EGCG與柚皮素、橙皮苷緩解大鼠便秘的作用機(jī)制

唐健，高雅倩，么春艷*，賀可可，李泓穎，肖鵬

1.無限極（中國）有限公司（廣州 510623）；2.杭州醫(yī)學(xué)院（杭州 310013）；3.健士星生物技術(shù)研發(fā)（上海）有限公司（上海 200335）

便秘可分為器質(zhì)性便秘與功能性便秘。器質(zhì)性便秘是指由于器官發(fā)生病理性變化而造成的便秘，如消化道疾病、內(nèi)分泌代謝疾病等，需要專業(yè)的醫(yī)學(xué)治療。功能性便秘是指由于腸道功能產(chǎn)生暫時性障礙而造成的便秘，臨床主要表現(xiàn)為排便次數(shù)少于3次/周，伴有排便間隔時間延長、排便困難等特點，主要與生活規(guī)律改變、情緒抑郁、飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣、藥物作用等相關(guān)，可通過服用功能性保健食品、改變生活習(xí)慣等方式調(diào)節(jié)改善。功能性便秘在成人尤其老年人群體中存在較高的發(fā)病率，研究顯示16%的成人、36%的老年人存在便秘問題[1]。

便秘問題的形成不僅與結(jié)腸的神經(jīng)調(diào)節(jié)異常相關(guān)，同時還與Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）功能異常、腸道結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性破壞、平滑肌收縮減緩相關(guān)[2-3]。神經(jīng)系統(tǒng)異常包括膠質(zhì)細(xì)胞退化、神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF、GDNF）、5-羥色胺（5-HT）、血清血管活性腸肽（VIP）、P物質(zhì)（SP）含量紊亂。ICC在胃腸道上具備起搏功能，引導(dǎo)慢波傳播。ICC將胃腸道神經(jīng)的信號傳遞給平滑肌細(xì)胞，從而推動內(nèi)容物運輸。ICC同時也是肌肉牽張感受器[4]。

因此解決便秘問題，需要運用綜合手段恢復(fù)腸道功能。

現(xiàn)有臨床試驗的便秘動物模型結(jié)果顯示，長期便秘均伴隨著結(jié)腸部位ICC數(shù)量降低，功能障礙等。通常選擇c-Kit、SCF作為ICC的檢測指標(biāo)，因為c-Kit是ICC的特異性標(biāo)志物，ICC的存活需要適量濃度的SCF，已知通過阻擋SCF與c-Kit結(jié)合會降低ICC數(shù)目，c-Kit會隨著SCF濃度的下降而減少[5]。ICC與平滑肌之間為連接蛋白Cx43，其密度的變化可以表征神經(jīng)-ICC-平滑肌整體的穩(wěn)定性，平滑肌與ICC之間縫隙出現(xiàn)異常時，包括縫隙的增加以及消失，將會破壞信號傳導(dǎo)通路（腸神經(jīng)—ICC—平滑肌細(xì)胞）[6]。肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體（Arp2/3）是一種與肌動蛋白結(jié)合的蛋白，起到模板的作用，促進(jìn)肌動蛋白的多聚化，Arp2/3復(fù)合體在微絲形成過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。微絲在細(xì)胞骨架形態(tài)維持、承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部的有序性方面起重要作用，因而Arp2/3復(fù)合體的表達(dá)對于腸道平滑肌收縮功能具備表征作用[7]。

黃茶是中國六大茶類之一。黃茶中含有的主要活性成分為茶多酚、生物堿、氨基酸和茶多糖[8]。據(jù)報道黃茶具有抗氧化、抗炎發(fā)揮抗菌、降糖、降脂等健康功效[9-10]。陳皮是藥食同源食品，活性成分主要為黃酮類、生物堿類、多糖類及揮發(fā)油[11]。陳皮在臨床上主要用于治療咳嗽痰多、消化不良、小兒泄瀉和厭食等疾病[12]。在前期試驗研究中發(fā)現(xiàn)，黃茶與陳皮可以通過增加糞便質(zhì)量、數(shù)量，提高小腸推進(jìn)率，緩解大鼠便秘。

現(xiàn)有研究表明黃茶茶多酚具有通便功能，而多酚中含量最高的是EGCG，因而黃茶的通便功能可能與EGCG相關(guān)。陳皮黃酮類物質(zhì)具有很強的生物活性，已有諸多相關(guān)研究報道。陳皮中的黃酮類成分以橙皮苷、柚皮素為主，推測陳皮改善便秘與這些成分相關(guān)。已有研究中鮮有關(guān)于EGCG、柚皮素、橙皮苷的通便機(jī)制報道，因此試驗探索EGCG、柚皮素、橙皮苷通便作用機(jī)制，為拓寬黃茶、陳皮的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SD大鼠80只，SPF級，180±20 g，全雄，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院[實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2019-0002]；黃茶凍干粉、陳皮凍干粉（黃山華綠園科技有限公司）；90% EGCG、95%橙皮苷（上海源葉生物有限公司）；97%柚皮素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鹽酸洛哌丁胺膠囊（西安楊森制藥有限公司）；Ach Elisa試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DNase/RNase-Free去離子水、FastQuant RT Kit（With gDNase）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子分析天平（上海奕宇電子科技有限公司）；Cycler480實時熒光定量PCR系統(tǒng)（瑞士Roche）；EG1150C包埋機(jī)、RM2235切片機(jī)、TP1020脫水機(jī)（LEICA公司）；51A011 KD-P組織攤片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；HGPF-50烤箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；DP260s達(dá)科為染色機(jī)（深圳市達(dá)科為醫(yī)療科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及造模

80只動物隨機(jī)分為8組，即對照組（CON組）、模型組（MG組）、柚皮素低劑量組（LN組）、柚皮素高劑量組（HN組）、EGCG低劑量組（LE組）、EGCG高劑量組（HE組）、EGCG與橙皮苷組（EH組）、EGCG與柚皮素組（EN組）。模型組在第1～第7天正常喂養(yǎng)，第8～第11天每日夾尾2次，每次30 min。第12天灌胃7 mg/kg劑量洛哌丁胺，不夾尾?？瞻捉M第12天給予等量0.9%生理鹽水（包含5%天MSO），其余期間正常飼養(yǎng)。LN組、HN組、LE組、HE組、EH組、EN組，樣品使用0.9%生理鹽水（包含5% DMSO）溶解，每天僅灌胃1次，灌胃濃度如表1所示。LN組、HN組、LE組、HE組、EH組、EN組在第1～第12天分別灌胃不同樣品，第8～第11天每日夾尾2次，每次30 min。第12天灌胃7 mg/kg劑量洛哌丁胺，不夾尾。

表1 功效成分組合信息

1.3.2 觀察指標(biāo)

1.3.2.1 乙酰膽堿（Ach）含量測定

第12天灌胃7 mg/kg劑量洛哌丁胺，不夾尾。灌胃洛哌丁胺6 h后，大鼠禁食不禁水6 h，麻醉大鼠，腹主動脈采血，置于抗凝管中，混勻后立即在4 ℃以下以3 000 r/min離心10 min，得到血漿，在-70 ℃保存待測，按照試劑盒要求測定血漿乙酰膽堿（Ach）表達(dá)水平。

1.3.2.2 便秘大鼠結(jié)腸組織c-Kit mRNA、SCF mRNA、BDNF mRNA、GDNF mRNA、Cx43 mRNA表達(dá)水平測定

取100 mg新鮮凍存的大鼠結(jié)腸組織，置于5 mL離心管中，加入1 mL RNA hold和0.5 mL裂解液，勻漿；按照RNA提取試劑盒提取總RNA，上機(jī)檢測總RNA濃度?？俁NA反轉(zhuǎn)錄cDNA：將總RNA稀釋至150 μg/L，抽取6 μL總RNA，加入4 μL Mix及10 μL無RNA酶水，共20 μL的反應(yīng)體系；輕輕混勻后在42 ℃孵育10 min，在85 ℃加熱5 s失活，上機(jī)檢測cDNA濃度。向各管中加入12.5 μL 2×PCR Taq Mix、0.5 μL 10 μmol/L各基因的引物以及各1 μL相應(yīng)的cDNA；陰性管中不加模板；各管補加水至25 μL，混勻；置于PCR儀中進(jìn)行檢測，PCR的統(tǒng)計學(xué)分析采用的是相對定量，采用RQ=2^-ΔΔCt算相對表達(dá)量。引物系列見表2。

表2 Real-time PCR引物序列

1.3.2.3 免疫組化法分析肌動蛋白（Arp2/3）的表達(dá)

結(jié)腸組織免疫組化切片經(jīng)常規(guī)脫蠟脫水、磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗、高壓抗原修復(fù)、PBS沖洗、3%過氧化氫溶液室溫下孵育15 min、PBS沖洗50 μL，滴加一抗，置濕盒內(nèi)孵育（37 ℃/1.5 h），用PBS沖洗，滴加二抗，室溫下孵育30 min，滴加顯色液，清水沖洗，染色封片，顯微鏡觀察。光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)染色呈棕色者判定為陽性細(xì)胞。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有顯示的數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，單因素方差分析比較組間差異，用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰膽堿（Ach）結(jié)果

如圖1所示，乙酰膽堿在便秘模型組中含量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的乙酰膽堿水平均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01）。乙酰膽堿是對腸道運動有調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)遞質(zhì)，通過與腸道M受體結(jié)合促使平滑肌收縮[13]，腸道內(nèi)容物向前推進(jìn)。結(jié)果表明，柚皮素、EGCG、橙皮苷均能通過提升Ach改善便秘。

圖1 不同功效成分組合物對于乙酰膽堿的影響

2.2 c-Kit的mRNA表達(dá)結(jié)果

便秘模型組的c-Kit的mRNA表達(dá)量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結(jié)果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01），低劑量柚皮素（LN組）表現(xiàn)最好，其次是橙皮苷與EGCG組合物（EH組）、低劑量EGCG（LE），結(jié)果說明在提高便秘模型大鼠c-Kit表達(dá)上，陳皮中的柚皮素、EGCG都是低劑量效果優(yōu)于高劑量，橙皮苷與EGCG組合物優(yōu)于柚皮素、EGCG組合物，如圖2所示。

圖2 不同功效成分組合物對于c-Kit mRNA的影響

2.3 SCF的mRNA表達(dá)結(jié)果

便秘模型組SCF的mRNA表達(dá)量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結(jié)果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01），最大劑量柚皮素（HN組）提升SCF表達(dá)效果最優(yōu)，其次是低劑量EGCG（LE組）、柚皮素與EGCG組合物（EN）。上述結(jié)果表明在提升SCF表達(dá)上，低劑量EGCG優(yōu)于高劑量EGCG，高劑量柚皮素優(yōu)于低劑量柚皮素，柚皮素與EGCG組合物優(yōu)于橙皮苷與EGCG組合物，如圖3所示。

圖3 不同功效成分組合物對于SCF mRNA的影響

2.4 BDNF的mRNA表達(dá)結(jié)果

便秘模型組的BDNF的mRNA表達(dá)量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結(jié)果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01）。橙皮苷與EGCG組合物（EH組）提升BDNF表達(dá)效果最優(yōu)，其次是低劑量柚皮素（LN組）、低劑量EGCG（LE組）。上述結(jié)果表明在提升BDNF表達(dá)上，低劑量EGCG優(yōu)于高劑量EGCG，低劑量柚皮素優(yōu)于高劑量柚皮素，橙皮苷與EGCG組合物優(yōu)于柚皮素與EGCG組合物，如圖4所示。

圖4 不同功效成分組合物對于BDNF mRNA的影響

2.5 GDNF的mRNA表達(dá)結(jié)果

便秘模型組的GDNF的mRNA表達(dá)量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結(jié)果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01）。低劑量柚皮素（LN組）提升GDNF表達(dá)效果最優(yōu)，其次是高劑量柚皮素（HN組）、低劑量EGCG（LE組）。結(jié)果表明在提升GDNF表達(dá)上，低劑量EGCG優(yōu)于高劑量EGCG，低劑量柚皮素優(yōu)于高劑量柚皮素，橙皮苷與EGCG組合物優(yōu)于柚皮素與EGCG組合物，如圖5所示。

圖5 不同功效成分組合物對于GDNF mRNA的影響

2.6 Cx43的mRNA表達(dá)結(jié)果

便秘模型組的Cx43的mRNA表達(dá)量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結(jié)果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01）。橙皮苷與EGCG組合物（EH組）提升Cx43表達(dá)效果最優(yōu)，其次是低劑量柚皮素（LN組）、高劑量柚皮素（HN組）。上述結(jié)果表明在提升GDNF表達(dá)上，低劑量EGCG優(yōu)于高劑量EGCG，低劑量柚皮素優(yōu)于高劑量柚皮素，橙皮苷與EGCG組合物優(yōu)于柚皮素與EGCG組合物，Cx43表達(dá)上升有利于腸道上ICC細(xì)胞信號更好地傳播到平滑肌上，使得腸道狀態(tài)更加穩(wěn)定，腸道內(nèi)容物更快速排出，減輕便秘癥狀，如圖6所示。

圖6 不同功效成分組合物對于Cx43 mRNA的影響

2.7 Arp2/3的免疫組化結(jié)果

如圖7所示，光鏡下觀察肌動蛋白（Arp2/3）呈棕黃色，在黏膜各肌層均有Arp2/3的分布。模型組Arp2/3分布與空白對照組相比，數(shù)目減少，分布不規(guī)則。高劑量柚皮素（HN組）、低劑量EGCG（LE組）、低劑量橙皮苷與EGCG（EH組）的Arp2/3數(shù)目、分布與空白對照組相似，說明這幾組功效成分組合物可以恢復(fù)受損平滑肌，增強腸道蠕動，緩解便秘問題。

圖7 不同功效成分組合物對于Arp2/3的影響

3 結(jié)論

我國便秘人群眾多，特別是隨著老齡化加劇，老年人口便秘問題尤為突出，增加了社會負(fù)擔(dān)[14]。多數(shù)通便藥物具有不良反應(yīng)，而植物食品來源的通便成分更安全、可靠，因此開展相關(guān)的研究顯得尤為迫切[15]。

便秘的產(chǎn)生深層機(jī)制與Cajal細(xì)胞數(shù)量降低，相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)、營養(yǎng)因子水平下降，平滑肌受損等有關(guān)[16-17]。已知Cajal細(xì)胞是腸道蠕動的起搏器，與平滑肌共同推動內(nèi)容物蠕動，相關(guān)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會對Cajal細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常也會使得蠕動減慢。多數(shù)研究表明，在便秘人群與便秘動物模型上，可以直觀看到Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量降低[18]，c-Kit與SCF表達(dá)的減少[19]，腸道蠕動減慢[20]。神經(jīng)調(diào)節(jié)方面，便秘群體中會出現(xiàn)神經(jīng)興奮遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子降低的現(xiàn)象。神經(jīng)營養(yǎng)因子對于Cajal間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生是必不可少的，同時BDNF能夠通過激活TrkB.PLC/IP3信號通路[21]，改變腸神經(jīng)支配結(jié)構(gòu)以及平滑肌的繼發(fā)損傷，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道動力，緩解便秘[22]。GDNF的增多能促進(jìn)受損的胃腸道的修復(fù)，緩解便秘[23-24]。通過老年便秘模型大鼠觀察到，連接蛋白Cx43表達(dá)下降，ICC與平滑肌之間的連接穩(wěn)定性受損[25]。平滑肌的收縮功能下降也是便秘問題產(chǎn)生原因之一[26]。

試驗中便秘大鼠口服EGCG、柚皮素后，與模型組相比結(jié)腸組織中c-Kit、SCF轉(zhuǎn)錄顯著提高，提示Cajal細(xì)胞功能得到改善，這將有利于腸道電節(jié)律的產(chǎn)生，加強Cajal細(xì)胞與神經(jīng)系統(tǒng)、平滑肌更好的相互協(xié)同作用。Cajal細(xì)胞改善伴隨著胃動素受體增多，腸道推進(jìn)率加快，有利于從根本上增強腸道活動能力，使得腸道蠕動增強。提升c-Kit、SCF表達(dá)上，柚皮素強于EGCG，同時橙皮苷與EGCG聯(lián)用也具備改善效果，說明EGCG、柚皮素、橙皮苷可以修復(fù)腸道Cajal細(xì)胞功能，從而促進(jìn)腸道轉(zhuǎn)運，減輕便秘癥狀。Yin等[27]研究結(jié)果也顯示柚皮素能夠提升便秘小鼠結(jié)腸上c-Kit、SCF表達(dá)上調(diào)，與試驗結(jié)果相符。GDNF來源于腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（Enteric Glial Cell，EGCs），EGCs在腸神經(jīng)系統(tǒng)中含量最多，能調(diào)節(jié)胃腸神經(jīng)活動，EGCs通過GDNF的位置發(fā)揮銜接腸道各個細(xì)胞之間的作用，從而達(dá)到維持腸道黏膜完整性的功能，因此GDNF的表達(dá)增加有利于腸神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)、保護(hù)腸道黏膜屏障功能，緩解便秘。腦腸軸研究中發(fā)現(xiàn)BDNF除了參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，還參與調(diào)節(jié)胃腸道動力。在BDNF基因敲除小鼠模型中，表現(xiàn)出腸道動力明顯下降。BDNF可通過TRKB-PLC-Ca2+信號通路調(diào)節(jié)腸道動力，同時增強5-HT、Ach釋放，促進(jìn)平滑肌收縮[28]。GDNF、BDNFmRNA上調(diào)表明EGCG、柚皮素、橙皮苷可通過神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，改善便秘大鼠腸道功能，加快內(nèi)容物傳輸。

試驗中高、低劑量的EGCG均能提高Ach水平，表明腸道內(nèi)的調(diào)控得到加強，有利于腸道運動。Zhang等[29]研究也發(fā)現(xiàn)EGCG能夠提高大鼠Ach水平，加快腸道運輸，與試驗結(jié)果相符。

在EGCG、柚皮素處理之后，連接蛋白Cx43的水平顯著提高，低劑量的EGCG、柚皮素優(yōu)于高劑量，橙皮苷與EGCG聯(lián)用效果優(yōu)于單獨使用EGCG，表明橙皮苷具備調(diào)節(jié)連接蛋白Cx43功能。結(jié)果表示EGCG、柚皮素、橙皮苷使得ICC與平滑肌之間的穩(wěn)定性提高，Cx43作為ICC細(xì)胞與平滑肌的信息通道，該蛋白的表達(dá)增加有利于電生理信號更加順利產(chǎn)生并傳遞至消化道平滑肌，從而使得腸道整體運動功能提升，推動物質(zhì)轉(zhuǎn)運。免疫組化試驗結(jié)果說明，EGCG、柚皮素能夠通過增加肌動蛋白（Arp2/3）的表達(dá)，平滑肌的收縮能力加強，加快腸道蠕動。試驗中，與模型組相比，通過不同劑量柚皮素、EGCG之間的比較可知，低劑量柚皮素和EGCG腸道恢復(fù)及緩解便秘效果更好。

結(jié)果表明EGCG、柚皮素能夠提升Cajal間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白c-Kit和SCF的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，顯著增加GDNF、BDNF、Ach，改善ICC與平滑肌之間受損問題，增加肌動蛋白（Arp2/3）的表達(dá)，EGCG、柚皮素通過以上機(jī)制改善大鼠便秘。EGCG與柚皮素組合、EGCG與橙皮苷組合2種組合方式也能通上述機(jī)制改善便秘。便秘問題是一個多因素相互作用形成的問題，通過調(diào)整單一的層面不能很好達(dá)到徹底解決便秘的目的。蒽醌類的植物性瀉劑（如大黃、弗朗鼠李皮、番瀉葉、蘆薈等）、酚酞等主要通過刺激結(jié)腸黏膜中的感覺神經(jīng)末梢，增強結(jié)腸動力，并刺激腸道分泌，從而促進(jìn)排便，但是長期服用蒽醌類植物性瀉劑會導(dǎo)致腸神經(jīng)損害、結(jié)腸黑變病等問題[30]。試驗更進(jìn)一步探究EGCG與柚皮素、橙皮苷解決便秘的多條路徑，可為相關(guān)通便機(jī)制研究提供參考。

綜上所述，EGCG、柚皮素、橙皮苷通過調(diào)節(jié)GDNF、BDNF、Ach、c-Kit、SCF、肌動蛋白（Arp2/3）的表達(dá)，提升神經(jīng)-ICC-平滑肌整體的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮通便作用。試驗結(jié)果為黃茶、陳皮在健康食品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。