藍光致棕色挪威大鼠慢性視網(wǎng)膜光損傷的實驗研究

俞永珍，程天豪，鄒秀蘭，章夢一，余洋洋，鄒玉平，3，龐龍

濕性年齡相關(guān)性黃斑變性（wet age related macular degeneration，wAMD）是中老年最常見的致盲性眼?。?］，其中眼底色素沉積與wAMD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，提示黑色素在wAMD 的發(fā)病機制中極為重要［2-3］。近年來研究顯示，慢性光損傷是導致wAMD、視網(wǎng)膜色素變性及其他視網(wǎng)膜變性類眼病的高危因素［4］，而研究光感受器細胞及視網(wǎng)膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell，RPEc）的損傷機制，有助于明確該類疾病的病理發(fā)生機制。藍光在可見光中波長較短，光能量大，穿透性強，故藍光最容易穿透角膜和晶狀體到達眼底視網(wǎng)膜，造成視網(wǎng)膜損傷［5］。棕色挪威（Brown Norway，BN）大鼠是有色鼠，因視網(wǎng)膜和色素成分與人體類似，RPEc及脈絡(luò)膜組織中含有大量的黑色素，且RPEc層和脈絡(luò)膜毛細血管復合體層也與人體類似［3，6］。目前鮮有有色鼠的光損傷相關(guān)研究。筆者推測藍光誘導的BN 大鼠視網(wǎng)膜光損傷可能發(fā)生了類似wAMD 的病理過程，通過建立藍光誘導的慢性視網(wǎng)膜光損傷動物模型，旨在研究藍光照射BN大鼠后光感受器細胞及RPEc的損傷特點及可能損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40 只雄性成年BN 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0011，體質(zhì)量180～200 g，8周齡。在通風良好，氨濃度≤14 mg/m3，相對濕度40%～70%，12 h明/暗的循環(huán)光環(huán)境中適應(yīng)2周，光照前暗適應(yīng)24 h，環(huán)境溫度18～22 ℃。根據(jù)隨機數(shù)字表法分為光照0 d組（正常對照組）和藍光光照組：光照1、3、7及14 d組，每組8只。本研究經(jīng)中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準同意，批準號：SYOW2022023，實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 試劑與儀器 蘇木素染色液、蘇木素分化液、蘇木素返藍液（武漢塞維爾生物有限公司），中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）；大鼠活性氧簇（ROS）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（美國Rapidbio 公司），F(xiàn)L-1D 藍光輻照計（北京師范大學光電儀器廠）；LED 藍光光源（主波峰451 nm，色純度0.982，中山共炫光電科技有限公司）；Topcon眼底照相機（德國Topcon 公司）；電生理儀、Ganzfeld 刺激器（德國羅蘭公司）；金屬環(huán)狀角膜接觸電極、金屬針狀接觸電極（北京高視遠望科技有限責任公司）；BX-51 顯微鏡（日本Olympus 公司），Multiskan Go 酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 LED 藍光光照箱制備 按照大鼠飼養(yǎng)箱規(guī)格用亞克力板制作大鼠藍光光照箱，并分隔為4格；光源用LED藍光燈，保證光照箱的藍光光照強度平均在（1 000±100）Lux，藍光燈的燈板規(guī)格為460 mm×300 mm，4 個角區(qū)域留出10 mm×10 mm 的面積，以利于光照箱內(nèi)空氣流通，光照時將藍光燈朝向內(nèi)部并將燈板置于大鼠飼養(yǎng)箱的頂部，見圖1。光照時保持光照箱內(nèi)溫度為28～32 ℃。

Fig.1 Home-made LED blue light animal light incubator圖1 自制LED藍光冷光源動物光照箱

1.4 處理方法 正常對照組大鼠不進行光照，正常飼養(yǎng)；余各組大鼠均于光照前20 min 給予復方托吡卡胺滴眼液（1 mL/支，沈陽興齊眼藥股份有限公司）散瞳處理，每次1滴，每次間隔5 min，共滴4 次；藍光光照組大鼠每日處于藍光光照環(huán)境中3 h，分別照射1、3、7、14 d。光照結(jié)束后將大鼠送回暗環(huán)境中，給予氯霉素滴眼液滴眼，每次1 滴，每次間隔5 min，滴2次。觀察各組大鼠的行為表現(xiàn)，包括毛發(fā)色澤、精神狀況、食欲、體質(zhì)量、對光聲的刺激反應(yīng)。

1.5 視網(wǎng)膜電流圖（electroretinogram，ERG）檢查 ERG檢查所有操作在暗室內(nèi)微弱紅光燈下進行，采用電生理儀記錄大鼠雙眼ERG信號。BN大鼠暗適應(yīng)6 h后，行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，復方托吡卡胺滴眼液點雙眼散瞳，0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（20 mL/支，日本參天制藥株式會社）點雙眼表面麻醉。將金屬環(huán)狀角膜接觸電極安放在檢測眼的角膜上，盡量使電極與角膜最大接觸，將金屬針狀電極（參考電極及接地電極）分別插在臉頰兩側(cè)和尾部皮下。電生理儀Ganzfeld閃光刺激器提供閃光，閃光強度：3.0 cd·s/m2，背景光強度25 cd·s/m2，每個點至少測量3次，采用雙通道同步采樣記錄，通頻帶0.2～500 Hz，每項記錄重復30 次。記錄最大混合反應(yīng)ERG的a、b波振幅和潛伏期，a波振幅為基線到a波波谷的電位值，a波潛伏期為從光刺激開始至a波波峰的時間；b波振幅為a波波谷至b波波峰的電位值，b波潛伏期為從光刺激開始至b波波峰的時間。

1.6 眼底照相 大鼠完成ERG檢查后，保持瞳孔散大狀態(tài)，必要時酌情行10%水合氯醛腹腔注射麻醉。用眼底照相機采集BN大鼠以視盤為中心的50°范圍的眼底彩照。

1.7 視網(wǎng)膜組織HE 染色 將大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，脊椎脫臼法處死大鼠，隨后立即摘除雙側(cè)眼球，制備石蠟切片，切片厚度4 μm，將切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，依次進行蘇木素染色、分化、返藍、伊紅染色、透明及封片。BX-51顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織切片染色情況，Image-J 軟件測量外層視網(wǎng)膜厚度，即光感細胞層至外核層的視網(wǎng)膜厚度。

1.8 ELISA 檢測視網(wǎng)膜組織ROS 含量 將新鮮摘除的大鼠眼球組織置于冰上，小心去除眼前節(jié)組織并分離出視網(wǎng)膜組織。取100 mg 視網(wǎng)膜組織，加入1 mL 生理鹽水，于4 ℃下3 000 r/min 離心10 min，取上清液，置于1.5 mL 離心管中，-20 ℃保存。按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀測定視網(wǎng)膜組織ROS含量。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 27.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料均符合正態(tài)分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，均經(jīng)Levene 檢驗行方差齊性檢驗，方差不齊時用Dunnett-T3 檢驗進行組間多重比較，方差齊時用LSD-t檢驗進行組間多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 藍光照射對大鼠的行為活動影響 正常對照組飼養(yǎng)期間精神狀態(tài)良好，毛發(fā)有光澤，行動、飲食正常；與正常對照組比較，光照1 d組及光照3 d組在體形、飲食及精神狀態(tài)上無明顯差異，但光照3 d 組對光聲刺激的反應(yīng)遲鈍；光照7 d及14 d組精神較萎靡，毛發(fā)光澤度降低甚至枯槁無光澤，行動稍遲緩，對光聲刺激反應(yīng)更為遲鈍，飲食量減少；光照7 d 及14 d 組體質(zhì)量較正常對照組、光照1 d 及3 d 組減輕（P＜0.05），而光照1 d、3 d 組的體質(zhì)量與正常對照組比較，在各時間點差異無統(tǒng)計學意義；各組大鼠在飼養(yǎng)3、7、14 d 體質(zhì)量均較飼養(yǎng)0 d 增加（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of body mass of rats between different feeding times of each group表1 各組大鼠不同飼養(yǎng)時間的體質(zhì)量比較（n=8，g，）

Tab.1 Comparison of body mass of rats between different feeding times of each group表1 各組大鼠不同飼養(yǎng)時間的體質(zhì)量比較（n=8，g，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F組間=4.840＊，F(xiàn)時間=2 294.410＊＊，F(xiàn)交互=102.980＊＊；a與正常對照組比較，b與光照1 d組比較，c與光照3 d組比較，d與光照7 d組比較，A與0 d比較，P＜0.05。

組別正常對照組光照1 d組光照3 d組光照7 d組光照14 d組F 0 d 186.88±6.42 186.63±5.66 187.50±3.78 186.13±3.94 187.38±6.23 0.089 1 d 190.25±6.30 190.13±5.96 190.75±4.03 189.13±3.94 190.38±6.23 0.101 3 d 196.63±6.17A 196.50±5.90A 193.13±4.85A 193.63±3.25A 195.50±6.12adA 0.734＊7 d 208.25±6.00A 208.50±5.10A 204.00±3.70A 198.25±4.50abcA 199.88±5.30abcdA 7.539＊＊14 d 230.50±6.12A 228.63±5.90A 223.13±3.44A 203.63±3.74abcA 202.25±5.18abcdA 34.697＊＊F 65.188＊＊45.107＊＊105.442＊＊25.906＊＊9.180＊＊

2.2 藍光照射對ERG的影響 與正常對照組比較，光照1 d 組ERG a 波、b 波潛伏期及振幅差異均無統(tǒng)計學意義；光照3、7 及14 d 組的ERG b 波潛伏期逐漸延長，a波、b波振幅逐漸降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of latency and amplitude of ERG a wave and b wave between the five groups表2 各組ERG a波、b波潛伏期和振幅比較（n=8，）

Tab.2 Comparison of latency and amplitude of ERG a wave and b wave between the five groups表2 各組ERG a波、b波潛伏期和振幅比較（n=8，）

＊P＜0.05；a與正常對照組比較，b與光照1 d組比較，c與光照3 d組比較，d與光照7 d組比較，P＜0.05。

a波b波組別正常對照組光照1 d組光照3 d組光照7 d組光照14 d組F潛伏期/ms 18.53±3.48 18.09±3.34 25.9±2.28ab 29.38±5.39ab 41.96±5.26abcd 44.786＊振幅/μV 46.81±5.32 46.95±5.14 34.35±3.78ab 26.99±5.34abc 10.68±1.20abcd 90.300＊潛伏期/ms 40.08±5.80 39.44±4.78 37.81±5.67ab 50.57±3.91abc 63.91±5.56abcd 36.687＊振幅/μV 96.48±7.16 96.11±6.73 81.03±5.22ab 73.51±8.00abc 38.02±5.38abcd 37.006＊

2.3 藍光照射對視網(wǎng)膜的影響 正常對照組和光照1 d 組大鼠的眼底未見明顯異常，視網(wǎng)膜平伏，視網(wǎng)膜血管、視盤結(jié)構(gòu)清晰可見，未見出血點及黃白色點狀顆粒；光照3 d 組大鼠眼底視網(wǎng)膜平伏，偶見出血點和散在的視網(wǎng)膜脫色素改變；光照7 d組大鼠眼底見視盤色淡，視網(wǎng)膜上見散在點狀出血點、黃白色點狀顆粒物，視網(wǎng)膜靜脈迂曲擴張，伴視網(wǎng)膜脫色素改變；光照14 d組眼底見視盤色淡，視網(wǎng)膜動脈呈銅絲樣甚至銀絲樣外觀，視網(wǎng)膜上見大量黃白色點狀滲出，視網(wǎng)膜靜脈迂曲擴張，伴大量視網(wǎng)膜脫色素改變，見圖2。

Fig.2 Fundus color photos of BN rats of the five groups圖2 各組BN大鼠眼底彩照

2.4 視網(wǎng)膜病理學觀察 HE染色顯示正常對照組視網(wǎng)膜形態(tài)正常，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清楚，光感受器內(nèi)、外節(jié)排列整齊規(guī)則，外核層排列整齊規(guī)則；光照1、3 d 組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，但在光照3 d 組見RPEc層基底部色素顆粒明顯增多，外核層可見輕度細胞核固縮現(xiàn)象；光照7、14 d 組大鼠視網(wǎng)膜光感受器內(nèi)節(jié)（IS）/外節(jié)（OS）空隙增大、結(jié)構(gòu)排列紊亂，外核層細胞核固縮，RPEc層基底部色素顆粒沉積及RPEc下局灶性隆起，見圖3。與正常對照組比較，光照3、7 及14 d 組視網(wǎng)膜變?。≒＜0.05），但光照3、7及14 d組視網(wǎng)膜厚度差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

Tab.3 Comparison of retinal thickness and ROS content between five groups表3 各組大鼠視網(wǎng)膜厚度及視網(wǎng)膜ROS含量的比較（n=8，）

Tab.3 Comparison of retinal thickness and ROS content between five groups表3 各組大鼠視網(wǎng)膜厚度及視網(wǎng)膜ROS含量的比較（n=8，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與正常對照組比較，b與光照1 d組比較，c與光照3 d組比較，d與光照7 d組比較，P＜0.05。

組別正常對照組光照1 d組光照3 d組光照7 d組光照14 d組F視網(wǎng)膜厚度/μm 46.67±3.71 45.54±3.18 41.87±1.58a 40.89±1.32ab 39.87±1.85ab 11.740＊視網(wǎng)膜ROS含量/（U/mg）151.75±9.68 157.24±6.63 200.73±9.38ab 277.09±19.07abc 324.85±15.95abcd 257.39＊＊

Fig.3 Retinal HE staining of BN rats(×40)圖3 BN大鼠視網(wǎng)膜HE染色（×40）

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜ROS 含量比較 與正常對照組比較，光照3、7、14 d 組大鼠視網(wǎng)膜ROS 含量升高（P＜0.05），且光照1、3、7、14 d組視網(wǎng)膜ROS含量逐漸升高（P＜0.05），見表3。

3 討論

視網(wǎng)膜是高耗氧量及高代謝組織，視網(wǎng)膜光感受器細胞IS含有大量的線粒體、核糖體等，視網(wǎng)膜光感受器OS 主要由膜盤構(gòu)成，含有視色素，接受光線刺激后經(jīng)一系列反應(yīng)完成光傳導［7］。RPEc 含有脂褐素、黑色素、豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，具有儲存轉(zhuǎn)運視色素、吞噬感光細胞外節(jié)脫落的膜盤、清除氧自由基、分泌細胞因子等功能，在參與、維護視網(wǎng)膜功能及視覺形成中有重要作用［8］。黑色素具有很強的清除ROS、氧自由基及吸收高輻射射線能量的作用［9］。有色鼠眼部的黑色素主要分布在虹膜、RPEc及脈絡(luò)膜中，當光線進入鼠眼后，首先由虹膜遮擋部分光線；RPEc及脈絡(luò)膜無法像虹膜那樣直接遮擋光線，而是RPEc及脈絡(luò)膜中豐富的黑色素通過清除氧自由基發(fā)揮了視網(wǎng)膜光損傷的保護作用［2，6］。研究顯示，藍光可引起大鼠或小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷，其中視網(wǎng)膜光感受器細胞和RPEc凋亡損傷是導致視網(wǎng)膜光損傷的重要機制［4-5］。Li 等［10］發(fā)現(xiàn)SD大鼠連續(xù)8周暴露于5.03 Lux的藍光3、6、12 h后，視網(wǎng)膜光感受器細胞和RPEc出現(xiàn)退行性改變，首先光感受器細胞OS 的膜盤腫脹、空泡樣改變，光感受器細胞IS線粒體腫脹、減少，隨后出現(xiàn)光感受器細胞核固縮，進而誘導光感受器細胞的凋亡；隨著光感受器細胞的凋亡，RPEc 層變薄，數(shù)量減少、細胞破碎裂解。Lin 等［11］將BN 大鼠每日暴露于150 Lux 的藍光中3 h并在大鼠暴露藍光7、14 d后發(fā)現(xiàn)BN大鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜靜脈迂曲擴張和白色點狀滲出，視網(wǎng)膜變薄，視網(wǎng)膜IS/OS 層變薄。本研究利用（1 000±100）Lux藍光照射BN 大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠在光照3 d 后對光聲刺激的反應(yīng)更遲鈍，尤以在光照7、14 d后其精神狀態(tài)、飲食、毛發(fā)光澤及對光聲刺激明顯減弱，體質(zhì)量減輕；眼底可見較為明顯的視網(wǎng)膜靜脈迂曲擴張、視網(wǎng)膜點狀出血及局灶性視網(wǎng)膜色素上皮脫失，視網(wǎng)膜變薄，IS/OS 層排列紊亂、萎縮，外核層核固縮，推測大鼠在光照7 d 時已出現(xiàn)光感受器細胞和RPEc 損傷，視覺受到影響，與Lin等［11］的研究結(jié)果相似。在本研究中BN大鼠在藍光照射3 d后眼底已經(jīng)出現(xiàn)了視網(wǎng)膜外核層的輕度核固縮、視網(wǎng)膜脫色素，并伴有RPEc層基底部色素顆粒增多；光照7 d后RPEc層基底部色素顆粒的沉積更為明顯，考慮光照3 d時已出現(xiàn)光感受器細胞的輕度損傷。

ERG a波記錄是光感受器細胞的功能，而b波主要記錄雙極細胞、Müller細胞的功能。研究顯示，光損傷后大鼠光感受器細胞IS結(jié)構(gòu)紊亂，雙極細胞在光感受器細胞發(fā)生凋亡前已出現(xiàn)損傷，隨后Müller細胞網(wǎng)絡(luò)支架坍塌，形成類似于“星形細胞瘢痕”［12-13］。本研究中大鼠光照3 d 時，ERG a 波、b 波的振幅明顯下降，潛伏期延長，推測在大鼠光照3 d后，視網(wǎng)膜光感受器細胞凋亡，視網(wǎng)膜外核層出現(xiàn)核固縮，導致視網(wǎng)膜光感受器細胞損傷；而雙極細胞、Müller細胞的損傷則影響了光線在神經(jīng)感覺層的傳導，且隨著藍光光照的時間延長，視網(wǎng)膜光感受器的損傷更為明顯，這與筆者觀察到的大鼠視網(wǎng)膜的病理結(jié)構(gòu)表現(xiàn)相符。

藍光誘導的氧化應(yīng)激反應(yīng)在視網(wǎng)膜光感受器的細胞凋亡中具有重要作用［14-15］，黑色素可有效保護光照后的視網(wǎng)膜組織，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)對視網(wǎng)膜的光損傷［2，4，16］。Marie 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，藍光照射后RPEc產(chǎn)生了大量ROS并發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導致視網(wǎng)膜線粒體功能障礙及細胞凋亡。Nakamura 等［18］采用1 100 Lux 的藍光對C57BL/J 小鼠進行照射，發(fā)現(xiàn)小鼠在藍光照射3 d后視網(wǎng)膜RPEc和光感受器細胞出現(xiàn)嚴重的凋亡，主要表現(xiàn)為光感受器細胞層和RPEc層變薄，結(jié)構(gòu)紊亂?？梢姽庹丈溆猩蠹鞍谆蠛?，有色鼠的視網(wǎng)膜光損傷程度明顯低于白化鼠，可能是有色鼠的RPEc 黑色素減少視網(wǎng)膜組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，快速有效的清除氧自由基，保護視網(wǎng)膜［2，19］。本研究中大鼠視網(wǎng)膜組織ROS 含量隨著藍光照射時間延長逐漸增加，考慮大鼠在連續(xù)藍光照射后視網(wǎng)膜組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷大鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞及RPEc。體內(nèi)未及時清除的ROS在加重氧化應(yīng)激反應(yīng)的同時［20-21］，亦可抑制RPEc中溶酶體吞噬光感受器細胞OS，引起脂褐質(zhì)的堆積［22］，脂褐質(zhì)中含有N 視黃基視黃乙醇胺對藍光特別敏感，可進一步引起RPEc凋亡、線粒體DNA功能障礙及氧化應(yīng)激反應(yīng)加重［2，17，22］，形成惡性循環(huán)。在氧化應(yīng)激的環(huán)境下，視網(wǎng)膜光感受器細胞OS損傷導致大量膜盤脫落，RPEc 本身遭受氧化損傷，同時RPEc及其黑色素需要超負荷清除產(chǎn)生的ROS、吞噬脫落的光感受器細胞OS，最終RPEc功能失代償，細胞凋亡甚至裂解，加重脂褐質(zhì)的堆積，因此在RPEc基底部可見大量的脂褐質(zhì)、色素顆粒沉積并引起炎性因子的積聚，破壞RPEc層及脈絡(luò)膜毛細血管復合體的完整性，出現(xiàn)RPE基底部的局灶性隆起，甚至為新生血管的形成提供一個空間平臺。本研究觀察到光照3 d組大鼠RPE 層基底部色素顆粒增多、積聚，尤以光照7 d組大鼠及光照14 d組大鼠的更為明顯，并伴眼底視網(wǎng)膜脫色素的表現(xiàn)，甚至在光照14 d 組大鼠中可見RPEc層局灶性隆起，加速了wAMD的發(fā)生發(fā)展。

綜上，藍光持續(xù)照射BN大鼠可產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導致慢性視網(wǎng)膜光損傷，且隨著照射時間延長，視網(wǎng)膜光損傷程度愈重。這種藍光導致的慢性視網(wǎng)膜光損傷值得引起研究者的重視，后期將繼續(xù)深入研究其發(fā)病機制，為進一步研究視網(wǎng)膜光損傷的防治手段提供理論基礎(chǔ)。