地中海貧血預(yù)防和診療技術(shù)進展

張婷婷, 徐湘民

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院地中海貧血診治創(chuàng)新研究中心、南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室(廣東廣州 510515)

全球有5%～20%的人群攜帶α-地貧基因和1.5%的人群攜帶β-地貧基因,超過90%的患者分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。中國南方大部分省(自治區(qū))是地貧高發(fā)區(qū),我們的研究顯示中國南方人群α-地貧的平均攜帶率為16.77%,β-地貧的平均攜帶率為4.70%[2],該病高發(fā)地區(qū)的遺傳負(fù)荷已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-2]。地貧發(fā)病機制及表型異質(zhì)性等方面的基礎(chǔ)研究進展為該病預(yù)防、診治及其技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),地貧篩查技術(shù)、診斷方法和治療方案的進步為降低地貧患兒出生率和改善患者的生活狀態(tài)提供了技術(shù)支撐[3-4]。同時,技術(shù)的進步促進基礎(chǔ)研究的發(fā)展,二者相輔相成?；蛑委熜录夹g(shù)的發(fā)展和BCL11A等β-地貧表型重要修飾基因的發(fā)現(xiàn)為地貧患者提供了新的治療方案[5-6],同時也帶動了β-地貧基因治療領(lǐng)域的臨床研究和治療實踐;近十多年來高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展推動了該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。包括地貧在內(nèi)的血紅蛋白病更多的遺傳突變位點被發(fā)現(xiàn),為臨床精準(zhǔn)診斷和遺傳咨詢提供了保障[7];目前世界上3個血紅蛋白病專病數(shù)據(jù)庫:HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar)、IthaGenes(https://www.ithanet.eu/db/ithagenes)和本團隊建立的Leiden開放變異-中國數(shù)據(jù)庫(Leiden Open Variation Database-China,LOVD-China,http://www.genomed.zju.edu.cn/LOVD3/genes)[8-10]。其中本團隊建立的數(shù)據(jù)庫,全面系統(tǒng)記錄了中國人群α-和β-珠蛋白基因簇上的變異及每個變異的詳細(xì)信息,并首次創(chuàng)建了血紅蛋白病在線輔助精準(zhǔn)診斷和風(fēng)險評估系統(tǒng)[10]。

1 表型篩查技術(shù)及其應(yīng)用

通過在地貧高發(fā)區(qū)進行公共衛(wèi)生教育、實施大規(guī)模的地貧人群篩查和產(chǎn)前診斷計劃,已有效減少了該病患兒的新生兒出生數(shù)量,針對地貧的成功實踐成為歷史上單基因病人群防控的典范[11]。大規(guī)模人群表型篩查是產(chǎn)前診斷的基本前提,傳統(tǒng)上,應(yīng)用血細(xì)胞自動分析儀,首先通過全血細(xì)胞計數(shù)(full blood counting,FBC)技術(shù),采用平均紅細(xì)胞體積(mean corpuscular volume,MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin,MCH),以及血紅蛋白A2(Hb A2)含量作為檢測指標(biāo),對婚前和孕早期育齡夫婦進行常規(guī)篩查,當(dāng)受檢個體表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素貧血特征時,即視為陽性地貧攜帶者,并通過Hb A2含量的改變初步區(qū)分為α-和β-地貧攜帶者[11-12]。表型篩查中,常應(yīng)用凝膠電泳、毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)或高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)等血紅蛋白檢測技術(shù),篩查異常血紅蛋白及各種血紅蛋白含量,用于輔助地貧類型的初步診斷[4,11]。表型篩查的目的是發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險夫婦,當(dāng)夫妻雙方經(jīng)基因診斷進一步確診為同種地貧(夫妻同為α-或β-地貧)基因突變攜帶者時,即被確定為產(chǎn)前診斷的適應(yīng)對象[11]。產(chǎn)前診斷應(yīng)用的主要技術(shù)手段以DNA診斷為基礎(chǔ),主要通過3種有創(chuàng)性取材方法:絨毛取樣、羊膜腔穿刺和臍帶穿刺,獲得足量的胎兒DNA樣本后,結(jié)合家系分析進行基于胎兒地貧基因突變檢測的產(chǎn)前診斷,診斷為地貧患者的胎兒,可通過選擇性流產(chǎn)終止妊娠達(dá)到地貧預(yù)防的目的[11-12]。

上述傳統(tǒng)篩查所針對的血細(xì)胞和血紅蛋白檢測對象,在技術(shù)特異性上有明顯缺陷,且操作流程繁瑣,近幾十年來血紅蛋白病的高通量質(zhì)譜篩查新技術(shù)不斷發(fā)展[13],其中針對疾病發(fā)生特異性改變的珠蛋白肽鏈的質(zhì)譜檢測技術(shù)引人注目,如串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry,MS-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術(shù)[14-15]。前者是在胰蛋白酶消化后基于α-珠蛋白鏈的蛋白特異性肽段靶分子分析策略,以穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的肽作為內(nèi)標(biāo)進行定量進而得到每個樣品中血紅蛋白的濃度。該方法能同時實現(xiàn)血紅蛋白變體的定性分析和血紅蛋白的定量檢測,可用于α-和β-地貧的篩查;后者是一種不需要酶解肽段步驟,即基于完整珠蛋白肽鏈進行快速檢測的分析策略,直接準(zhǔn)確定性和定量不同珠蛋白鏈的豐度比。本團隊已建立了用于β-地貧及異常血紅蛋白篩查的MALDI-TOF MS技術(shù)方案,并通過大規(guī)模人群樣本和臨床病例分組樣本的應(yīng)用評價,證明該方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確和低成本的性能優(yōu)勢,適用于大規(guī)模人群篩查,并可很好區(qū)分臨床上的中間型和重型β-地貧[15]。針對α-地貧新標(biāo)志物[16]的同類MS篩查技術(shù)正在研發(fā)中,基于珠蛋白全肽鏈的質(zhì)譜檢測新技術(shù),有望成為未來檢測血紅蛋白病的“一線篩查方法”(‘First Line Screening Assay’),從而改變傳統(tǒng)的地貧遺傳篩查操作流程。

2 分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用

根據(jù)血液學(xué)表型篩查結(jié)果檢出陽性樣品后,需利用DNA檢測技術(shù)在分子水平上鑒定致病基因[β-珠蛋白基因(HBB)或α-珠蛋白基因(HBA)]的突變類型及基因型,這樣才能達(dá)到確診的目的。地貧的傳統(tǒng)分子診斷一般以PCR技術(shù)為基礎(chǔ),國內(nèi)外比較成熟的診斷缺失型α-地貧和δβ-地貧/HPFH大片段缺失,多采用跨越斷裂位點(Gap-PCR)和多重連接依賴探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技術(shù)[4,11-12],前者應(yīng)用于檢測常見的缺失型α-地貧突變—-α3.7,-α4.2和--SEA等,后者用于檢測目標(biāo)序列的拷貝數(shù)異常以及大片段缺失,除驗證已知缺失類型的突變外,通常也用于鑒定未知大片段缺失型的地貧樣本。檢測地貧基因點突變的技術(shù)有PCR結(jié)合反向斑點雜交(reverse dot blot,RDB)和分子信標(biāo)探針熔解曲線技術(shù)[17-18]等,這些技術(shù)均依據(jù)已知突變位點及序列設(shè)計探針,用于檢測α-或(和)β-地貧突變及其基因型。傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)均具有局限性,如Gap-PCR和PCR-RDB實驗操作過程較繁瑣,檢測突變種類數(shù)少;MLPA分析則受限于其探針?biāo)采w范圍,且操作過程復(fù)雜、耗時長,不適用于大樣本檢測;熔解曲線技術(shù)突變圖譜復(fù)雜,結(jié)果判定需要足夠的經(jīng)驗,且受技術(shù)穩(wěn)定性影響等。

近10多年來,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,使地貧的診斷更加全面與快捷。應(yīng)用于全基因組、外顯子組或靶向基因組的二代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)可快速高通量地全面檢測各種遺傳變異,不僅能檢測出整個珠蛋白基因編碼區(qū)及其關(guān)鍵調(diào)控區(qū)的遺傳變異,同時也能檢出該病的遺傳修飾基因突變,除有助于實現(xiàn)個體化精準(zhǔn)診斷外,也為開展地貧的遺傳病理機制研究提供了有用的工具[2]?；陂L讀長的第三代測序技術(shù)(third-generation sequencing,TGS)在檢測大片段缺失以及拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV),尤其針對同源性高、GC含量豐富的DNA序列檢測上具有技術(shù)優(yōu)越性,能夠準(zhǔn)確區(qū)分HBA1和HBA2基因以及β-珠蛋白基因簇上有診斷價值的高度同源序列,正確辨別復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異和同源重組的真實遺傳攜帶者狀態(tài),已成為一種準(zhǔn)確高效的地貧檢測新方法,并在地貧的產(chǎn)前診斷應(yīng)用中被證明,TGS較基于PCR方法可以提供更多的遺傳檢測信息[7,19]。與傳統(tǒng)的基因分型方法相比,NGS和TGS方法可以滿足基因組水平廣泛遺傳變異的一次性分析,如α-和β-地貧的共遺傳,紅系先天性貧血多病共存,致病基因和遺傳修飾突變對表型的貢獻,罕見突變的發(fā)現(xiàn)等,以及繪制準(zhǔn)確的α-和β-基因簇單倍型等。高通量測序技術(shù)代表了遺傳檢測的發(fā)展趨勢,該技術(shù)在血紅蛋白病領(lǐng)域的應(yīng)用我國處于領(lǐng)先水平,我們組織國內(nèi)團隊與華大基因合作,推動了NGS技術(shù)應(yīng)用于地貧遺傳檢測的發(fā)展[2],2022年華大基因研制的基于NGS的α-和β-地貧基因檢測試劑盒,已取得國家藥監(jiān)局的醫(yī)療器械注冊證。目前,包括我們團隊在內(nèi),國內(nèi)外正致力于研發(fā)基于高通量測序的用于地貧無創(chuàng)產(chǎn)前診斷[20-21]和植入前診斷[22]的適宜技術(shù)。用于地貧“分子篩查”(‘Molecular Screening’)的高通量技術(shù)是未來可預(yù)期的發(fā)展方向。

3 遺傳治療技術(shù)及其應(yīng)用

長期規(guī)范性輸血結(jié)合鐵螯合劑祛鐵治療是臨床上治療重型β-地貧(輸血依賴性β-地貧,transfusion-dependent thalassemia,TDT)患者的常規(guī)手段,也是保障患者生命的維持療法。而造血干細(xì)胞骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)是能根治TDT患者的臨床治療手段。該療法將與患者人類白細(xì)胞抗原(HLA)匹配的供者的造血干細(xì)胞植入患者體內(nèi),即通過異基因造血干細(xì)胞移植達(dá)到根治目的。國內(nèi)外TDT造血干細(xì)胞治療都是從全相合骨髓移植開始,再發(fā)展為半相合骨髓移植,我國雖然這一領(lǐng)域的工作起步較晚,但經(jīng)過20多年的臨床實踐,我國的TDT半相合干細(xì)胞移植進展迅速,治療成功率顯著提升,目前已達(dá)到國際領(lǐng)先水平。盡管如此,受移植配型供者來源匱乏,患者年齡及健康狀況指標(biāo)等因素制約,骨髓移植的受益者人數(shù)仍十分有限[1]。

隨著病毒載體和基因編輯技術(shù)的不斷成熟,近幾年來,針對TDT患者的基因治療臨床研究和應(yīng)用取得了重大突破,正在成為目前臨床上根治β-地貧的可選擇的新療法[1,5]。自體干細(xì)胞離體回輸(ex vivo)是目前TDT基因療法的主要策略,即從患者體內(nèi)獲取CD34+造血干細(xì)胞,離體細(xì)胞在體外進行基因修飾,修飾的治療細(xì)胞再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。采用患者自體干細(xì)胞避免了移植免疫排斥風(fēng)險,這也是基因治療的技術(shù)優(yōu)勢,同時,基因治療技術(shù)會給成人TDT患者帶來希望。BMT是基因治療的基礎(chǔ),移植前清髓預(yù)處理方案是保證基因治療成功的重要環(huán)節(jié)[23]。目前國內(nèi)外TDT基因治療有兩種技術(shù)方案:(1)攜帶β-珠蛋白基因(HBB)的慢病毒載體技術(shù),即在患者CD34+細(xì)胞中轉(zhuǎn)染經(jīng)修飾的HBB,替代體內(nèi)突變基因,恢復(fù)β-珠蛋白鏈的正常表達(dá);(2)采用基因編輯技術(shù)修飾患者CD34+細(xì)胞中抑制γ-珠蛋白基因(HBG)的轉(zhuǎn)錄因子BCL11A,或直接修飾HBG調(diào)控原件,使胎兒血紅蛋白(Hb F)重新激活,替代體內(nèi)缺失的成人血紅蛋白(HbA)。目前由藍(lán)鳥公司(Bluebird Bio)生產(chǎn),采用一次性給藥治療TDT患者的慢病毒載體制劑(Betibeglogene autotemcel,beti-cel)[24],已經(jīng)獲得歐洲和美國藥監(jiān)部門的批準(zhǔn),成為世界上首款上市的TDT基因療法新藥。此外,至少還有4款用于β-血紅蛋白病(TDT或鐮狀細(xì)胞貧血)治療的慢病毒載體或基因編輯制劑已經(jīng)取得了歐美的新藥臨床試驗申請(investigational new drug,IND)批準(zhǔn)[25-28]。國內(nèi)的生物技術(shù)公司與高校和醫(yī)院合作,正在積極推進具有自主知識產(chǎn)權(quán)TDT基因治療技術(shù)的臨床研究,目前已有3款用于治療TDT的基因編輯技術(shù)的IND申請獲國家藥監(jiān)局批準(zhǔn),正在開展新藥臨床試驗[29-30];還有2款TDT慢病毒載體新藥正在開展研究者發(fā)起的臨床試驗,目前國內(nèi)已實施了30多例TDT基因治療。上述國內(nèi)外新藥已經(jīng)完成或正在開展的臨床試驗,多數(shù)取得了使TDT患者擺脫輸血依賴的令人欣喜的臨床療效。近期,國內(nèi)研究團隊采用慢病毒載體技術(shù)完成了世界首例輸血依賴型α-地貧患兒的基因治療,也取得“擺脫輸血”的臨床療效。

4 結(jié)語

綜上所述,近10多年來該領(lǐng)域在發(fā)展地貧預(yù)防和診療新技術(shù)上有了長足的進步,基于珠蛋白肽鏈特異性分析的高通量質(zhì)譜新技術(shù)為全面快速篩查地貧提供了新的解決方案。高通量測序技術(shù)可高效檢出更廣泛和復(fù)雜的地貧遺傳變異,彌補了傳統(tǒng)分子診斷的局限性,代表了未來地貧遺傳檢測的發(fā)展方向。我國β-地貧半相合骨髓移植先進方案的應(yīng)用,以及國內(nèi)外β-地貧自體干細(xì)胞基因治療臨床試驗所取得的顯著療效,為改善地貧患者生活質(zhì)量、減少疾病負(fù)擔(dān)帶來了新希望。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻說明:張婷婷負(fù)責(zé)論文撰寫及修改,徐湘民負(fù)責(zé)論文指導(dǎo)及修改。