腫瘤相關巨噬細胞通過激活IGF-1R信號通路誘導三陰性乳腺癌細胞對白蛋白紫杉醇耐藥的研究

劉淑娟，劉夢瑩，蘇烏云，竇佳，王薇△

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一種生長迅速的侵襲性乳腺癌，化療是TNBC的最主要的治療手段［1］。白蛋白紫杉醇（Nabpaclitaxel，Nab-PTX）是一種無溶劑的紫杉醇新劑型［2］，已成為TNBC 治療的一線用藥，其療效及安全性均優(yōu)于普通紫杉醇制劑［3］。但隨著治療的進行，對Nab-PTX 耐藥的問題也逐步凸顯。尋找逆轉(zhuǎn)TNBC 耐藥的新靶點和治療方法是目前研究的熱點與難點。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）是腫瘤微環(huán)境中一類重要的免疫細胞，多呈現(xiàn)M2表型特征［4］。研究證實TAM在乳腺癌中占基質(zhì)細胞的50%～80%［5］，與TNBC 耐藥有關［6］，但TAM 介導的TNBC 耐藥的分子機制尚未完全明確。胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factor 1，IGF-1R）是一種酪氨酸蛋白激酶受體［7］，IGF-1R 抑制劑可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性，提高療效［8-9］。TAM 可否通過激活IGF-1R 促進TNBC 細胞對Nab-PTX 耐藥性尚不清楚。本研究建立M2型巨噬細胞模擬TAM，將TNBC細胞與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)，探討TAM 是否通過激活IGF-1R 信號通路促進TNBC 細胞對Nab-PTX 耐藥，為耐藥患者尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 TNBC細胞系MDA-MB-231、單核細胞系THP-1均購自廣州萊德聯(lián)康生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）、RPMI-1640 培養(yǎng)基、青鏈霉素均購自美國Hyclone公司；RNA 提取試劑盒購自美國Qiagen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning 公司；CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒及細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Keygen 公司；APC 標記鼠抗人CD14及其同型抗體、PE標記的鼠抗人CD206及其同型抗體、IGF-1R、p-IGF-1R、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p-ERK、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT 和GAPDH一抗及山羊抗鼠IgG二抗均購自英國Abcam公司；佛波酯（PMA）購自美國MCE公司；白細胞介素（IL）-4、IL-13購自美國RD公司；IGF-1R抑制劑Linsitinib購自維百奧（北京）生物科技有限公司；白蛋白結合型紫杉醇購自中國石藥集團歐意藥業(yè)有限公司。酶標儀購自賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；電泳儀購自北京百晶生物技術有限公司；流式細胞儀購自美國BD Biosciences 公司；實時熒光定量PCR（qPCR）儀購自美國ABI 公司；倒置光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231、THP-1 細胞均接種于含100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%FBS的RPMI-1640基礎培養(yǎng)基，置于含5% CO2、37 ℃的濕化培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 M2型巨噬細胞的誘導建立 取對數(shù)生長期的THP-1細胞，離心收集細胞，先用PMA（185 μg/L）刺激THP-1 細胞48 h，誘導THP-1 細胞分化成M0 型巨噬細胞，再加入IL-4（20 μg/L）和IL-13（20 μg/L）處理48 h，誘導細胞向M2 型巨噬細胞極化［10］。

1.2.3 流式細胞術鑒定細胞表面標記分子CD14、CD206 的表達 將誘導后的細胞消化、重懸于PBS 中，調(diào)整細胞密度約為1×106個/mL。室溫孵育15 min，加入CD14抗體（20 μL）和CD206抗體（20 μL），對照組加入等體積的同型對照抗體，室溫避光孵育30 min，離心、洗滌細胞，再用PBS 重懸細胞，迅速移至流式細胞儀上機檢測。

1.2.4 qPCR 檢測巨噬細胞IL-10、趨化因子配體2（CCL2）mRNA的表達 采用Trizol法提取不同誘導條件下巨噬細胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按說明書進行擴增，引物序列由廣州萊德聯(lián)康生物科技有限公司合成。IL-10：上游5'-CTTCAGCAGAGTGAAGACTT-3'，下游5'-GGAT CATCTCAGACAAGGCT-3'，產(chǎn)物大小122 bp；CCL2：上游5'-CCAGATGCAATCAATGCCCC-3'，下游5'-GGGACACTTGCT GCTGGTGA-3'，產(chǎn)物大小108 bp；內(nèi)參GAPDH：上游5'-GCTCATTTGCAGGGGGGAG-3'，下游5'-GTTGGTGGTGCAG GAGGCA-3'，產(chǎn)物大小138 bp。反應條件：95 ℃預變性120 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火32 s，共40個循環(huán)。各組實驗重復3次，采用2-ΔΔCt方法分析mRNA相對表達量。

1.2.5 M2型巨噬細胞與MDA-MB-231細胞共培養(yǎng)體系的建立及分組 將5×105個MDA-MB-231細胞接種至24孔板，細胞貼壁后，將0.4 μm 的Transwell 小室移入24 孔板中，并將THP-1誘導生成的1×105個M2型巨噬細胞接種于小室上層，共培養(yǎng)48 h，收集下層MDA-MB-231 細胞，用于后續(xù)實驗［11］。對照組：MDA-MB-231 細胞及空白小室；Nab-PTX組：MDA-MB-231 細胞、空白小室及0.5 nmol/L Nab-PTX；TAM 組：MDA-MB-231 細胞、含M2 型巨噬細胞的小室；TAM+Nab-PTX 組：MDA-MB-231 細胞、含M2 型巨噬細胞的小室及0.5 nmol/L Nab-PTX；IGF-1R 抑制劑組：MDA-MB-231 細胞、含M2 型巨噬細胞的小室、0.5 nmol/L Nab-PTX 及4 nmol/L IGF-1R抑制劑Linsitinib。

1.2.6 CCK-8 法檢測MDA-MB-231 細胞的增殖 稀釋各組細胞，以1×104個/孔的密度接種到96 孔板，待細胞貼壁生長后加入Nab-PTX或IGF-1R抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組接種5 個復孔。加10 μL CCK-8（1∶10）至待測孔中，孵育4 h，酶標儀讀板，測定490 nm 處的光密度（OD）值，代表細胞增殖水平。

1.2.7 流式細胞術檢測MDA-MB-231 細胞凋亡 收集待測細胞，消化、重懸，加入1.25 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI溶液，室溫避光反應15 min。離心，棄上清，緩沖液重懸細胞。流式細胞儀檢測分析細胞凋亡率。

1.2.8 qPCR 檢測MDA-MB-231 細胞多藥耐藥蛋白（MDR）1和胱天蛋白酶（Caspase）-3 mRNA 表達 采用Trizol 法提取各組細胞中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按說明書進行擴增，引物序列由廣州萊德聯(lián)康生物科技有限公司合成。MDR1：上游5'-GCTTAACACCCGACTTACAG-3'，下游5'-CAACCACGTGTAAATCCTACT-3'，產(chǎn)物大小126 bp；Caspase-3：上游5'-ATGATCTTACACGTGAAGAA-3'，下游5'-CTTCACCATGGCTCAGAAGC-3'，產(chǎn)物大小105 bp；內(nèi)參GAPDH：上游5'-GCTCATTTGCAGGGGGGAG-3'，下游5'-GTTGGTGGTGCAGGAGGCA-3'，產(chǎn)物大小138 bp。反應條件：95 ℃預變性120 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火32 s，共40個循環(huán)。各組實驗重復3次，采用2-ΔΔCt方法對mRNA相對表達量進行分析。

1.2.9 Western blot 檢測MDA-MB-231 細胞IGF-1R 信號通路關鍵蛋白表達 各組分別取2×106個細胞，用SDS 裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。配置10%分離膠和5%濃縮膠，取30 μg 蛋白進行10%SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后，加p-IGF-1R、IGF-1R、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）一抗，4 ℃過夜。洗滌后加入辣根過氧化物酶標記二抗37 ℃孵育1 h，洗膜后用增強化學發(fā)光（ECL）熒光試劑顯影。GAPDH設為內(nèi)參，使用Image J 軟件對Western 印跡進行灰度值分析，計算每組蛋白相對表達量，測量重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示。2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，使用Tukey-q法進行組間多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TAM的鑒定

2.1.1 巨噬細胞表面標志物表達特征 流式細胞儀分析顯示，THP-1 細胞經(jīng)過PMA 刺激后分化成為M0 巨噬細胞，其表面分子CD14 陽性表達率為（6.97±0.31）% ，CD206 的陽性表達率為（5.64±0.50）%；繼續(xù)給予IL-4和IL-13刺激后，誘導分化生成的M2 型巨噬細胞CD14 陽性表達率為（59.89±1.01）%，CD206 陽性表達率為（62.7±1.97）%，符合M2型巨噬細胞的特征，見圖1。

Fig.1 The characteristics of cell surface markers CD14 and CD206 in TAM圖1 TAM表面標志物CD14、CD206的表達特征

2.1.2 不同誘導條件下巨噬細胞IL-10 mRNA 及CCL2 mRNA 表達水平 qPCR 結果顯示，M2型巨噬細胞內(nèi)IL-10 mRNA 水平與M0 型巨噬細胞相比明顯升高（3.47±0.15vs. 1.00±0.02，n=6，t=28.270，P＜0.01）；M2 型巨噬細胞內(nèi)CCL2 mRNA 水平與M0 型巨噬細胞相比明顯升高（6.38±0.19vs.0.91±0.18，n=6，t=35.960，P＜0.01）。

2.2 TAM對Nab-PTX干預MDA-MB-231細胞增殖的影響 CCK-8 結果顯示，與對照組和TAM 組相比，Nab-PTX 組24、48 和72 h 細胞增殖水平下降（P＜0.01）；與Nab-PTX 組相比，TAM+Nab-PTX 組24、48和72 h細胞增殖水平升高（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of proliferation of MDA-MB-231 cells at different time points between four groups表1 4組MDA-MB-231細胞不同時間點增殖情況比較（n=3，OD490，）

Tab.1 Comparison of proliferation of MDA-MB-231 cells at different time points between four groups表1 4組MDA-MB-231細胞不同時間點增殖情況比較（n=3，OD490，）

＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與Nab-PTX 組比較，P＜0.05。表3、4同。

組別對照組Nab-PTX組TAM組TAM+Nab-PTX組F 24 h 0.470±0.002 0.440±0.002a 0.510±0.002b 0.460±0.002b 716.879＊＊48 h 0.630±0.001 0.540±0.004a 0.720±0.001b 0.610±0.003b 2 090.309＊＊72 h 0.770±0.004 0.620±0.003a 0.930±0.006b 0.760±0.006b 2 276.647＊＊

2.3 TAM對Nab-PTX干預MDA-MB-231細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測顯示，對照組、Nab-PTX組、TAM 組和TAM+Nab-PTX 組細胞凋亡率（%）分別為5.81±0.10、20.21±2.54、2.06±0.91和12.68±0.51，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（n=3，F(xiàn)=79.338，P＜0.01）。與對照組相比，Nab-PTX組細胞凋亡率升高（P＜0.01）；與Nab-PTX 組相比，TAM+Nab-PTX 組細胞凋亡率降低（P＜0.01），見圖2。

Fig.2 Effects of TAM on apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by Nab-PTX圖2 TAM對Nab-PTX干預MDA-MB-231細胞凋亡的影響

2.4 IGF-1R 抑制劑對TAM 誘導的MDA-MB-231細胞耐藥的影響 CCK-8 結果顯示，與TAM+Nab-PTX 組相比，IGF-1R 抑制劑組24、48 和72 h 細胞增殖水平均降低（P＜0.01），見表2。流式細胞實驗結果顯示，與TAM+Nab-PTX 組相比，IGF-1R 抑制劑組MDA-MB-231 細胞凋亡率（%）增高（23.09±0.86vs.12.71±0.62，n=3，t=16.893，P＜0.01），見圖3。

Tab.2 Comparison of proliferation of MDA-MB-231 cells at different time points between two groups表2 2組MDA-MB-231細胞不同時間點增殖情況比較（n=3，OD490，）

Tab.2 Comparison of proliferation of MDA-MB-231 cells at different time points between two groups表2 2組MDA-MB-231細胞不同時間點增殖情況比較（n=3，OD490，）

＊＊P＜0.01。

組別TAM+Nab-PTX組IGF-1R抑制劑組t 24 h 0.460±0.002 0.420±0.001 19.290＊＊48 h 0.610±0.003 0.500±0.003 42.832＊＊72 h 0.760±0.006 0.560±0.003 45.987＊＊

Fig.3 Effects of IGF-1R inhibitors on apoptosis of MDA-MB-231 cells co-cultured with TAM圖3 IGF-1R抑制劑對TAM共培養(yǎng)MDA-MB-231細胞凋亡的影響

2.5 TAM 對Nab-PTX 干預MDA-MB-231 細胞中MDR1 和Caspase-3 mRNA 的表達影響 qPCR 結果顯示，與對照組相比，Nab-PTX 組MDA-MB-231 細胞內(nèi)MDR1 mRNA 水平降低，Caspase-3 mRNA 水平升高（P＜0.01）；與Nab-PTX組相比，TAM+Nab-PTX組MDR1 mRNA 水平升高，Caspase-3 mRNA 水平降低（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of MDR1 mRNA and Caspase-3 mRNA expression between four groups of MDA-MB-231 cells表3 4組MDA-MB-231細胞MDR1和Caspase-3 mRNA表達的比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of MDR1 mRNA and Caspase-3 mRNA expression between four groups of MDA-MB-231 cells表3 4組MDA-MB-231細胞MDR1和Caspase-3 mRNA表達的比較（n=3，）

＊＊P＜0.01。

組別對照組Nab-PTX組TAM組TAM+Nab-PTX組F MDR1 1.00±0.03 0.29±0.01a 1.72±0.61 0.83±0.03b 934.279＊＊Caspase-3 1.00±0.02 2.03±0.04a 0.58±0.40 1.20±0.02b 21.360＊＊

2.6 TAM 對Nab-PTX 干預MDA-MB-231 細胞中IGF-1R 信號通路關鍵蛋白表達影響 Western blot結果顯示，與對照組比較，Nab-PTX組p-IGF-1R、p-AKT及p-ERK均降低，TAM組p-IGF-1R、p-AKT及p-ERK 均升高（P＜0.01）；與Nab-PTX 組比較，TAM+Nab-PTX 組中p-IGF-1R、p-AKT 及p-ERK 均升高（P＜0.01），見表4、圖4。

Tab.4 Comparison of protein expression levels of p-IGF-1R,p-AKT and p-ERK between MDA-MB-231 cells of each group表4 各組MDA-MB-231細胞內(nèi)p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK蛋白表達水平比較 （n=6，）

Tab.4 Comparison of protein expression levels of p-IGF-1R,p-AKT and p-ERK between MDA-MB-231 cells of each group表4 各組MDA-MB-231細胞內(nèi)p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK蛋白表達水平比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01。

組別對照組Nab-PTX組TAM組TAM+Nab-PTX組F p-IGF-1R/IGF-1R 1.030±0.001 0.400±0.002a 1.300±0.004ab 0.980±0.008b 17 108.381＊＊p-AKT/AKT 0.780±0.001 0.460±0.003a 0.960±0.002ab 0.740±0.004b 13 656.675＊＊p-ERK/ERK 0.980±0.007 0.570±0.002a 1.320±0.002ab 0.770±0.013b 5 499.251＊＊

Fig.4 The protein expression levels of IGF-1R,p-IGF-1R,AKT,p-AKT,ERK and p-ERK in each group圖4 Western blot檢測各組MDA-MB-231細胞內(nèi)IGF-1R、p-IGF-1R、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白表達

2.7 IGF-1R 抑制劑對MDA-MB-231 細胞MDR1 mRNA 和Caspase-3 mRNA 的表達的影響 IGF-1R抑制劑組MDA-MB-231 細胞內(nèi)MDR1 mRNA 水平（0.39±0.02）與TAM+Nab-PTX 組（1.00±0.04）相比降低（n=3，t=23.625，P＜0.01），IGF-1R 抑制劑組Caspase-3 mRNA水平（3.05±0.08）與TAM+Nab-PTX組（1.00±0.03）相比升高（n=3，t=31.973，P＜0.01）。

2.8 IGF-1R 抑制劑對MDA-MB-231 細胞IGF-1R信號通路關鍵蛋白的表達影響 與TAM+Nab-PTX組相比，IGF-1R 抑制劑組MDA-MB-231 細胞內(nèi)p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK 的表達明顯降低（P＜0.01），見表5、圖5。

Tab.5 Comparison of p-IGF-1R,p-AKT and p-ERK rations between the two groups of cells表5 2組細胞內(nèi)p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK比較（n=6，）

Tab.5 Comparison of p-IGF-1R,p-AKT and p-ERK rations between the two groups of cells表5 2組細胞內(nèi)p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK比較（n=6，）

＊＊P＜0.01。

組別TAM+Nab-PTX組IGF-1R抑制劑組t p-IGF-1R/IGF-1R 1.280±0.014 0.500±0.009 77.249＊＊p-AKT/AKT 1.120±0.020 0.450±0.002 57.151＊＊p-ERK/ERK 0.860±0.006 0.420±0.001 119.965＊＊

Fig.5 Western blot assay of the TAM+Nab-PTX group and the IGF-1R inhibitor group圖5 TAM+Nab-PTX組和IGF-1R抑制劑組蛋白表達印跡圖

3 討論

Nab-PTX 是治療TNBC 的常用藥物之一，但易產(chǎn)生化療耐藥。目前研究聚焦于腫瘤微環(huán)境中各類細胞在耐藥中的作用。在復雜的腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞可以被募集到腫瘤區(qū)域，并被極化為M1 或M2 型，然而TAM 主要表現(xiàn)出M2 樣極化狀態(tài)［12］，具有免疫抑制作用，同時細胞內(nèi)表達相對較高的IL-10、CCL2 水平［5，13］。研究發(fā)現(xiàn)，TAM 在體外和體內(nèi)都能通過激活NF-κB信號減弱藥物對TNBC細胞的殺傷作用，減少腫瘤細胞的凋亡［14］。本研究結果顯示，與Nab-PTX 組相比，TAM+Nab-PTX 組細胞增殖率升高、凋亡率下降，與上述研究［14］結果相似，說明TAM 可降低MDA-MB-231 細胞對Nab-PTX 敏感性，具有保護腫瘤細胞的作用。因此，尋找TAM 保護腫瘤細胞的機制對逆轉(zhuǎn)TNBC耐藥至關重要。

MDR1 可將進入細胞內(nèi)的藥物泵出細胞外，降低藥物在細胞內(nèi)的生物利用度，進而引發(fā)細胞耐藥［15］。本研究中，與Nab-PTX 組相比，TAM+Nab-PTX組MDA-MB-231細胞內(nèi)MDR1 mRNA表達量均升高，凋亡相關因子Caspase-3 mRNA 表達均降低，提示TAM 可能通過MDR1 降低藥物在細胞內(nèi)的生物利用度和抑制細胞凋亡級聯(lián)反應，進而降低MDA-MB-231 細胞對Nab-PTX 的化療敏感性。IGF-1R 作為IGF 系統(tǒng)中重要的受體，與IGF1 和IGF2 結合后，觸發(fā)其酪氨酸激酶結構域的轉(zhuǎn)磷酸化，激活下游的AKT和ERK通路，誘導細胞增殖、抑制細胞凋亡［16］。Ireland等［17］對浸潤性乳腺癌患者的活檢組織進行免疫組織化學染色，結果顯示，M2 型巨噬細胞包圍的腫瘤細胞中p-IGF-R 水平增加，51例TNBC 患者中有45 例（88.2%）表現(xiàn)出IGF-1R 激活。Davison 等［18］發(fā)現(xiàn)IGF-1 通過激活AKT 和ERK通路增強體外TNBC細胞的增殖，IGF-1R/胰島素受體（IR）酪氨酸激酶抑制劑可改善TNBC 細胞耐藥。Liu等［19］發(fā)現(xiàn)，AKT和ERK通路參與MDR1表達的調(diào)控，AKT 及ERK 阻斷劑能抑制TNBC 細胞內(nèi)MDR1 mRNA 的上調(diào)。本研究中TAM 組和TAM+Nab-PTX組MDA-MB-231 細胞中的IGF-1R 及下游ERK 和AKT信號通路被激活，提示TAM可能通過激活IGF-1R及下游AKT和ERK信號通路提高MDR1的表達，下調(diào)Caspase-3 表達，降低MDA-MB-231 細胞對Nab-PTX 的化療敏感性。本研究還發(fā)現(xiàn)IGF-1R 抑制劑可以提高Nab-PTX 對TAM 共培養(yǎng)MDA-MB-231細胞的殺傷作用，為進一步評估IGF-1R 抑制劑聯(lián)合Nab-PTX治療TNBC提供了理論依據(jù)。

綜上所述，TAM 可引起TNBC 細胞對Nab-PTX耐藥，其機制可能與TAM 激活腫瘤細胞內(nèi)IGF-1R及下游AKT和ERK信號通路有關，提示靶向TAM或阻斷腫瘤細胞中的IGF-1R 是一種有潛力的耐藥治療策略。該結論未在動物體內(nèi)進行驗證，是否還有其他信號通路參與，需后續(xù)深入研究。