子宮內(nèi)膜癌患者NLRC5與自噬蛋白表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義*

李燕，李從青，何閏華，衛(wèi)兵

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，安徽 合肥 230601）

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，也是女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，子宮內(nèi)膜癌多發(fā)于圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性，近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)上升，且呈年輕化趨勢(shì)[1-2]。目前，針對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的治療仍以手術(shù)為主，同時(shí)輔助放化療，但對(duì)晚期患者的療效仍然有限，且預(yù)后相對(duì)較差[3-4]。目前，臨床認(rèn)為影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的因素主要為病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度等，而隨著近年來(lái)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NLR家族含CARD結(jié)構(gòu)域5（NOD-like receptor family caspase activation and recruitment domain containing 5,NLRC5）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，且可能與疾病的預(yù)后密切相關(guān)[5]。NLRC5是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的NLR樣受體家族中的受體之一，通過干擾素（Interferon,IFN）和核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）分別與NLRC5的啟動(dòng)點(diǎn)相結(jié)合，可發(fā)揮NLRC5在細(xì)胞與細(xì)胞核之間穿梭的特性，增加了調(diào)控功能和范圍[6]。自噬是人體自我保護(hù)機(jī)制，在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞器與蛋白質(zhì)質(zhì)量控制上具有一定意義，若缺乏或過度激活則可導(dǎo)致一系列病理系反應(yīng)[7]。已有文獻(xiàn)證實(shí)，自噬與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病關(guān)系密切，但其與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的相關(guān)性仍未完全明確[8]?；诖?，本研究探討子宮內(nèi)膜癌患者NLRC5表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3表達(dá)的相關(guān)性，并探討NLRC5、Beclin1、LC3與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的相關(guān)性，旨在為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后制訂相關(guān)防治方案提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2022年1月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院90例子宮內(nèi)膜癌患者的癌組織作為子宮內(nèi)膜癌組，另取90例正常子宮內(nèi)膜作為子宮內(nèi)膜組。子宮內(nèi)膜癌組平均（61.03±5.27）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（22.98±1.03）kg/m2；正常子宮內(nèi)膜組平均（60.74±5.15）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（23.17±1.01）kg/m2。兩組的年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合子宮內(nèi)膜癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，且經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診；②FIGO分期為Ⅰ～Ⅲ期；③入組前均未接受過相關(guān)放化療等治療；④接受腹腔鏡手術(shù)治療；⑤患者及家屬簽署知情同意書。正常子宮內(nèi)膜組均經(jīng)宮腔鏡取組織活檢病理診斷為正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并凝血功能障礙；③合并多臟器功能不全；④有精神及認(rèn)知功能障礙無(wú)法交流或配合。本研究已獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)

收集90例子宮內(nèi)膜癌患者癌組織與正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本組織。按照mRNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明書步驟提取組織總mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測(cè)NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA的表達(dá)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火40 s，72℃延伸90 s，共循環(huán)45～50次；72 ℃延伸5 min。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。NLRC5正向引物：5'-CTATCAACTGC CCTTCCACAAT-3'，反向引物：5'-TCTCTATCTGCC CACAGCCTAC-3'，引物長(zhǎng)度2 000 bp；Beclin1正向引物：5'-AGCACCATGCAGGTGAGCTT-3'，反向引物：5'-TGACACGGTCCAGGATCTTG-3'，引物長(zhǎng)度929 bp；LC3正向引物：5'-AGCAGCATCCAACC AAATC-3'，反向引物：5'-CTGTGTCCGTTCACCAAC AG-3'，引物長(zhǎng)度119 bp。以GAPDH為內(nèi)參，正向引物：5'-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'，反向引物：5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3'，引物長(zhǎng)度80～160 bp。

1.3 預(yù)后分組

術(shù)后對(duì)90例子宮內(nèi)膜癌患者進(jìn)行12個(gè)月的隨訪，按照實(shí)體瘤RECIST 1.0標(biāo)準(zhǔn)[10]：完全緩解為所有可測(cè)量病灶完全消失，且維持時(shí)間> 4周；部分緩解為各病灶最大徑之和橫徑乘積減少≥50%，且維持時(shí)間> 4周；病情穩(wěn)定為各病灶最大徑乘積總和減少未超過50%或增大未超過25%，且維持時(shí)間>4周；病情進(jìn)展各病灶最大徑乘積總和增大超過25%，有新的病灶出現(xiàn)。完全緩解、部分緩解、病情穩(wěn)定為預(yù)后良好，病情進(jìn)展為預(yù)后不良。將子宮內(nèi)膜癌患者根據(jù)預(yù)后情況分為預(yù)后不良組與預(yù)后良好組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson法；影響因素的分析采用多因素一般Logistic回歸模型；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic curve,ROC）曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

子宮內(nèi)膜癌組與正常子宮內(nèi)膜組的NLRC5、Beclin1和LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；子宮內(nèi)膜癌組NLRC5 mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常子宮內(nèi)膜組低（P<0.05），Beclin1和LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常子宮內(nèi)膜組高（P<0.05）。見表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌組與正常子宮內(nèi)膜組NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n =90，±s）

表1 子宮內(nèi)膜癌組與正常子宮內(nèi)膜組NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n =90，±s）

組別子宮內(nèi)膜癌組正常子宮內(nèi)膜組t 值P 值NLRC5 mRNA 0.49±0.10 1.00±0.12 30.974 0.000 Beclin1 mRNA 1.72±0.10 1.00±0.08 53.337 0.000 LC3 mRNA 1.58±0.08 1.00±0.15 32.367 0.000

2.2 NLRC5與Beclin1、LC3的相關(guān)性分析

NLRC5與Beclin1（r=-0.565，P=0.014）、LC3（r=-0.421，P=0.031）呈負(fù)相關(guān)；Beclin1與LC3呈正相關(guān)（r=0.462，P=0.025）。

2.3 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的臨床資料比較

根據(jù)12個(gè)月的隨訪結(jié)果，預(yù)后良好的72例（80.00%）納入預(yù)后良好組。預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的年齡、體質(zhì)量指數(shù)、脈管浸潤(rùn)、腫瘤直徑比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。預(yù)后良好組和預(yù)后不良組的FIGO分期、宮體肌層深肌層占比、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Beclin1、LC3、NLRC5 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；預(yù)后不良組的FIGO分期、宮體肌層深肌層占比、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Beclin1 mRNA、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于預(yù)后良好組，NLRC5 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于預(yù)后良好組。見表2。

表2 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的臨床資料比較

2.4 子宮內(nèi)膜癌預(yù)后影響因素的多因素一般Logistic回歸模型分析

以預(yù)后為因變量，以FIGO分期、宮體肌層、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及NLRC5、Beclin1、LC3為自變量（賦值見表3），進(jìn)行多因素一般Logistic回歸分析（引入水準(zhǔn)為0.05，排除水準(zhǔn)為0.10），結(jié)果顯示：FIGO分期Ⅱ、Ⅲ期[=3.760（95% CI：1.260，11.223）]、宮體肌層深肌層[=26.800（95% CI：7.043，101.984）]、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[=11.324（95% CI：3.286，39.019）]及Beclin1 [=68.163（95% CI：2.537，643.326）]、LC3 [=26.468（95% CI：1.444，485.127）]均是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P<0.05）；NLRC5 [=0.001（95% CI：0.000，0.079）]為保護(hù)因素（P<0.05）。見表4。

表3 賦值表

表4 子宮內(nèi)膜癌預(yù)后影響因素的多因素一般Logistic回歸分析參數(shù)

2.5 子宮內(nèi)膜癌NLRC5、Beclin1、LC3表達(dá)對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

將NLRC5、Beclin1、LC3作為檢驗(yàn)變量，將子宮內(nèi)膜癌預(yù)后作為狀態(tài)變量（0 =預(yù)后良好，1 =預(yù)后不良），繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，NLRC5的曲線下面積（area under the curve,AUC）為0.790（95% CI：0.652，0.929）、敏感性為82.8%（95% CI：0.784，0.923）、特異性為73.9%（95% CI：0.670，0.938）；Beclin1的AUC為0.742（95% CI：0.625，0.858）、敏感性為56.8%（95% CI：0.638，0.853）、特異性為77.8%（95% CI：0.644，0.877）；LC3的AUC為0.678（95% CI：0.546，0.810）、敏感性為57.3（95% CI：0.680，0.815）、特異性為72.2%（95% CI：0.693，0.824）；聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.887（95% CI：0.812，0.963）、敏感性為94.4%（95% CI：0.824，0.971）、特異性為62.5%（95% CI：0.593，0.778）。見表5和圖1。

圖1 NLRC5、Beclin1、LC3表達(dá)預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的ROC曲線

表5 子宮內(nèi)膜癌NLRC5、Beclin1、LC3表達(dá)對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)效能

3 討論

我國(guó)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率已成為僅次于宮頸癌的第二大常見婦科惡性腫瘤，約占全部婦科惡性腫瘤的20%～30%，嚴(yán)重威脅世界女性的健康[11]。近年來(lái)，隨著治療方案不斷更新，子宮內(nèi)膜癌的治療效果明顯改善，大部分早期患者手術(shù)治療可有效得到根治，但晚期患者的生存率仍然較低。有研究表明，子宮內(nèi)膜癌的治療效果受到局部病灶未得到有效控制、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等諸多因素的影響，另外浸潤(rùn)深度、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等也是導(dǎo)致預(yù)后不良的因素[12-13]。但上述因素仍無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估預(yù)后，對(duì)指導(dǎo)臨床預(yù)后價(jià)值較低。因此，尋找影響子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)分子生物學(xué)特征，研究新型腫瘤分子標(biāo)志物對(duì)判斷患者預(yù)后、制訂治療方案等具有重要意義。

NLRC5又稱MHCⅠ類反式激活因子（class I trans-activator,CⅠTA），是MHCⅠ類抗原提呈通路的主要轉(zhuǎn)錄激活因子，該基因定位于人類基因組的16q13，編碼1 886個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)由3個(gè)區(qū)域組成，分別為C端亮氨酸重復(fù)（leucine-rich repeats,LRRs）區(qū)、NATCH區(qū)和N短的DD區(qū)。NLRC5基因功能缺失會(huì)影響MHCⅠ類基因的表達(dá)，導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞無(wú)法有效活化，從而發(fā)生腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。ZHAN等[14]相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NLRC5與腫瘤抗原遞呈密切相關(guān)，NLRC5表達(dá)缺失可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌患者NLRC5介導(dǎo)的自噬免疫逃避。SHUKLA等[15]研究亦發(fā)現(xiàn)，NLRC5是MHCⅠ類基因與APM基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子，NLRC5遺傳損傷與表觀遺傳修飾是癌癥中MHCⅠ缺陷的常見原因，均可說明NLRC5與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組NLRC5表達(dá)較正常子宮內(nèi)膜組低，且預(yù)后不良組的NLRC5表達(dá)低于預(yù)后良好組，NLRC5表達(dá)與Beclin1、LC3呈負(fù)相關(guān)，可見NLRC5低表達(dá)可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與不良預(yù)后，且與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。分析原因可能是NLRC5受自噬調(diào)節(jié)，而自噬作為保守溶酶體降解途徑，在該過程中細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)可被降解與再循環(huán)。通過維持機(jī)體細(xì)胞代謝的平衡，可改善細(xì)胞的生存環(huán)境，阻斷機(jī)體DNA突變，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞的作用。另外，自噬負(fù)責(zé)降解體內(nèi)的毒性物質(zhì)及相關(guān)分解產(chǎn)物，并再次利用，進(jìn)而達(dá)到抑制癌細(xì)胞的效果。國(guó)外學(xué)者研究證實(shí)，自噬與炎癥密切相關(guān)，在炎癥相關(guān)的疾病中自噬發(fā)揮調(diào)控作用，在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等癌癥中可抑制腫瘤的發(fā)生[16]。

LC3主要負(fù)責(zé)形成自噬體的雙膜延伸，在機(jī)體中以可溶性形式（LC3-Ⅰ）與膜結(jié)合形式（LC3-Ⅱ）存在，而其中LC3-Ⅱ是公認(rèn)的最可靠自噬生物標(biāo)志物[17]。Beclin1是自噬體形成過程中的重要分子之一，其可介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于吞噬泡，對(duì)哺乳動(dòng)物自噬體的形成與成熟起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。Beclin1-P13KC3復(fù)合體利于吞噬泡聚集與組裝，同時(shí)還可募集Atg16L等多聚體及LC3，利于促進(jìn)吞噬泡的伸展擴(kuò)展，使吞噬泡膜逐漸發(fā)展為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)抑癌基因相比，Beclin1基因僅在雙等位染色體共同表達(dá)時(shí)才可發(fā)揮抑癌作用。LI等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1可與E3泛素連接酶（Cullin 3,CUL3）相互作用，促進(jìn)K48連接的泛素化與蛋白降解，另通過下調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)可引起自噬活性下降。ZHU等[19]研究亦表明，Beclin1過表達(dá)說明自噬活性增強(qiáng)，而Atg5敲除后可增加Beclin1表達(dá)，從而對(duì)細(xì)胞增殖起到抑制作用，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組Beclin1、LC3表達(dá)較正常子宮內(nèi)膜組高，且在預(yù)后不良組Beclin1、LC3也呈高表達(dá)，分析其原因可能如下：①自噬細(xì)胞通過對(duì)細(xì)胞異常增殖的抑制，可阻礙癌癥的發(fā)生及進(jìn)展。自噬可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的變化，改變細(xì)胞的增殖，使異常增殖的細(xì)胞停止細(xì)胞分裂。②自噬作為腫瘤的抑制與啟動(dòng)因子，其主要作用受到疾病類型、分期、腫瘤微環(huán)境等因素的影響。自噬水平的降低可促進(jìn)腫瘤早期的癌細(xì)胞增殖，相反高表達(dá)可去除毒性成分，并提供循環(huán)生長(zhǎng)因子，延長(zhǎng)腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞的生存時(shí)間[20]。

本研究多因素一般Logistic回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅱ、Ⅲ期，分化程度低中分化，宮體肌層深肌層，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，與周露秋[21]等研究結(jié)果相似。本研究中ROC曲線分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌NLRC5、Beclin1、LC3及3者聯(lián)合預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的AUC為0.790（95% CI：0.652，0.929）、0.742（95% CI：0.625，0.858）、0.678（95% CI：0.546，0.810）、0.887（95% CI：0.812，0.963），提示臨床可監(jiān)測(cè)癌組織中NLRC5與自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，并采取針對(duì)性防治措施，以改善預(yù)后。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌患者NLRC5呈低表達(dá)，NLRC5與自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3呈負(fù)相關(guān)，3者聯(lián)合檢測(cè)可提高子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。