依達(dá)拉奉右莰醇通過鐵死亡-脂質(zhì)過氧化通路對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制

毛權(quán)西，李作孝

腦出血是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，具有致殘率和致死率高的特點(diǎn)，目前治療主要以減輕血腫以及抑制血腫周圍腦組織水腫為主［1］，但治療效果較差。腦出血后血腫周圍腦組織繼發(fā)病理生理損害是腦出血致殘、致死的重要因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡在腦出血后血腫周圍腦組織繼發(fā)病理生理損害中具有重要作用［2］。其特征為鐵沉積、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性下降、活性氧（ROS）大量產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化［3］。依達(dá)拉奉具有清除氧自由基作用而用于腦梗死、腦出血治療，依達(dá)拉奉右莰醇具有清除氧自由基和抗炎雙重作用，用于治療缺血性腦卒中療效顯著［4］，但其用于腦出血的治療研究尚鮮見。本研究應(yīng)用依達(dá)拉奉右莰醇干預(yù)腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，檢測腦出血大鼠氧化應(yīng)激、炎性免疫、鐵死亡、脂質(zhì)過氧化等指標(biāo)變化，探討其對(duì)腦出血的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 128 只SPF 級(jí)成年健康雄性SD 大鼠，6～9周齡，體質(zhì)量250～300 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2018-17。大鼠以常規(guī)條狀顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，定時(shí)清理鼠籠，更換墊料，保持動(dòng)物房清潔衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)及操作符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求（倫理編號(hào)：2021-0601-1）。

1.1.2 主要試劑與儀器 依達(dá)拉奉注射液（國藥準(zhǔn)字H20031342）、依達(dá)拉奉右莰醇注射用濃溶液（國藥準(zhǔn)字H20200007）購自南京先聲藥業(yè)有限公司；膠原酶Ⅶ購自Sigma 公司。GPX4 抗體、長鏈脂酰輔酶A 合成酶4（ACSL4）抗體、磷脂膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶3（LPCAT3）抗體、抗GAPDH抗體購自英國Abcam 公司；ROS 試劑盒、總谷胱甘肽（T-GSH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大腦立體定位儀（型號(hào)：464601，RWD 公司），微板法酶標(biāo)儀（型號(hào)：DR-200Bs，Diatek公司），倒置顯微鏡（型號(hào)：CX33，OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將128只大鼠分為假手術(shù)組、腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組，每組32只。各組分別設(shè)術(shù)后1、3、7和14 d各4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分配8只大鼠。除假手術(shù)組外，其余組大鼠構(gòu)建急性腦出血模型。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，術(shù)前大鼠禁食禁水8 h，天平稱質(zhì)量后，使用10%水合氯醛（腹腔注射，300 mg/kg）進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠常規(guī)消毒、備皮后將其置于立體定位儀，并于大鼠頂部行正中切口，充分暴露頭骨，定位右側(cè)尾狀核，以前囟為原點(diǎn)，右側(cè)旁開3.0 mm，向前0.5 mm將顱骨鉆直徑為1 mm的孔。接下來對(duì)立體定向儀做調(diào)整，將0.1 U膠原酶Ⅶ沿鉆孔進(jìn)針至顱骨下5.5 mm 處的尾殼核緩慢注射，于5 min 內(nèi)緩慢注入，注射完畢后針頭保持原位10 min 防止回流；緩慢退出針頭后用醫(yī)用骨蠟封閉骨孔，無出血后消毒并縫合皮膚持續(xù)飼養(yǎng)，并對(duì)大鼠進(jìn)行標(biāo)記［5］。假手術(shù)組進(jìn)行相同手術(shù)操作，經(jīng)顱骨鉆孔后注入等體積生理鹽水。術(shù)后死亡大鼠被剔除，并及時(shí)補(bǔ)足相應(yīng)數(shù)量的大鼠。造模2 h后，依達(dá)拉奉組腹腔注射依達(dá)拉奉6 mg/kg，每12 h注射1次。依達(dá)拉奉右莰醇組腹腔注射依達(dá)拉奉右莰醇7.5 mg/kg，每12 h注射1 次，假手術(shù)組和腦出血組腹腔注射等量生理鹽水。造模后各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取8 只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，3 只麻醉后用4%組織固定液灌注固定，斷頭后取出完整腦組織置于組織固定液中，其余5只于各組預(yù)定時(shí)間點(diǎn)麻醉后將大鼠進(jìn)行常規(guī)灌注，斷頭后取出完整腦組織，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。造模成功判斷?biāo)準(zhǔn)：造模后可見大鼠立即出現(xiàn)神經(jīng)功能異常表現(xiàn)，主要為左側(cè)肢體出現(xiàn)癱瘓，提起其尾巴時(shí)，可見左側(cè)前肢屈曲，右側(cè)前肢伸展正常；當(dāng)推大鼠時(shí)，其向左側(cè)旋轉(zhuǎn)爬行。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 根據(jù)改良Garcia評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］對(duì)各實(shí)驗(yàn)組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)估內(nèi)容：自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)對(duì)稱性、前肢伸展運(yùn)動(dòng)、爬網(wǎng)能力、身體觸覺反射及胡須碰觸反應(yīng)6個(gè)項(xiàng)目，每項(xiàng)0～3分，總分18分，神經(jīng)功能評(píng)分越低，神經(jīng)損傷程度越重。

1.2.3 HE染色觀察血腫周圍腦組織病理變化 將大鼠血腫周圍腦組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定24 h 以上，然后用梯度乙醇脫水后石蠟包埋，將蠟塊切片（片厚4 μm）后脫蠟，進(jìn)行HE 染色，脫水后封片，應(yīng)用400倍光學(xué)顯微鏡觀察腦組織病理變化。

1.2.4 化學(xué)熒光法檢測血腫周圍腦組織ROS 含量 將各組大鼠腦組織從冰箱取出放在培養(yǎng)皿上，沿進(jìn)針點(diǎn)冠狀面切開腦組織，用眼科剪沿血腫周圍區(qū)域取腦組織，稱取腦組織質(zhì)量，冰水浴條件下將腦組織機(jī)械勻漿，離心10 min 后取上清液，加入熒光探針，避光孵育后進(jìn)行熒光檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書具體步驟操作。

1.2.5 微量酶標(biāo)法檢測血腫周圍腦組織GSH 含量 各組大鼠腦組織從冰箱取出后用眼科剪沿血腫周圍區(qū)域取腦組織，采用微量酶標(biāo)法檢測GSH含量，按照測試盒說明操作。

1.2.6 Western blot 檢測血腫周圍腦組織相關(guān)蛋白ACSL4、LPCAT3、GPX4 的表達(dá) 各組大鼠腦組織從冰箱中取出后，用眼科剪取大鼠血腫周圍腦組織約10 mg，用預(yù)冷的PBS 緩沖液漂洗后，加入組織蛋白提取劑200 μL（每1 mL蛋白提取劑：960 μL RIPA 總蛋白裂解液+10 μL PMSF+10 μL 蛋白酶抑制劑+10 μL 磷酸酶抑制劑A+10 μL 磷酸酶抑制劑B），冰浴徹底勻漿，4 ℃條件下以12 000 r/min 離心5 min 后取上清液，應(yīng)用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜。將封閉液加入轉(zhuǎn)好的膜，1 h 后漂洗并加入一抗［兔源抗ASCL4 抗體（1∶3 000）、LPCAT3 抗體（1∶1 000）、GPX4 抗體（1∶1 000）、GAPDH抗體（1∶10 000）］，于4 ℃孵育過夜。洗膜后加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育30 min，用ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能變化 組內(nèi)比較：假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組神經(jīng)功能評(píng)分均在術(shù)后3 d 時(shí)最低，術(shù)后7 d、14 d 逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：術(shù)后各時(shí)點(diǎn)腦出血組神經(jīng)功能評(píng)分低于假手術(shù)組，依達(dá)拉奉組、依達(dá)拉奉右莰醇組神經(jīng)功能評(píng)分高于腦出血組，依達(dá)拉奉右莰醇組神經(jīng)功能評(píng)分高于依達(dá)拉奉組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of neurological function scores between the four groups of rats表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，）

Tab.1 Comparison of neurological function scores between the four groups of rats表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，）

＊P＜0.05；組間比較：a與假手術(shù)組比較，b與腦出血組比較，c與依達(dá)拉奉組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與1 d比較，B與3 d比較，C與7 d比較，P＜0.05；表2—4同。

組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F n8 8 8 8神經(jīng)功能評(píng)分1 d 17.75±0.46 11.88±1.13a 13.25±1.28b 14.25±0.89bc 55.514＊3 d 17.75±0.46 9.50±0.93aA 11.63±1.06bA 13.38±0.74bcA 142.848＊7 d 17.88±0.35 13.38±0.92aAB 14.75±1.04bAB 15.88±0.64bcAB 47.331＊14 d 18.00±0.00 14.75±0.89aABC 16.00±0.76bABC 17.50±0.53bcABC 42.507＊F 0.828 43.110＊25.950＊52.234＊

2.2 血腫周圍腦組織病理變化 假手術(shù)組大鼠各時(shí)點(diǎn)腦組織未見明顯病理改變。腦出血組大鼠在術(shù)后1 d時(shí)血腫周圍腦組織出現(xiàn)紅細(xì)胞浸潤，少量炎性細(xì)胞聚集；術(shù)后3 d時(shí)血腫周圍腦組織大量紅細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列不規(guī)則、疏松，細(xì)胞間隙變大，神經(jīng)細(xì)胞變性，大量炎性細(xì)胞聚集；術(shù)后7 d 時(shí)血腫周圍腦組織紅細(xì)胞浸潤減少，水腫減輕；術(shù)后14 d時(shí)腦組織病理改變較7 d 時(shí)進(jìn)一步減輕。依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤較腦出血組減輕。依達(dá)拉奉右莰醇組病理損傷程度明顯輕于依達(dá)拉奉組。見圖1。

Fig.1 Histopathological changes of rat brain in each group(HE staining,×400)圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化（HE染色，×400）

2.3 各組大鼠血腫周圍腦組織ROS 含量變化 組內(nèi)比較：假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血腫周圍腦組織ROS 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織ROS含量均在術(shù)后3 d 時(shí)最高，術(shù)后7 d、14 d 逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：術(shù)后各時(shí)點(diǎn)腦出血組大鼠血腫周圍腦組織ROS含量高于假手術(shù)組，1 d 時(shí)依達(dá)拉奉組與腦出血組血腫周圍腦組織ROS 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉組、依達(dá)拉奉右莰醇組血腫周圍腦組織ROS 含量均低于腦出血組，依達(dá)拉奉右莰醇組血腫周圍腦組織ROS含量低于依達(dá)拉奉組（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Changes of ROS content in brain tissue around hematoma of rats in each group表2 各組大鼠血腫周圍腦組織ROS含量變化（n=5，RFU/mgprot，）

Tab.2 Changes of ROS content in brain tissue around hematoma of rats in each group表2 各組大鼠血腫周圍腦組織ROS含量變化（n=5，RFU/mgprot，）

組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F ROS含量1 d 401.13±34.85 2 627.93±191.86a 2 575.42±232.30 2 378.65±193.52b 176.405＊3 d 419.31±12.77 4 843.82±248.58aA 4 208.64±151.22bA 2 850.56±271.71bcA 438.943＊7 d 469.35±50.88 4 259.69±252.67aAB 2 780.60±307.92bB 1 560.46±181.28bcAB 273.577＊14 d 423.93±40.35 2 301.21±162.10aABC 1 353.92±130.66bBC 648.05±29.06bcABC 311.623＊F 3.006 161.608＊145.064＊129.150＊

2.4 各組大鼠血腫周圍腦組織GSH 含量變化 組內(nèi)比較：假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血腫周圍腦組織GSH含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織GSH含量均在術(shù)后3 d時(shí)最低，術(shù)后7 d、14 d逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：術(shù)后各時(shí)點(diǎn)腦出血組大鼠血腫周圍腦組織GSH 含量低于假手術(shù)組，1 d 時(shí)依達(dá)拉奉組血腫周圍腦組織GSH 含量與腦出血組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉組、依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織GSH含量均高于腦出血組，依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織GSH 含量高于依達(dá)拉奉組（P＜0.05）。見表3。

Tab.3 Changes of GSH content in brain tissue around hematoma of rats in each group表3 各組大鼠血腫周圍腦組織GSH含量變化（n=5，μmol/g，）

Tab.3 Changes of GSH content in brain tissue around hematoma of rats in each group表3 各組大鼠血腫周圍腦組織GSH含量變化（n=5，μmol/g，）

組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F GSH含量1 d 15.44±1.19 5.54±0.60a 6.54±1.10 6.92±0.71b 121.032＊3 d 15.19±1.27 0.90±0.76aA 1.27±0.98A 2.95±1.04bcA 219.383＊7 d 15.16±1.18 2.14±0.86aAB 6.11±0.95bB 7.55±0.94bcB 152.153＊14 d 16.04±0.40 7.28±1.18aABC 9.8±0.79bABC 14.89±1.34bcABC 86.897＊F 0.725 56.782＊67.218＊116.679＊

2.5 各組大鼠血腫周圍腦組織鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá) 組內(nèi)比較：假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血腫周圍腦組織GPX4、LPCAT3、ACSL4表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織GPX4 表達(dá)均在術(shù)后3 d時(shí)最低，術(shù)后7 d、14 d 逐漸升高；LPCAT3、ACSL4 表達(dá)均在術(shù)后3 d 時(shí)最高，術(shù)后7 d、14 d 逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：術(shù)后各時(shí)點(diǎn)腦出血組大鼠血腫周圍腦組織GPX4表達(dá)低于假手術(shù)組，LPCAT3、ACSL4 表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.05）；1 d時(shí)依達(dá)拉奉組血腫周圍腦組織LPCAT3表達(dá)與腦出血組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉組、依達(dá)拉奉右莰醇組血腫周圍腦組織GPX4表達(dá)高于腦出血組，ACSL4、LPCAT3 表達(dá)低于腦出血組（P＜0.05）；依達(dá)拉奉右莰醇組血腫周圍腦組織GPX4表達(dá)高于依達(dá)拉奉組，LPCAT3、ACSL4表達(dá)低于依達(dá)拉奉組（P＜0.05）。見圖2、表4。

Fig.2 Changes in expression of ferroptosis-related proteins in brain tissue around hematoma of rats in each group圖2 各組大鼠血腫周圍腦組織鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

Tab.4 Changes of ACSL4,LPCAT3 and GPX4 expression in brain tissue around hematoma of rats in each group表4 各組大鼠血腫周圍腦組織ACSL4、LPCAT3和GPX4表達(dá)變化（n=5，）

組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F ACSL4 1 d 0.06±0.01 0.43±0.03a 0.38±0.04b 0.30±0.03bc 162.535＊3 d 0.06±0.01 0.72±0.03aA 0.65±0.04bA 0.49±0.05bcA 383.899＊7 d 0.06±0.01 0.59±0.02aAB 0.48±0.03bAB 0.19±0.04bcAB 451.068＊14 d 0.06±0.01 0.28±0.04aABC 0.18±0.03bABC 0.09±0.01bcABC 76.947＊F 0.000 209.196＊164.729＊125.193＊組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F LPCAT3 1 d 0.08±0.01 0.59±0.03a 0.55±0.06 0.41±0.03bc 191.531＊3 d 0.08±0.01 0.84±0.03aA 0.74±0.07bA 0.54±0.04bcA 338.113＊7 d 0.08±0.01 0.71±0.04aAB 0.57±0.03bB 0.24±0.04bcAB 366.208＊14 d 0.08±0.01 0.39±0.02aABC 0.27±0.03bABC 0.12±0.04bcABC 128.922＊F 0.000 194.560＊76.592＊120.285＊組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F GPX4 1 d 0.70±0.03 0.41±0.04a 0.49±0.04b 0.56±0.04bc 491.616＊3 d 0.70±0.03 0.15±0.04aA 0.27±0.03bA 0.35±0.03bcA 865.259＊7 d 0.70±0.03 0.25±0.03aAB 0.32±0.03bAB 0.49±0.06bcAB 749.863＊14 d 0.70±0.03 0.49±0.03aABC 0.58±0.02bABC 0.66±0.03bcABC 134.870＊F 0.000 84.135＊111.808＊50.498＊

3 討論

腦出血是腦卒中的一種亞型，腦出血后血腫周圍腦組織可產(chǎn)生一系列繼發(fā)性損傷，包括自由基釋放，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、壞死、自噬及炎癥等［7］。Zille等［8］研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡相關(guān)特征，抑制細(xì)胞鐵死亡可改善腦出血后神經(jīng)元損傷。提示鐵死亡與腦出血后繼發(fā)性損傷密切相關(guān)。

鐵死亡是一種受調(diào)節(jié)的非凋亡細(xì)胞死亡方式。研究表明鐵死亡與腦梗死、阿爾茨海默病、帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［9］。Bao 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡相關(guān)信號(hào)通路在腦出血后鐵沉積和神經(jīng)元死亡中起關(guān)鍵作用。腦出血后過量鐵離子可以通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，促進(jìn)不飽和脂肪酸在細(xì)胞膜上的氧化［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，ACSL4和LPCAT3參與不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化，在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用［12-13］。下調(diào)ACSL4 和LPCAT3 表達(dá)可減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用底物的積累，抑制細(xì)胞鐵死亡［14］。GSH是合成GPX4的底物，是GPX4發(fā)揮抗氧化功能的輔助因子，也是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［15］。GPX4 可將磷脂氫過氧化物還原為無毒的脂醇，GPX4表達(dá)上調(diào)能減少脂質(zhì)氫過氧化物的積累，抑制ROS 的形成［16］。ROS 可導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡［17］。本研究結(jié)果顯示，腦出血大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度受損，在1 d 時(shí)開始出現(xiàn)損傷，3 d 時(shí)最為嚴(yán)重；腦出血組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血腫周圍腦組織ACSL4、LPCAT3蛋白表達(dá)水平升高，GSH 含量降低，GPX4 蛋白表達(dá)水平降低，ROS含量增高，提示腦出血大鼠血腫周圍腦組織出現(xiàn)明顯脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)過氧化水平升高，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡，表明鐵死亡參與腦出血后血腫周圍腦組織繼發(fā)病理生理損害。

依達(dá)拉奉作為一種抗氧化劑和自由基清除劑，能透過血腦屏障抑制腦細(xì)胞膜的氧化［18］，上調(diào)GPX表達(dá)，抑制炎癥和氧化反應(yīng)，治療創(chuàng)傷性腦損傷的效果顯著［19］。研究顯示，依達(dá)拉奉在腦出血急性期可減少炎性因子釋放、清除自由基、減輕腦水腫［20］。Zhang 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉可減輕腦室內(nèi)出血引起的腦水腫和神經(jīng)功能損傷，其機(jī)制可能是依達(dá)拉奉減輕了鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Homma等［22］研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉能有效清除自由基、減少脂質(zhì)過氧化物的沉積和ROS 的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞鐵死亡。右莰醇是一種具有抗炎作用的雙環(huán)單萜類化合物，可輕松穿透血腦屏障，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS 生成，并幫助其他藥物順利通過血腦屏障［23］。Wu等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦損傷中，依達(dá)拉奉和右莰醇兩種組分相互協(xié)同，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于兩者單獨(dú)使用。在腦出血模型中，依達(dá)拉奉聯(lián)合右莰醇能減輕血腫周圍腦水腫、維持血腦屏障完整性，其神經(jīng)功能保護(hù)作用優(yōu)于依達(dá)拉奉［25］。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉右莰醇可改善腦出血模型大鼠神經(jīng)功能障礙，減輕血腫周圍腦組織炎性細(xì)胞浸潤及神經(jīng)細(xì)胞變形，在腦出血后3 d、7 d和14 d血腫周圍腦組織LPCAT3、ACSL4 蛋白表達(dá)水平降低，GSH 含量和GPX4 蛋白表達(dá)水平升高，ROS 沉積減少，且依達(dá)拉奉右莰醇的干預(yù)效果優(yōu)于依達(dá)拉奉。其機(jī)制可能是依達(dá)拉奉聯(lián)合右莰醇抑制了ACSL4、LPCAT3蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了GPX4的活性，同時(shí)增加了GSH的生成，抑制了ROS 的產(chǎn)生，降低了脂質(zhì)過氧化水平，抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡，減輕了神經(jīng)細(xì)胞損傷。提示依達(dá)拉奉和依達(dá)拉奉右莰醇可通過調(diào)控脂質(zhì)代謝途徑抑制腦出血神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，且依達(dá)拉奉右莰醇作用優(yōu)于依達(dá)拉奉。

綜上所述，依達(dá)拉奉右莰醇對(duì)腦出血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其原因可能是通過調(diào)節(jié)腦出血大鼠神經(jīng)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少ROS 的產(chǎn)生，減少腦組織脂質(zhì)過氧化，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。脂質(zhì)過氧化通路并非神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡的唯一因素，依達(dá)拉奉右莰醇還可能通過其他途徑抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用，這還有待進(jìn)一步研究。