蛋白表達(dá)水平升高,Hb A合成增多,從而達(dá)到治療β-血紅蛋白病的效果。相較于野生型β-珠蛋白,βA-T87Q-珠蛋白突變體具有更強的抑制HbS聚集及紅細(xì)胞鐮化的效果,可用于SCD的治療。目前,藍(lán)鳥公司已證實利用慢病毒載體遞送βA-T87Q-珠蛋白編碼序列至β-血紅蛋白病患者來源的HSCs后進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植的策略可行。SCD患者的臨床試驗結(jié)果顯示,2/3的患者在接受治療后的3.3～5.1年內(nèi)維持穩(wěn)定的βA-T87Q-珠蛋白表達(dá)水平,鐮狀紅細(xì)胞比例降低,并擺脫了輸血依賴性;1/3的患者降低了輸血需求,但后續(xù)輸血過程對βA-T87Q-珠蛋白表達(dá)存在抑制作用[18]。而β-地中海貧血癥患者在治療后15.7個月至6年時間內(nèi)表現(xiàn)出輸血依賴性降低,其中24/26例患者轉(zhuǎn)變?yōu)榉禽斞蕾囆?且其無效紅細(xì)胞生成及鐵螯合癥狀均得到有效緩解[18-19]。2019年,基于βA-T87Q-珠蛋白基因替代療法開發(fā)的Zynteglo(Bluebird)在歐盟有條件地獲批上市,用于治療輸血依賴性β-地中海貧血癥(transfusion-dependent β-thalassemia,TDT)。

國內(nèi)多個研究團(tuán)隊也正在對該基因替代療法的有效性及安全性進(jìn)行驗證。其中康霖生物于2022年5月公布的KL003臨床試驗結(jié)果顯示,其較Zynteglo(Bluebird)縮短了移植后粒細(xì)胞及血小板植入時間至最長19 d,降低了治療過程中的感染及出血風(fēng)險。由中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院和上海本導(dǎo)基因合作開展的BD211臨床試驗(NCT05015920)也于2022年7月公布了1例β0/β0患者在治療后3個月的隨訪期內(nèi)保持血紅蛋白水平的不斷提升,初步擺脫了輸血依賴性。目前,各項研究的后續(xù)隨訪工作仍在持續(xù)進(jìn)行。

然而,目前針對該基因替代療法的主要爭議集中于與慢病毒整合活性相關(guān)的插入性腫瘤發(fā)生風(fēng)險。Zynteglo(Bluebird)的HGB-206 A組(NCT02140554)臨床試驗中,2例SCD患者在接受治療后分別被診斷出骨髓細(xì)胞異常增生癥(myelodysplastic syndrome,MDS)及急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML),致使Zynteglo的相關(guān)臨床試驗及在市銷售被迫中斷。后續(xù)Bluebird公司自行調(diào)查發(fā)現(xiàn),MDS患者的惡性細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)慢病毒載體整合現(xiàn)象,而AML患者中慢病毒載體整合于VAMP4基因內(nèi)含子上,但未發(fā)現(xiàn)該整合事件與AML發(fā)生存在相關(guān)性[20-21]?；诖?βA-T87Q-珠蛋白基因替代療法已重新恢復(fù)臨床研究。2022年8月17日,美國FDA宣布,批準(zhǔn)Bluebird公司開發(fā)的基因療法Zynteglo上市,用于治療需要接受常規(guī)血紅細(xì)胞輸注的β-地中海貧血患者。Bluebird為Zynteglo的定價為280萬美元,成為價格最昂貴的藥物。但是,基于慢病毒載體遞送功能性基因的療法涉及的病毒整合活性相關(guān)的安全性問題、以及病毒載體在造血干細(xì)胞中的長期表達(dá)是否會被沉默等關(guān)鍵問題,仍有待長時間的隨訪研究。

2.3 基于基因編輯療法誘導(dǎo)HBG表達(dá) 遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在癥(hereditary persistence of fetal hemoglobin,HPFH)指部分成人體內(nèi)γ-珠蛋白未被沉默,因此Hb F仍維持高表達(dá)水平的現(xiàn)象。通常HPFH群體無明顯臨床癥狀,但對于同時患有β-血紅蛋白病的患者而言,高水平的Hb F可抑制SCD患者體內(nèi)的HbS聚集現(xiàn)象,并緩解β-地中海貧血癥患者體內(nèi)α-珠蛋白鏈與β-珠蛋白鏈間合成失衡情況。實際上,當(dāng)Hb F表達(dá)水平達(dá)到20%以上即可有效緩解SCD患者的臨床表型[22-23]。因此,利用基因編輯技術(shù)對HSCs進(jìn)行精確的基因修飾以誘導(dǎo)HBG基因表達(dá)是治療β-血紅蛋白病的可行思路,其具體可通過降低HBG基因轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL11A的表達(dá),或模擬HPFH在HBG啟動子區(qū)相關(guān)突變以減少BCL11A的結(jié)合抑制作用來實現(xiàn)(圖3)。

注:①棕色框則表示BCL11A+58紅系增強子區(qū)核心基序,靶向破壞該基序可抑制BCL11A的表達(dá),進(jìn)而實現(xiàn)Hb F的激活;②圖中紅色框表示HBG1/2的轉(zhuǎn)錄抑制因子及其靶向結(jié)合基序,綠色框表示特定HPFH突變?yōu)橄嚓P(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子提供新的結(jié)合位點,可激活Hb F的表達(dá)

2.3.1 抑制BCL11A表達(dá)以激活Hb F表達(dá)的治療策略 BCL11A是HBG基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子。敲低BCL11A可使原代成紅細(xì)胞中γ-珠蛋白表達(dá)水平升高3.5～6.5倍,并使Hb F表達(dá)水平升高至23.6%～35.9%[24-25]。紅系特異性敲低BCL11A的表達(dá)水平,可在不影響淋巴細(xì)胞分化成熟及HSCs移植后造血重建的同時,有效激活Hb F的表達(dá)。BCL11A序列中10 kb紅系特異性增強子區(qū)域的發(fā)現(xiàn)為這一策略提供了可操作性。該區(qū)域中包含3個DNase Ⅰ超敏位點,根據(jù)其與BCL11A轉(zhuǎn)錄起始位點間的距離(kb)分別將其命名為+55、+58及+62?；贑RISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行飽和誘變進(jìn)一步確認(rèn)靈長類動物中+58 區(qū)TGN7-9WGATAR Half E-box/GATA1結(jié)合基序是BCL11A增強子區(qū)的核心序列(圖3),可作為紅系特異性敲低BCL11A的理想靶點[26]。

現(xiàn)有研究已嘗試?yán)肸FN及CRISPR/Cas9系統(tǒng)在BCL11A+58核心基序處誘導(dǎo)隨機indels,以破壞其增強子活性,從而降低BCL11A表達(dá)水平,實現(xiàn)Hb F有效激活。其中基于ZFN系統(tǒng)開發(fā)的ST-400/BIVV003(Sangamo Therapeutics)已進(jìn)入臨床試驗階段。ST-400在TDT患者中的隨訪結(jié)果顯示,在移植后5例受試患者體內(nèi)Hb F表達(dá)水平最高可提升至(23.5±11.4)%,但在后續(xù)隨訪過程中(65～117周)回落至(7.7±4.1)%,患者未能擺脫輸血依賴性[27]。而BIVV003在4例SCD患者中的臨床試驗則表現(xiàn)出了有效的臨床治療效果,移植后13周患者Hb F表達(dá)水平升高至15%～29%,所有患者均未出現(xiàn)血管閉塞危象[28]。基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向破壞BCL11A+58紅系增強子的多項基因治療臨床研究也已得到初期結(jié)果。其中CTX001(CRISPR Therapeutics and Vertex Pharmaceuticals)的臨床試驗中,患者在移植后6個月HSPCs中可檢測到的平均indels率均>70%[29-30]。其中TDT患者在移植后3個月體內(nèi)總血紅蛋白水平平均提升至>90 g/L,至最后一次隨訪時(移植后1.2～37.2個月)僅有2例TDT患者需再次接受輸血治療[29];而SCD患者在移植后3個月,Hb F表達(dá)水平提升至>20%,直至最后一次隨訪時(移植后2.0～32.3個月)未有患者出現(xiàn)血管閉塞性危象[30]。

我國多個研究團(tuán)隊也基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向破壞BCL11A+58增強子區(qū)的治療策略展開了臨床試驗。其中華東師范大學(xué)吳宇軒團(tuán)隊、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院及上海邦耀聯(lián)合發(fā)起的BRL-101臨床試驗(IIT)結(jié)果顯示,2例TDT患者在移植自體HSPCs后45 d紅細(xì)胞數(shù)量及總血紅蛋白水平開始穩(wěn)定增加,并在第75天左右達(dá)到健康水平[31];至移植后18個月時,患者Hb F水平達(dá)到142.7～158.8 g/L,并維持輸血非依賴性及鐵代謝情況的明顯改善[31]。2022年11月,ET-01(博雅輯因)報告的臨床試驗結(jié)果中,1例β0/β+患者的接受ET-01輸注后18個月,體內(nèi)Hb F表達(dá)水平提升至89.87 g/L,總血紅蛋白水平提升至110 g/L,在移植后87 d～15個月的時間內(nèi)患者無需再次輸血[32]。整體來看,基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在BCL11A+58位核心序列中誘導(dǎo)indels的策略在國內(nèi)外的臨床試驗中均有效誘導(dǎo)Hb F表達(dá)水平提升,對β-血紅蛋白病具有顯著的治療效果,并且表現(xiàn)出較高的安全性。

此外,利用單堿基編輯器在BCL11A+58位核心序列處誘導(dǎo)點突變也是抑制BCL11A表達(dá)的可行思路。在健康人群及β-地中海貧血癥患者來源HSPCs中測試發(fā)現(xiàn),ABE8e可在BCL11A+58位核心序列中的多個位點誘導(dǎo)高效的基因編輯,并使γ-珠蛋白表達(dá)水平升高至原來的4倍[33]。通過電穿孔遞送A3A(N57Q)-BE3/sgRNA復(fù)合物至β-血紅蛋白病患者來源的HSPCs中,也可實現(xiàn)86.3%～93.3%的堿基替代,并有效提高Hb F表達(dá)水平,具有一定臨床轉(zhuǎn)化價值[34]。

2.3.2 模擬HPFH在HBG啟動子區(qū)相關(guān)突變以激活Hb F表達(dá)的治療策略 HPFH群體中HBG基因啟動子區(qū)的序列突變是其γ-珠蛋白持續(xù)表達(dá)的主要原因。其中,位于-115區(qū)及-200區(qū)附近的突變簇使得BCL11A和ZBTB7A等抑制蛋白不能有效結(jié)合,從而解除了這些蛋白對HBG的轉(zhuǎn)錄抑制作用;相反地,-110 A>C、-113 A>G、-175 T>C及-198 T>C突變?yōu)椴煌D(zhuǎn)錄激活因子提供了新的結(jié)合位點,促進(jìn)其對HBG的轉(zhuǎn)錄激活作用(圖3)。相比之下,利用基因編輯技術(shù)在β-血紅蛋白病患者HSPCs中誘導(dǎo)HBG啟動子區(qū)發(fā)生天然存在的HPFH突變,有望在基因型及表型上更接近HPFH群體的臨床實例,是激活Hb F表達(dá)更加安全且有效的策略。

基于這一思路開發(fā)的基因治療藥物EDIT-301(Editas Medicine)及RM-001(廣州瑞風(fēng)生物)已進(jìn)入臨床試驗階段[35-37]。兩者分別通過CRISPR/Cas12a及CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HBG啟動子-115區(qū)CCAAT box處誘導(dǎo)indels以破壞BCL11A結(jié)合位點,激活Hb F表達(dá)。其中,EDIT-301在TDT患者動員外周血來源CD34+細(xì)胞中可誘導(dǎo)>80%的靶位點編輯,并改善TDT患者來源CD34+細(xì)胞紅系體外成熟受阻情況[35]。廣州瑞風(fēng)生物開發(fā)的靶點藥物RM-001在全球范圍內(nèi)率先在β0/β0患者中進(jìn)行了臨床試驗。截至目前,該公司已經(jīng)完成5例重癥β地貧患者的IIT治療,所有患者均在移植1個月后脫離輸血[36-37]。已公布的隨訪數(shù)據(jù)中,患者在移植了經(jīng)過修飾的自體HSCs后4個月Hb F表達(dá)量可達(dá)100 g/L,達(dá)到良好的臨床治療效果[36-37]。目前該療法的IND(investigational new drug)申請也獲得了中國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn),正在開展臨床試驗。

利用單堿基編輯工具誘導(dǎo)HBG啟動子區(qū)點突變是另外一種治療策略?，F(xiàn)有研究顯示,利用hA3A-BE3/gRNA編輯系統(tǒng)可在-115C及-114C誘導(dǎo)約22% C>D(D包含A、T、G)的堿基取代效率,誘導(dǎo)<2%的indels,并未發(fā)現(xiàn)HBG2片段丟失現(xiàn)象[38]。對健康或患者來源的HSPCs進(jìn)行相應(yīng)編輯,證實該點突變可提高γ-珠蛋白表達(dá)水平至58.1%及44.2%[38]。新開發(fā)的eA3A-BE3及eeA3A-BE3系統(tǒng)可進(jìn)一步提高堿基替代效率及后續(xù)γ-珠蛋白激活水平[39]。此外,近期研究利用ABE8e對β-地中海貧血癥患者來源HSPCs中HBG-115區(qū)及BCL11A+58紅系增強子區(qū)進(jìn)行雙重編輯,使體外誘導(dǎo)的紅細(xì)胞中γ-珠蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步提高至約60%[33]。利用單堿基編輯工具模擬HBG-175 T>C點突變或-200區(qū)突變簇處點突變也被證實是可行的基因編輯治療策略[40-41]。目前單堿基編輯策略還存在遞送效率和安全性評估等臨床轉(zhuǎn)化所密切關(guān)注的問題。

2.4 基于基因編輯療法精確修復(fù)HBB突變位點 盡管已有大量研究致力于通過藥物或基因編輯手段誘導(dǎo)Hb F表達(dá)以治療β-血紅蛋白病,但相比于Hb A,Hb F更強的氧結(jié)合能力是否會引起治療后患者組織缺氧仍未可知。因此,直接修復(fù)HBB基因突變是一種更理想的策略。

SCD的致病突變?yōu)镚lu6Val,治療靶點單一明確。基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)及rAAV6遞送的同源供體,可激活HSPCs中HDR修復(fù)通路以實現(xiàn)突變位點處的精確校正。但在未富集的情況下,該策略僅能實現(xiàn)約19%的基因修復(fù),并產(chǎn)生約60%的隨機indels,影響HBB基因的正常表達(dá)[42]。相比之下,利用ABE8e-NRCH將致病纈氨酸(GTG)轉(zhuǎn)換為天然存在的非致病丙氨酸(GCG),可使SCD患者來源HSPCs紅系分化后的βS-珠蛋白水平從(87±1.3)%降低至(17±3.0)%,細(xì)胞鐮化率從47.7%降低至16.3%,具有一定的臨床治療意義[43]。

β-地中海貧血的致病突變類型繁多,針對不同的突變類型需建立不同的基因編輯策略。我國大陸地區(qū)β-地中海貧血癥群體中6種主要的HBB基因突變類型為CD41/42(-TTCT)、CD17(A>T)、IVS-II-654(C>T)、-28(A>G)、CD26(G>A)、CD71/72(+A)。利用TALEN或CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)IVS-II-654(C>T)突變處產(chǎn)生隨機indels,可破壞因突變造成的異常剪接位點,恢復(fù)HBBmRNA的正常剪接以達(dá)到臨床治療的效果[44-45]?；贑RISPR/Cas9與同源供體介導(dǎo)的HDR通路,研究者也在CD41/42(-TTCT)突變患者來源的人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(hiPSCs)以及三原核胚胎中已實現(xiàn)了對該位點的校正[46-48]。但與SCD的研究結(jié)果類似,DSBs的修復(fù)過程常伴隨明顯的NHEJ修復(fù)通路偏好[46-48],并會影響基因治療的精確性及有效性。

鑒于β-地中海貧血相關(guān)HBB突變多為點突變,利用單堿基編輯器或先導(dǎo)編輯器在靶位點處誘導(dǎo)精確的堿基修復(fù)同樣具有可行性[49]。我國多個研究團(tuán)隊已針對大陸地區(qū)常見的β-地中海貧血癥突變類型提出了有效的精確修復(fù)方案。其中,利用BE3 mRNA/sgRNA可在攜帶HBB-28(A>G)純合突變的人核移植胚胎中介導(dǎo)7.0%～25.9%的堿基修復(fù)效率[50]?；陔姶┛走f送的A3A(N57Q)-BE3/sgRNA復(fù)合體可進(jìn)一步在患者動員外周血來源HSPCs中HBB-28位點介導(dǎo)68.2% C>T的修復(fù)效率[34]。利用ABE8e和ABE8e-SpRY也可使攜帶CD26(G>A)雜合突變的患者來源HSPCs中野生型基因頻率從50.1%提升至90.7%及77.6%,并在小鼠實驗中使正常β-血紅蛋白水平提升至66.7%及76.3%[33]。此外,ABE8e-SpRY也可對攜帶IVS-Ⅱ-654(C>T)雜合突變患者來源HSPCs進(jìn)行基因校正,使野生型基因頻率從50.0%提升至77.9%,并使異常剪接mRNA比例從84.5%降低至36.3%[33]。不同PAM依賴性的單堿基編輯工具的開發(fā)及先導(dǎo)編輯器的出現(xiàn),為更多HBB突變的精確修復(fù)提供了選擇。

3 β-血紅蛋白病的基因治療策略的總結(jié)與展望

總的來說,基因治療策略的發(fā)展為β-血紅蛋白病的治療提供了更多的選擇。外源呈遞βA-T87Q-珠蛋白編碼序列或激活機體自身的γ-珠蛋白基因表達(dá)是β-血紅蛋白病治療的通用思路,目前相關(guān)研究較為成熟,并已有多項研究進(jìn)入臨床試驗階段;而對突變位點進(jìn)行精確修復(fù)的策略則需根據(jù)具體突變類型進(jìn)行不斷地優(yōu)化完善?？紤]到研究的經(jīng)濟成本,盡管精確修復(fù)HBB突變的治療理念充滿吸引力,但對部分?jǐn)y帶極罕見HBB突變的患者而言,采用β-血紅蛋白病通用的基因治療手段是更為可行的方案。而與基因替代療法相比,基于基因編輯技術(shù)的治療策略通過瞬轉(zhuǎn)基因編輯工具實現(xiàn)靶位點編輯,可在不發(fā)生外源片段隨機整合的情況下,通過改變HSCs的DNA序列實現(xiàn)長期的基因治療效果,安全性相對更高。

在基因編輯工具的選擇上,ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系統(tǒng)均可在HSCs靶位點處誘導(dǎo)DSBs并進(jìn)行NHEJ修復(fù)實現(xiàn)以較高的indels水平,在β-血紅蛋白病的基因治療策略中應(yīng)用廣泛,并已有多項相關(guān)研究進(jìn)入臨床試驗階段[51]。但與DSBs相關(guān)的p53通路的激活、基因組大片段丟失及染色體重排風(fēng)險,以及隨機indels帶來的非預(yù)期基因編輯產(chǎn)物,均可能影響基因編輯的安全性及治療效果[52-53]。新一代的基因編輯工具,如單堿基編輯器(ABE或CBE)及先導(dǎo)編輯器,可規(guī)避DSBs的產(chǎn)生并實現(xiàn)精確的基因編輯,從而降低靶位點處的indels水平,提高了基因編輯的精確性。但值得注意的是,受脫氨酶活性的影響,CBE系統(tǒng)在全基因組水平及全轉(zhuǎn)錄組水平上存在脫靶風(fēng)險,其中部分研究發(fā)現(xiàn)脫靶位點在原癌基因及抑癌基因上[54-55]。同時,單堿基編輯器的編輯窗口內(nèi)發(fā)生非預(yù)期編輯也會為堿基編輯修復(fù)帶來副產(chǎn)物,影響基因治療效果[56]。新開發(fā)的TadCBE系統(tǒng)基于TadA-8e進(jìn)化得到了具有胞嘧啶脫氨酶活性的TadA-CD,其在保留靶位點處C>T高編輯效率的同時,有效降低了由脫氨酶引起的Cas9非依賴性脫靶效率[57]?；诖碎_發(fā)的TadCBE V106W系統(tǒng)進(jìn)一步縮小了堿基編輯窗口,在編輯特異性上表現(xiàn)出了更好的應(yīng)用前景[57]。但如何開發(fā)出更加系統(tǒng)科學(xué)的全基因組脫靶研究技術(shù)和分析方法仍是目前亟需解決的難點之一。此外,目前單堿基編輯工具在HSCs水平的遞送效率有限,通過多次電穿孔遞送RNP或以mRNA形式進(jìn)行遞送可在一定程度上提高遞送效率,但多次電穿孔會造成明顯的細(xì)胞損傷,mRNA的不穩(wěn)定性也可能影響治療結(jié)果的一致性[34,43]。因此,進(jìn)一步優(yōu)化基因編輯工具的遞送策略也是目前β-血紅蛋白病的基因編輯療法的優(yōu)化方向之一。

綜上所述,現(xiàn)有臨床試驗結(jié)果展現(xiàn)了β-血紅蛋白病基因治療策略的顯著療效,為患者帶來了重生的希望,但我們?nèi)孕柰ㄟ^長時間的隨訪來了解新療法的安全性及藥效時間等問題。

利益相關(guān)聲明:論文內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:黃軍就負(fù)責(zé)組織起草論文框架,提供寫作思路,并對論文內(nèi)容進(jìn)行審閱和修訂;劉倩宜負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查閱和整理,論文撰寫;陳曉琳、劉思邈、李欣瑜負(fù)責(zé)論文的校閱修改。