線粒體自噬-NLRP3炎癥小體通路在新生大鼠缺血性腦損傷中的作用研究

林永文，陳巧媚，敖當(dāng)，黃炳龍，駱成珠，李承燕

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是指缺氧或窒息導(dǎo)致的新生兒大腦缺氧缺血性損傷，發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率為1‰～8‰，發(fā)展中國家則高達(dá)26‰，是足月新生兒致殘的主要疾?。?］。腦缺血-再灌注損傷（CIRI）是新生兒HIE主要病理生理學(xué)改變，線粒體自噬-炎癥小體在其中發(fā)揮重要作用［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，缺血可導(dǎo)致神經(jīng)元中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體活化［4］，抑制NLRP3 炎癥小體活化可減輕炎癥反應(yīng)和腦缺血-再灌注損傷［5］。NLRP3 炎癥小體的活化常伴隨線粒體自噬調(diào)控的紊亂，同時線粒體損傷是NLRP3 炎癥小體過度激活的重要原因［6］。抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ或復(fù)合物Ⅲ會增加線粒體內(nèi)活性氧（ROS）生成，進(jìn)而觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活［7］。激活Parkin依賴的線粒體自噬可抑制NLRP3炎癥小體的活化，減輕腎臟及肝臟的缺血-再灌注損傷［8-9］。目前鮮見有關(guān)新生大鼠CIRI 后線粒體自噬與NLRP3炎癥小體相互作用的研究。本研究旨在探討線粒體自噬與NLRP3 炎癥小體途徑在改善CIRI 中的作用過程和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1 周齡新生SD 大鼠42 只，體質(zhì)量（15±3）g。由SPF級成年健康SD大鼠（雌鼠10只，雄鼠5只）配種所生，體質(zhì)量（220±30）g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010］。本實(shí)驗(yàn)通過廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：GDY2102087）。 BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Mdivi-1（Dynamin 抑制劑）、Western 一抗稀釋液（中國碧云天公司），MCC950（選擇性的NLRP3 抑制劑）和Ac-YVAD-cmk（選擇性caspase-1 抑制劑，美國MedChemExpress 公司），胱天蛋白酶（caspase）-1 兔單克隆抗體、caspase-8 兔單克隆抗體、LC3Ⅱ/Ⅰ兔單克隆抗體、二甲亞砜（DMSO，美國CST公司），凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）、NLRP3、anti-SQSTM1/P62、PTEN 誘導(dǎo)激酶1（PINK1）、Parkin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（TOMM20）兔單克隆抗體（英國Abcam公司），β-actin抗體（中國弗德生物公司），過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L，中國oster 公司）?；瘜W(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司），OLYMPUS顯微照相系統(tǒng)、普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），JEM-1400120V型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

1.2 動物模型構(gòu)建及分組 42 只新生SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Sham 組、CIRI 組、CIRI+DMSO 組、CIRI+Mdivi-1組、CIRI+MCC950 組及CIRI+Ac-YVAD-cmk 組，每組7 只。除Sham 組外，其他各組采用單側(cè)頸總動脈阻斷法建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型［10］。Sham 組：僅暴露左頸總動脈，不予夾閉。CIRI 組：暴露左頸總動脈，用血管夾夾閉左側(cè)頸總動脈60 min 后恢復(fù)血流。CIRI+DMSO 組：造模后立即腹腔注射10%DMSO溶液（0.2 mL）。CIRI+Mdivi-1組：術(shù)前30 min 給予Mdivi-1 25 mg/kg 腹腔注射（0.2 mL）。CIRI+MCC950 組：術(shù)前30 min 給予MCC950 10 mg/kg 腹腔注射（0.2 mL）。CIRI+Ac-YVAD-cmk 組：術(shù)前30 min 給予Ac-YVAD-cmk 2 mg/kg腹腔注射（0.2 mL）。

1.3 主要觀察指標(biāo) （1）神經(jīng)行為障礙評分：HIBD模型制備后24 h，Londa法進(jìn)行神經(jīng)行為障礙評分［10］。（2）蘇木精-伊紅染色法（HE）檢測海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)：組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度乙醇脫水。將乙醇置換為二甲苯進(jìn)行標(biāo)本透明、浸蠟及石蠟包埋。選取海馬體最大切面，3 μm連續(xù)切片。用二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水后，將切片置于中性樹膠封片。使用普通光學(xué)顯微鏡觀察各組海馬CA1 區(qū)細(xì)胞形態(tài)。（3）透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)：完整剝離海馬體，取約1 mm3海馬CA1區(qū)組織，用3%戊二醛固定（4 ℃，24 h），繼續(xù)予后固定、脫水、包埋等處理，透射電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、腫脹線粒體數(shù)及突觸數(shù)。（4）Western blot檢測線粒體自噬和NLRP3炎癥小體通路相關(guān)蛋白表達(dá)：將新鮮組織放入RIPA 裂解液中研磨后于4 ℃12 000 r/min 離心10 min。SDS-PAGE電泳（恒壓60 V 30 min后120 V 60 min），使用0.22 μm PDVF 膜在轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（300 mA 60 min及250 mA 60 min）。用TBST洗膜后分別加入一抗稀釋液（均1∶1 000）4 ℃孵育過夜；TBST 漂洗后加用相應(yīng)種屬稀釋二抗（1∶5 000）孵育2 h，洗滌后ECL顯影及曝光，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)Tanon-5200檢測，采用Image J軟件分析灰度值。以β-actin 或GAPDH 作為內(nèi)參照，檢測PINK1、Parkin、TOMM20、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62 及NLRP3、ASC、caspase-1、caspase-8蛋白表達(dá)情況，每組取1只，重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Prism 8.0.2 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為障礙評分 與Sham 組比較，CIRI 組神經(jīng)行為障礙評分均增加（P＜0.05）；與CIRI+DMSO 組比較，CIRI+Mdivi-1 組神經(jīng)行為障礙評分增加（P＜0.05）；與CIRI+Mdivi-1 組比較，CIRI+MCC950組及CIRI+Ac-YVAD-cmk 組神經(jīng)行為障礙評分降低（P＜0.05），見圖1。

2.2 海馬CA1 區(qū)細(xì)胞形態(tài) 在新生大鼠海馬CA1區(qū)，Sham 組神經(jīng)元排列整齊緊密，無細(xì)胞核固縮及核碎裂；CIRI 組及CIRI+DMSO 組神經(jīng)元均排列疏松、紊亂，出現(xiàn)空泡化及水腫，可見較多核固縮及核碎裂；CIRI+Mdivi-1 組可見明顯神經(jīng)元空泡化及水腫，細(xì)胞排列雜亂、疏松，可見較多核固縮；CIRI+MCC950組細(xì)胞排列整齊，無空泡化，有少量核固縮及核碎裂；CIRI+Ac-YVAD-cmk 組細(xì)胞分布疏松、排列紊亂，核固縮及核碎裂多見，見圖2。

2.3 神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 在新生大鼠海馬CA1區(qū)，Sham 組神經(jīng)元核膜完整，線粒體及突觸結(jié)構(gòu)清晰，突觸小泡數(shù)量較多、排列緊密；與Sham 組比較，CIRI組與CIRI+DMSO組部分神經(jīng)元核膜斷裂，線粒體嵴斷裂，腫脹線粒體數(shù)增多，突觸小泡稀疏且數(shù)量減少，突觸前膜結(jié)構(gòu)模糊，后膜腫脹；與CIRI+DMSO組比較，CIRI+Mdivi-1 組神經(jīng)元核膜斷裂，胞核碎裂，線粒體嵴中斷或消失，腫脹線粒體數(shù)增多，突觸小泡數(shù)量明顯減少，突觸后膜水腫，可見凋亡神經(jīng)元；CIRI+MCC950 組神經(jīng)元核膜清晰，部分線粒體呈空泡樣改變，可見線粒體自噬體及突觸小泡，突觸結(jié)構(gòu)完整，與CIRI+DMSO 組和CIRI+Mdivi-1 組比較，突觸數(shù)增多，腫脹線粒體數(shù)減少；CIRI+Ac-YVAD-cmk組神經(jīng)元核膜模糊，部分線粒體嵴中斷，線粒體及突觸小泡數(shù)量減少，突觸后膜腫脹，線粒體自噬體少見，與CIRI+DMSO組和CIRI+Mdivi-1組比較，突觸數(shù)增多，腫脹線粒體數(shù)減少，見表1、圖3。

Tab.1 Comparison of synapses and swelling mitochondrias observed by transmission electron microscopy in the hippocampus CA1 tissue between six groups of neonatal rats表1 各組新生大鼠海馬CA1區(qū)透射電鏡觀察結(jié)果比較（n=7，個/視野，）

Tab.1 Comparison of synapses and swelling mitochondrias observed by transmission electron microscopy in the hippocampus CA1 tissue between six groups of neonatal rats表1 各組新生大鼠海馬CA1區(qū)透射電鏡觀察結(jié)果比較（n=7，個/視野，）

＊＊P＜0.01，＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與CIRI+DMSO組比較，c與CIRI+Mdivi-1組比較，P＜0.05；表2—3同。

組別Sham組CIRI組CIRI+DMSO組CIRI+Mdivi-1組CIRI+MCC950組CIRI+Ac-YVAD-cmk組F突觸數(shù)4.143±0.690 2.286±0.756a 2.286±0.951a 0.857±0.378b 5.286±0.756bc 4.429±0.535bc 39.570＊＊腫脹線粒體數(shù)0.857±0.378 3.714±0.488a 4.000±0.817a 6.143±0.900b 1.714±0.756bc 2.857±0.690bc 50.250＊＊

Fig.3 Ultrastructure of hippocampal CA1 tissue in each group of newborn rats(A1—F1，×8 000；A2—F2，×30 000；A3—F3，×60 000)圖3 各組新生大鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)（A1—F1，×8 000；A2—F2，×30 000；A3—F3，×60 000）

2.4 各組新生大鼠海馬組織中線粒體自噬-NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與Sham組比較，CIRI組PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ及NLRP3、ASC、caspase-1、caspase-8 蛋白表達(dá)增加，TOMM20、P62 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與CIRI+DMSO組比較，CIRI+Mdivi-1 組PINK1、Parkin、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)下調(diào)，TOMM20、P62、NLRP3、caspase-8、caspase-1 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。與CIRI+Mdivi-1 組比較，CIRI+MCC950 組及 CIRI+Ac-YVAD-cmk 組 PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)增加，CIRI+MCC950 組NLRP3、caspase-1、caspase-8 蛋白及CIRI+Ac-YVAD-cmk 組caspase-1、caspase-8 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖4，表2、3。

Tab.2 Comparison of mitophagy protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表2 各組大鼠新生大鼠海馬CA1區(qū)線粒體自噬相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of mitophagy protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表2 各組大鼠新生大鼠海馬CA1區(qū)線粒體自噬相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平比較（n=3，）

組別PINK1ParkinTOMM20LC3Ⅱ/ⅠP62 Sham組CIRI組CIRI+DMSO組CIRI+Mdivi-1組CIRI+MCC950組CIRI+Ac-YVAD-cmk組F 0.583±0.149 1.114±0.293a 1.096±0.283a 0.581±0.073b 1.628±0.395c 1.388±0.341ac 6.860＊＊0.373±0.056 0.867±0.125a 0.864±0.126a 0.413±0.027b 1.263±0.256c 0.903±0.168c 15.740＊＊1.508±0.325 0.861±0.195a 0.895±0.143a 1.874±0.275b 0.746±0.092c 0.854±0.166c 13.670＊＊0.177±0.062 0.345±0.103a 0.365±0.128a 0.183±0.047b 0.530±0.163c 0.377±0.081c 4.830＊1.284±0.238 0.719±0.037a 0.723±0.032a 1.425±0.099b 0.623±0.067c 0.685±0.079c 27.510＊＊

Tab.3 Comparison of NLRP3 inflammasome protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表3 各組大鼠新生大鼠海馬CA1區(qū)NLRP3炎癥小體蛋白相對表達(dá)水平比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of NLRP3 inflammasome protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表3 各組大鼠新生大鼠海馬CA1區(qū)NLRP3炎癥小體蛋白相對表達(dá)水平比較（n=3，）

組別Sham組CIRI組CIRI+DMSO組CIRI+Mdivi-1組CIRI+MCC950組CIRI+Ac-YVAD-cmk組F 0.326±0.079 0.869±0.253a 0.826±0.278a 1.117±0.302 0.511±0.097c 0.673±0.090 5.510＊0.233±0.044 0.482±0.088a 0.482±0.072a 0.825±0.189b 0.366±0.087c 0.488±0.119 9.630＊＊0.478±0.067 1.039±0.081a 1.027±0.137a 1.443±0.086b 0.516±0.050bc 0.648±0.051bc 60.340＊＊0.430±0.100 0.835±0.142a 0.794±0.172a 1.193±0.109b 0.647±0.148c 0.758±0.055c 11.690＊＊ASCNLRP3caspase-8caspase-1

Fig.4 Western blot bands of mitophagy-NLRP3 inflammasome protein in hippocampal CA1 tissue in each group of newborn rats圖4 各組新生大鼠海馬CA1區(qū)線粒體自噬-NLRP3炎癥小體蛋白Western blot條帶

3 討論

目前，有關(guān)NLRP3炎癥小體激活與線粒體自噬在新生大鼠CIRI 中的相互作用和調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明［11］。NLRP3 炎癥小體是在腦缺血中研究較多的炎癥小體，其介導(dǎo)的腦缺血損傷與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［4］。Gong 等［12-13］發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體在CIRI后主要在神經(jīng)元中表達(dá)。在腦缺血體外神經(jīng)元模型中，缺血導(dǎo)致神經(jīng)元中NLRP3炎癥小體各組成蛋白表達(dá)增加及活化后產(chǎn)物增多，提示腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元NLRP3 炎癥小體的活化。而抑制NLRP3 炎癥小體可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，降低炎癥因子的水平，從而減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)［14-15］。線粒體保護(hù)劑可抑制腦缺血-再灌注后NLRP3 炎癥小體的活化［12］。本研究結(jié)果顯示，在CIRI 組NLRP3 炎癥小體各組成蛋白（NLRP3、ASC）表達(dá)增加，活化后產(chǎn)物（caspase-1、caspase-8）增多，表明新生大鼠CIRI 可導(dǎo)致NLRP3 炎癥小體活化。使用NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 后，新生乳鼠的神經(jīng)行為障礙評分、海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及超微結(jié)構(gòu)均較CIRI+DMSO 組改善，提示抑制NLRP3 炎癥小體的活化可改善新生乳鼠的CIRI。同時，透射電鏡發(fā)現(xiàn)，加入MCC950后線粒體自噬體增多，線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平增加，提示抑制NLRP3 炎癥小體活化可以激活線粒體自噬，改善神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)改變，改善新生大鼠CIRI 的神經(jīng)損傷。

線粒體自噬作為一種選擇性自噬，可消除功能失調(diào)或多余的線粒體，從而微調(diào)線粒體的數(shù)量，維持能量代謝［16］。激活線粒體自噬可清除過度聚集和受損的線粒體，從而減少CIRI 引起的神經(jīng)元損傷［17］。受損線粒體及其釋放的線粒體信號在調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體活化中起關(guān)鍵作用［9］。He等［18］發(fā)現(xiàn)，激活Parkin途徑依賴的線粒體自噬可抑制NLRP3炎癥小體激活，減少CIRI。本研究結(jié)果顯示，加入Mdivi-1后NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)水平較CIRI+DMSO組明顯增加。同時CIRI+Mdivi-1組新生乳鼠的神經(jīng)行為障礙評分較CIRI+DMSO 組增加，海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及超微結(jié)構(gòu)明顯損傷，提示抑制線粒體自噬可激活NLRP3炎癥小體，加重新生乳鼠的CIRI。

NLRP3 炎癥小體和caspase-1 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡通路的激活是腦出血后神經(jīng)功能缺損的最常見原因［19］?；罨腸aspase-1引起細(xì)胞膜穿孔，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)［20］。Ac-YVAD-cmk 是caspase-1 選擇性抑制劑，已被證明對缺血性腦損傷及腦出血有神經(jīng)保護(hù)作用［21-22］。本研究結(jié)果顯示，CIRI+Ac-YVAD-cmk 組的海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及超微結(jié)構(gòu)較CIRI+DMSO組改善，提示抑制caspase-1活化有神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，抑制線粒體自噬可引起NLRP3 活化，加重新生大鼠缺血性腦損傷；而抑制NLRP3 活化可激活線粒體自噬，神經(jīng)損傷減輕。增強(qiáng)線粒體自噬或抑制NLRP3 炎癥小體活化可能是治療HIE的藥物研究方向。