乳酸菌發(fā)酵花茶的制備工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

祝曼麗，鄭真姐，魏琳芽，劉嬌，許云賀，張莉力*

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 12100）

玫瑰花富含黃酮、總酚、氨基酸、微量元素、揮發(fā)油、多糖等活性成分[1]，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜安神等功效，被廣泛應(yīng)用在食品、藥品、保健品等領(lǐng)域[2-5]。洛神花又名玫瑰茄，洛神花中含有黃酮、總酚、有機(jī)酸等活性成分，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤等作用[6]，被廣泛應(yīng)用茶劑、冷熱飲料、果汁、果醬等方面[7]。蠶豆花中含有槲皮素和山奈酚，有良好的抗氧化活性，臨床上從蠶豆花中提取左旋多巴治療帕金森[8]，具有良好的降血壓活性[9]。近幾年，人們對(duì)花茶的需求量顯著增加，花茶相關(guān)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和利用還處于初級(jí)階段，產(chǎn)品較單一[10]。

目前，很多人把眼光放在了乳酸菌發(fā)酵植物基質(zhì)上[11]。植物基質(zhì)發(fā)酵可以改善風(fēng)味，有助于提高抗氧化能力。蘋(píng)果汁經(jīng)乳酸桿菌發(fā)酵后抗氧化性有了明顯的提高，乳酸菌發(fā)酵植物基質(zhì)可以提高酚類(lèi)化合物生物利用[12]，玫瑰干花瓣用乳酸菌發(fā)酵后抗氧化能力顯著增強(qiáng)[13]。經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵后的玫瑰花抗氧化能力顯著增加[14]。

因此，以玫瑰花、洛神花和蠶豆花為主要原料，以L(fǎng)iquorilactobacillus sataumensisML30和Lactococcus lactis subsp lactisYM34為發(fā)酵劑，以模糊評(píng)價(jià)為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵花茶的最佳發(fā)酵工藝優(yōu)化，并測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中黃酮含量、總酚含量、DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和羥自由基清除能力對(duì)其在發(fā)酵過(guò)程中的抗氧化能力并進(jìn)行評(píng)價(jià)，為乳酸菌發(fā)酵花茶產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

玫瑰花（山東濟(jì)南平陰縣）；洛神花（安徽亳州沁園春堂）；蠶豆花（河北保定花辰月夕旗艦店）；黃冰糖（南京甘汁園糖業(yè)有限公司）。

研究初步設(shè)定玫瑰花和洛神花的比例3∶2、添加量3%、蠶豆花添加量0.02%、黃冰糖添加量8%、菌株比例1∶1、初始pH 5.2、發(fā)酵溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間24 h。

L.satsumensisML30、L.lactis subsp lactisYM34發(fā)酵劑（菌保藏于錦州醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室）；L.satsumensisML30種子培養(yǎng)基（紅糖添加量6%、大豆低聚肽添加量0.3%、胡蘿卜汁添加量7%、磷酸氫二鉀的添加量0.2%、發(fā)酵溫度30 ℃、初始pH 6、菌株接種量5%、發(fā)酵時(shí)間為16～18 h）；L.lactis subsp lactisYM34種子培養(yǎng)基參考李源等[15]。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SG-C20 K36電磁爐（中山市森高電器有限公司）；DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）；JB-VS-1300超凈工作臺(tái)（金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)）；PHS-3B精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠(chǎng)）；紫外分光光度計(jì)（上海滬凈醫(yī)療器械有限公司）；LX-B100L立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 花茶制備

按玫瑰花和洛神花的比例3∶2、添加量3%，蠶豆花0.02%放入到水中煮制沸騰，將洛神花挑出放入榨汁機(jī)中并加入適量水打碎5 s，過(guò)0.125 mm篩子和8層紗布。加入8%黃冰糖在70 ℃下加熱溶解，攪拌均勻，花茶冷卻至室溫，用磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)pH，分裝，在95 ℃下滅菌10 min。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以制備100 mL的花茶為標(biāo)準(zhǔn)，以模糊評(píng)定法[16]為評(píng)價(jià)指標(biāo)，模糊評(píng)定法中感官評(píng)分占60%，菌體密度占40%，所有權(quán)數(shù)之和為1。權(quán)重系數(shù)矩陣M=（60%，40%）評(píng)價(jià)結(jié)果為V=MR，R為最大值，根據(jù)V的大小來(lái)綜合判斷花茶發(fā)酵程度?？疾烊樗峋l(fā)酵花茶菌株接種量（2%，4%，6%，8%和10%）、菌株比例（YM34-ML30比例3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3）、初始pH（pH 4.5，5，5.5，6和6.5）、培養(yǎng)溫度（20，25，30，35和40 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（4，8，12，16和20 h）對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶品質(zhì)的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以模糊評(píng)定為指標(biāo)，選出單因素中影響較大的因素，以發(fā)酵時(shí)間（A）、初始pH（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量，以模糊評(píng)分（V）為響應(yīng)值，進(jìn)行工藝優(yōu)化試驗(yàn)，因素與水平如表1所示。

表1 乳酸菌發(fā)酵花茶加工工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表2 感官評(píng)分表

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

根據(jù)薛寶玲等[17]的感官評(píng)價(jià)方法，選擇10名感官評(píng)價(jià)員（5男5女），以乳酸菌發(fā)酵花茶的外觀、口感和香味等評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，總分為100分。

1.3.5 吸光度的測(cè)定

吸光度采用紫外分光光度法[18]，以未發(fā)酵的花茶為空白，測(cè)菌體密度。

1.3.6 活性成分測(cè)定

最佳發(fā)酵條件優(yōu)化的花茶，分別選取0，5，10和15 h四個(gè)時(shí)間段乳酸菌發(fā)酵的花茶，并測(cè)定最佳工藝下乳酸菌發(fā)酵花茶的黃酮和總酚含量。其中測(cè)定黃酮含量參照孫小晶等[19]的方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程為y=0.135 6x-0.044 4，R2=0.993 3，重復(fù)3次試驗(yàn)計(jì)算乳酸菌發(fā)酵花茶中的黃酮含量?？偡雍坎捎酶Ａ址颖壬╗20]，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程為y=0.055 5x+0.000 7，R2=0.999 5，重復(fù)3次試驗(yàn)計(jì)算乳酸菌發(fā)酵花茶中的總酚含量。

1.3.7 抗氧化性測(cè)定

分別選取0，5，10和15 h四個(gè)時(shí)間段乳酸菌發(fā)酵的花茶，并測(cè)定DPPH自由基，參考Yang等[21]的檢測(cè)方法；超氧自由基清除率的研究參考高善行等[22]的檢測(cè)方法；羥自由基的清除率參考賈寒冰等[23]的檢測(cè)方法。評(píng)價(jià)乳酸菌發(fā)酵花茶的抗氧化活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)利用SPSS 22.0版本對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和LSD多重檢驗(yàn)（P＜0.05），通過(guò)SNK檢驗(yàn)法進(jìn)行各組間的兩兩差異性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 菌株接種量對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

菌株接種量為2%，4%，6%，8%和10%，分析菌株接種量對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表3所示，菌株接種量過(guò)大或過(guò)小對(duì)吸光度都有很大的影響，菌株接種量小于6%或大于6%時(shí)，乳酸菌發(fā)酵花茶的吸光度低于正常。當(dāng)菌株接種量為6%時(shí)，乳酸菌發(fā)酵花茶的吸光度最高，結(jié)合感官評(píng)價(jià)后的V值也最高，此時(shí)得到的產(chǎn)品沉淀少，有一種玫瑰的淡淡清香味（P＜0.05），因此，較優(yōu)的菌株接種量為6%。

表3 菌種接種量對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.1.2 菌株比例對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

菌株比例為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3，分析菌株比例對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表4所示，菌株比例為1∶1時(shí)，乳酸菌發(fā)酵花茶中V值最高，吸光度最高為0.716±0.009，感官評(píng)價(jià)為79.5±0.47分，均高于其他比例（P＜0.05），在此情況下乳酸菌發(fā)酵花茶產(chǎn)品無(wú)沉淀，酸甜適中，說(shuō)明在此菌株比例下，乳酸乳球菌和乳酸桿菌都能很好地生長(zhǎng)，因此，選擇菌株比例1∶1。

表4 菌種比例對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.1.3 初始pH對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

初始pH 4.5，5，5.5，6和6.5，分析初始pH對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表5所示，當(dāng)pH為6時(shí)，乳酸菌發(fā)酵花茶中V值最高，得到的產(chǎn)品吸光度和感官評(píng)分好（P＜0.05），pH過(guò)低，乳酸乳球菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，沒(méi)有為乳酸乳球菌創(chuàng)造良好的生長(zhǎng)環(huán)境，當(dāng)初始pH過(guò)高時(shí)，乳酸桿菌的生長(zhǎng)又會(huì)受到抑制，從而導(dǎo)致乳酸菌發(fā)酵花茶的風(fēng)味不佳。因此，選擇pH 6。

表5 不同pH對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

培養(yǎng)溫度為20，25，30，35和40 ℃，分析培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表6所示，溫度對(duì)乳酸菌有較大影響，發(fā)酵的溫度過(guò)低，菌體不能正常地生長(zhǎng)繁殖，在此階段菌體的代謝較慢，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，菌體的吸光度最高，但花茶的顏色較暗淡、略有苦味，V值不高，當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，吸光度達(dá)到0.441，感官評(píng)價(jià)最高，顏色鮮艷、苦味不重、發(fā)酵風(fēng)味良好，因此，培養(yǎng)溫度選擇35 ℃。

表6 發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

發(fā)酵時(shí)間為4，8，12，16和20 h，分析發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表7所示，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，吸光度越高，感官評(píng)價(jià)得分就越低，感官評(píng)價(jià)下降（P＜0.05），當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為16 h時(shí)，感官評(píng)價(jià)最高，發(fā)酵風(fēng)味良好、質(zhì)地均勻、顏色鮮艷且長(zhǎng)時(shí)間不變色、酸甜適中，V值最高為0.952±0.003（P＜0.05），因此，選擇發(fā)酵時(shí)間16 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表7 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵花茶發(fā)酵工藝結(jié)果

2.2.1 乳酸菌發(fā)酵花茶響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵時(shí)間（A）、初始pH（B）、培養(yǎng)溫度（C）作為考察因素，依據(jù)模糊評(píng)定法確定V值，各因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 乳酸菌發(fā)酵花茶工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立

如表9所示，利用Design Expert 10.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸分析建立方程：V=0.95-0.039×A+0.032×B+0.037 5×C+0.085×A×B-0.028×A×C+0.040×B×C-0.079×A2-0.041×B2-0.089×C2。

表9 乳酸菌發(fā)酵花茶工藝優(yōu)化回歸模型方差分析

表10 乳酸菌發(fā)酵花茶抗氧化活性

響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械腁、AB、A2、C2影響差異均極顯著（P＜0.01），B、交互項(xiàng)BC對(duì)試驗(yàn)響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），C、交互項(xiàng)AC對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著（P＞0.05）。由統(tǒng)計(jì)學(xué)模型可以得出，回歸系數(shù)R2=0.958 5，模型校正決定系數(shù)Radj2=0.911 8，由此說(shuō)明該模型可以解釋91.11%響應(yīng)值的變化，擬合度良好，誤差小，可以用來(lái)分析乳酸菌發(fā)酵花茶的大眾接受度，具有一定的指導(dǎo)意義。因變量與試驗(yàn)中所考察的自變量之間的線(xiàn)性關(guān)系顯著，說(shuō)明在此次對(duì)花茶發(fā)酵工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)中，試驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較小，結(jié)果可信。它們之間的主次關(guān)系依次為發(fā)酵時(shí)間＞pH＞發(fā)酵溫度。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化分析，可得到花茶發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件。根據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件求出回歸模型極值點(diǎn)，結(jié)果表明最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間14.90 h、pH 5.7、發(fā)酵溫度35.6 ℃，此時(shí)V值為0.952 6。為了方便乳酸菌發(fā)酵花茶的制作，將最優(yōu)條件調(diào)整為發(fā)酵時(shí)間15 h、pH 5.7、發(fā)酵溫度36 ℃。經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，V值為0.95，活菌數(shù)為3.6×108CFU/mL，發(fā)酵后的pH為3.8±0.05，這些指標(biāo)說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，適合應(yīng)用于花茶發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化。

2.3 花茶發(fā)酵過(guò)程中活性成分和抗氧化能力分析

2.3.1 花茶發(fā)酵過(guò)程中活性成分的變化

花茶發(fā)酵過(guò)程中黃酮和總酚含量變化，結(jié)果如圖1所示。黃酮和總酚含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，總酚含量在發(fā)酵初始階段（0～10 h）增加速度較緩慢，在10～15 h快速增加，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，總酚含量由最初的2.29±0.05 μg/mL增長(zhǎng)至3.89±0.09 μg/mL，提高了69.76%，經(jīng)過(guò)去糖基化反應(yīng)使乳酸菌發(fā)酵花茶中有更多的糖基化酚，破壞植物的細(xì)胞壁，從而釋放出更多的可溶性共軛或者不溶性酚類(lèi)化合物，從而導(dǎo)致總酚含量增加[24]。在發(fā)酵0～5 h，黃酮含量增長(zhǎng)得最快，由1.09±0.04 mg/mL增長(zhǎng)至1.20±0.04 mg/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮的增長(zhǎng)速度減緩，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)黃酮增長(zhǎng)至1.33±0.04 mg/mL，比發(fā)酵前提高了20.54%。酶經(jīng)過(guò)酶解后會(huì)破壞細(xì)胞壁從而使黃酮更好地釋放出來(lái)[25]。在發(fā)酵過(guò)程中，黃酮類(lèi)和總酚類(lèi)物質(zhì)含量升高，是玫瑰花中的重要的活性生物成分，具有較強(qiáng)的生物活性，是一種天然的抗氧化劑[26]。

圖1 花茶發(fā)酵過(guò)程中活性物質(zhì)含量變化

2.3.2 發(fā)酵過(guò)程中抗氧化活性的變化

乳酸菌發(fā)酵后，花茶發(fā)酵的DPPH自由基清除率、超氧自由基清除率顯著升高，分別上升了33.44%和6.13%，羥自由基清除率下降了6.63%。DPPH自由基清除能力增加表明微生物發(fā)酵可能會(huì)提高多酚化合物的可用性，說(shuō)明乳酸菌發(fā)酵花茶具有一定的抗氧化活性。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生酚類(lèi)和黃酮類(lèi)物質(zhì)能使DPPH清除率的上升，使其抗氧性增強(qiáng)。研究也發(fā)現(xiàn)，總酚與清除超氧陰離子能力有顯著的量效關(guān)系[27]。

3 結(jié)論

乳酸菌發(fā)酵花茶的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)是菌株接種量6%、菌株比例1∶1、初始pH 5.5、培養(yǎng)溫度36℃、發(fā)酵時(shí)間15 h。乳酸菌發(fā)酵花茶在發(fā)酵過(guò)程中，黃酮的含量提高了20.54%，多酚含量提高了69.76%，DPPH自由基清除能力提高了33.44%，超氧自由基清除率提高了6.13%，羥自由基清除率下降了6.63%。結(jié)果表明花茶經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵后抗氧化能力明顯提高，為后續(xù)研究乳酸菌發(fā)酵花茶的營(yíng)養(yǎng)成分奠定理論基礎(chǔ)。