血清miR-146b-3p、miR-133a-3p檢測(cè)在新生兒急性呼吸窘迫綜合征病情評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)中的臨床價(jià)值*

袁小又,張 妍,冷 惠

崇州市人民醫(yī)院兒科,四川成都 611230

新生兒急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由于肺泡毛細(xì)血管通透性過度導(dǎo)致的低氧血癥和雙側(cè)肺水腫的急性發(fā)作,在新生兒中極為常見,以呻吟發(fā)紺、吸氣三凹征、呼吸衰竭、呼吸困難為主要表現(xiàn)特征[1]。但新生兒ARDS呈現(xiàn)出發(fā)展快速、病情嚴(yán)重、死亡率較高等特點(diǎn),對(duì)新生兒生命造成了嚴(yán)重威脅,即使生存的新生兒患者,其神經(jīng)系統(tǒng)及肺功能也受到一定損傷,影響其生長(zhǎng)發(fā)育[2]。新生兒ARDS病因較多,目前尚無完全定論,目前也缺乏針對(duì)新生兒ARDS的特異性治療方法,因此尋找新生兒ARDS發(fā)病和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物意義重大。微小RNA(miRNA)是一類調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA,通過與互補(bǔ)的靶mRNA結(jié)合,導(dǎo)致mRNA降解或翻譯,在維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,失調(diào)的miRNA表達(dá)可能參與許多疾病的發(fā)病機(jī)制,包括新生兒ARDS疾病[3]。miR-146b-3p作為miRNA家族成員,在膿毒癥誘導(dǎo)的ARDS小鼠模型中,miR-146b-3p水平下降,上調(diào)miR-146b-3p水平可改善膿毒癥小鼠ARDS癥狀,為ARDS的臨床治療奠定了理論基礎(chǔ)[4]。然而HUI等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p在膿毒癥誘導(dǎo)的ARDS小鼠顯著增加,下調(diào)miR-133a-3p水平可能通過抑制炎癥反應(yīng)和肺組織細(xì)胞凋亡對(duì)膿毒癥介導(dǎo)的ARDS發(fā)揮保護(hù)作用,但兩者在新生兒ARDS中少有報(bào)道,因此本研究旨在探討血清miR-146b-3p、miR-133a-3p檢測(cè)在新生兒ARDS病情評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)中的臨床價(jià)值,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取于本院2020年4月至2021年8月新生兒科的收治的108例新生兒ARDS患兒。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《新生兒急性呼吸窘迫綜合征蒙特勒(2017年版)》[6];(2)急性起病(發(fā)病時(shí)間小于3 d),胎齡超過34周,入住重癥監(jiān)護(hù)室時(shí)間超過72 h;(3)結(jié)合患者臨床癥狀、體征以及經(jīng)影像學(xué)檢查確診,其中超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示無左心房高壓,X線胸片顯示雙肺彌漫性陰影,透明度降低,毛玻璃顆粒狀;(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)先天性代謝紊亂、先天性心臟病、原發(fā)性肺泡表面活性物質(zhì)缺乏;(2)肺外嚴(yán)重感染;(3)肺和胸壁畸形或先天畸形。本研究已獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

以確認(rèn)為ARDS為研究起點(diǎn),以死亡或痊愈出院為終點(diǎn),將108例新生兒ARDS患者分為生存組、死亡組,其中生存組73例患兒治愈和病情好轉(zhuǎn)出院,死亡組35例病情危重放棄治療和死亡。另外,108例新生兒ARDS患者依據(jù)病情嚴(yán)重程度及入住24 h首次胸片結(jié)果分為輕度組及重度組。其中輕度組包括X射線結(jié)果Ⅰ級(jí)(雙肺透亮度降低,伴有細(xì)小顆粒與網(wǎng)狀陰影)和Ⅱ級(jí)(支氣管充氣征,病變至肺野中外帶),共70例;重度組包括X射線結(jié)果Ⅲ級(jí)(心緣模糊,透亮度降低,病變加深)和Ⅳ級(jí)(支氣管充氣征加重,肺野呈白肺),共38例。

1.2研究方法

1.2.1一般資料收集 收集108例新生兒ARDS患者的臨床資料,包括年齡、性別、分娩方式、出生體質(zhì)量以及母親基本資料等,并對(duì)所有患兒確診后12 h內(nèi)應(yīng)用新生兒急性生理學(xué)評(píng)分圍生期補(bǔ)充Ⅱ(SNAPPE-Ⅱ)進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分范圍0～162分,分值越高,病情越嚴(yán)重。

1.2.2樣本采集 患兒均于確診次日空腹采集5 mL靜脈血,于4 ℃下,3 000 r/min離心10 min,取上層血清于-80 ℃低溫保存樣本。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)血清中miR-146b-3p、miR-133a-3p水平 取出血清樣本,采用RNA提取試劑盒(貨號(hào):74014,廣州創(chuàng)侖生物制品有限公司)提取總RNA,以紫外分光光度計(jì)(型號(hào):UV-2204,上海析譜儀器有限公司)檢測(cè)RNA純度和濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明(型號(hào):K1622,北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司)合成cDNA,然后在PCR擴(kuò)增儀(型號(hào):Veriti96,美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系為1 μL上下游引物,12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM,總體積為 25 μL(包含反應(yīng)水),設(shè)置擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃延伸60 s,45個(gè)循環(huán)。并使用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-146b-3p、miR-133a-3p水平。miR-146b-3p上游引物:5′-TGA GAA CTG AAT TCC ATA GGC T-3′,下游引物:5′-GCA CTG TCA GAC CGA GAC AAG-3′;miR-133a-3p上游引物:5′-GCC TTT GGT CCC CTT CAA C-3′,下游引物:5′-TAT GCT TGT TCT CGT CTC TGT GTC-3′;內(nèi)參U6上游引物:5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′,下游引物:5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。

2 結(jié) 果

2.1比較兩組患者一般資料 與生存組相比,死亡組在患兒性別、胎齡、出生體質(zhì)量、宮內(nèi)窘迫、胎糞吸入綜合征、新生兒窒息、母親年齡及糖尿病方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),SNAPPE-Ⅱ評(píng)分顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組一般資料比較或n/n)

2.2兩組血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平比較 與生存組相比,死亡組血清miR-146b-3p水平均顯著降低,miR-133a-3p水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 較兩組血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平

2.3不同嚴(yán)重程度新生兒ARDS患者血清中miR-146b-3p、miR-133a-3p水平比較 與輕度組相比,重度組血清miR-146b-3p水平均顯著降低,miR-133a-3p水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 比較不同嚴(yán)重程度新生兒ARDS患者血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平

2.4新生兒ARDS患者血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平的相關(guān)性 Pearson法分析顯示,新生兒ARDS患者死亡組血清miR-146b-3p與miR-133a-3p水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.441,P<0.05),見圖1。

圖1 分析血清中miR-146b-3p、miR-133a-3p水平的相關(guān)性

2.5血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平對(duì)新生兒ARDS患者死亡診斷價(jià)值分析 血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平診斷新生兒ARDS患者死亡的曲線下面積(AUC)分別為0.883、0.829,靈敏度分別為82.86%、68.57%,特異度分別為83.56%、87.67%;二者聯(lián)合診斷新生兒ARDS患者死亡的AUC、靈敏度、特異度分別為0.923、91.43%、78.08%。見圖2。

圖2 血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平診斷新生兒ARDS患者預(yù)后的ROC曲線圖

3 討 論

新生兒ARDS是一種嚴(yán)重威脅新生兒生命的呼吸危重癥,主要表現(xiàn)為不同程度的低氧血癥、肺順應(yīng)性下降、彌漫性透光率下降、炎性滲出,是新生兒呼吸衰竭和死亡的重要原因[7]。目前ARDS患兒的治療主要以對(duì)癥綜合治療為主,如肺表面活性物質(zhì)替代、呼吸及營(yíng)養(yǎng)支持、體外膜肺氧合等,但新生兒ARDS治療難度大,死亡率仍然較高[8],因此尋找新的生物標(biāo)志物以幫助預(yù)測(cè)新生兒ARDS的死亡風(fēng)險(xiǎn),從而做出積極干預(yù)措施對(duì)改善其預(yù)后至關(guān)重要。

miRNA是由20～23個(gè)核苷酸雙鍵組成的非編碼RNA,可以與mRNA上的特定靶標(biāo)相互作用以調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而起到抑制或降解靶標(biāo)的作用,參與各種細(xì)胞過程,包括細(xì)胞活力、分化、凋亡、免疫反應(yīng)和不同的病理過程,特別是miRNA在血液樣本中水平相對(duì)穩(wěn)定,可作為診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物[9]。miRNA參與ARDS的發(fā)生發(fā)展,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,是ARDS潛在的新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[10]。如新生兒ARDS血清miR-200c-3p水平顯著增加,與病情的嚴(yán)重程度有關(guān),對(duì)于新生兒ARDS預(yù)后具有一定的診斷價(jià)值[11]。蔣萍萍等[12]研究證明,miR-150在ARDS患者血清中呈低表達(dá),其有望成為ARDS發(fā)病和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物。既往有研究表明,miR-146b-3p主要作為炎癥和癌癥的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用,但其在許多肺部疾病也發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。先前研究報(bào)告顯示,沙杰等[14]發(fā)現(xiàn)與良性肺結(jié)節(jié)患者和健康者相比,miR-146b-3p在非小細(xì)胞肺癌患者外周血中顯著過表達(dá)。miR-146b-3p被證明可能是肺腺癌的血液潛在生物標(biāo)志物[15]。除此之外,LIU等[4]研究證明上調(diào)miR-146b-3p表達(dá)可改善膿毒癥小鼠ARDS癥狀?；谝陨衔墨I(xiàn)調(diào)研,推測(cè)miR-146b-3p可能也與新生兒ARDS疾病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示與生存組相比,死亡組血清miR-146b-3p水平顯著降低。提示miR-146b-3p可能參與新生兒ARDS的病情進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)隨著病情的加重,血清miR-146b-3p水平顯著降低,表明miR-146b-3p水平與新生兒ARDS病情危重程度有關(guān)。

miR-133a-3p也是miRNA家族成員。SHAN等[16]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者中miR-133a-3p的表達(dá)較與健康對(duì)照者相比顯著升高,聯(lián)合其他miRNA可以提高肺腺癌的診斷能力,有望作為診斷肺腺癌的潛在生物標(biāo)志物。LI等[17]研究發(fā)現(xiàn),肺癌組織中miR-133a-3p的低表達(dá)與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān),miR-133a-3p的過表達(dá)增加了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,可為人類非小細(xì)胞肺癌治療提供潛在治療策略。推測(cè)miR-133a-3p可能也與肺部疾病有關(guān)。另外,蘭超[18]等研究發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p的mRNA表達(dá)量在膿毒癥患者中表達(dá)升高,且隨著病情加重呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì),可作為膿毒癥診斷的特異性標(biāo)志。HUI等[5]研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥介導(dǎo)的 ARDS小鼠miR-133a-3p顯著增加,下調(diào)miR-133a-3p表達(dá)可減輕ARDS小鼠癥狀,但是對(duì)于新生兒ARDS鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)與生存組相比,死亡組血清miR-133a-3p水平顯著增加,且隨著病情的加重,血清miR-133a-3p水平逐漸增加,表明miR-133a-3p水平與新生兒ARDS預(yù)后及危重程度有關(guān)。ZHANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)ARDS患者血清中miRNA異常表達(dá),可能與患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)。本研究相關(guān)性顯示死亡組血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步說明了miR-146b-3p水平越低,miR-133a-3p水平越高,新生兒ARDS發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)越大。ROC曲線顯示,血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平診斷新生兒ARDS患者死亡的AUC分別為0.883、0.829,靈敏度分別為82.86%、68.57%,特異度分別為83.56%、87.67%;二者聯(lián)合診斷新生兒ARDS患者死亡的AUC、靈敏度、特異度分別為0.923、91.43%、78.08%,表明二者聯(lián)合對(duì)新生兒ARDS預(yù)后具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述,血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平與新生兒ARDS患者嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān),且二者聯(lián)合對(duì)新生兒ARDS患者與預(yù)后預(yù)測(cè)具有一定的價(jià)值,有望作為新生兒ARDS患者預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在標(biāo)志物。但文章樣本量較少且缺乏相關(guān)機(jī)制的研究,未來將針對(duì)其不足進(jìn)行改善進(jìn)而進(jìn)一步驗(yàn)證本結(jié)論。