全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳技術(shù)在重組蛋白疫苗電荷異質(zhì)性分析中的應(yīng)用*

陳全姚,杜加亮 綜述,劉萬(wàn)卉,王 蘭 審校

1.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,山東煙臺(tái) 264005;2.中國(guó)食品藥品檢定研究院?jiǎn)慰寺】贵w產(chǎn)品室,國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102629

隨著氣候、生態(tài)和社會(huì)環(huán)境變化帶來(lái)的影響以及耐藥等一系列問(wèn)題的出現(xiàn),全球?qū)⒊掷m(xù)面臨新傳染病突發(fā)和已有傳染病惡化的風(fēng)險(xiǎn)挑戰(zhàn)[1]。在應(yīng)對(duì)傳染病方面,有效的防控策略和疫苗接種仍是阻止傳染病持續(xù)發(fā)展的有力措施。2022年7月8日世界衛(wèi)生組織(WHO)公布全球新型冠狀病毒疫苗候選物名單中,重組蛋白疫苗[包括蛋白亞單位和病毒樣顆粒(VLP)]在臨床階段的和臨床前階段的疫苗候選物中分別占36%和48%。由公布的信息可見(jiàn)重組蛋白疫苗是在研新型冠狀病毒疫苗中個(gè)數(shù)最多的疫苗種類(lèi),值得注意的是除了新型冠狀病毒疫苗外,2020年全球10大疫苗品種中有8個(gè)是重組蛋白疫苗,由此可見(jiàn),重組蛋白疫苗仍是未來(lái)疫苗的研發(fā)重點(diǎn)。

基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念共識(shí),重組蛋白疫苗也應(yīng)像其他生物制品一樣采用先進(jìn)的分析手段,從物理化學(xué)、免疫學(xué)、生物學(xué)等角度進(jìn)行全面的分析,并提供盡可能詳細(xì)的表征信息以反映目標(biāo)產(chǎn)品內(nèi)在的天然質(zhì)量屬性[2]。已有研究顯示,電荷異質(zhì)性和等電點(diǎn)(pI)監(jiān)測(cè)可用于多種不同類(lèi)別疫苗的鑒別和工藝穩(wěn)定性研究。在國(guó)內(nèi)外生物制品的電荷異質(zhì)性研究中,全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳(WCID-CIEF)檢測(cè)pI已廣泛應(yīng)用于單克隆抗體、抗體偶聯(lián)藥物、重組蛋白、疫苗和活病毒等方面,WCID-CIEF與離子交換色譜(IEC)共同作為生物制藥行業(yè)研發(fā)和質(zhì)量控制中分析電荷異質(zhì)性的重要方法。本文擬對(duì)WCID-CIEF的原理和特點(diǎn)及其在重組蛋白疫苗的質(zhì)量控制中的應(yīng)用進(jìn)行概述。

1 重組蛋白疫苗

治療性蛋白質(zhì)的研發(fā)歷史大致如下:一是使用血漿及血漿制品來(lái)治療疾病;二是關(guān)于重組治療性蛋白質(zhì)的研究,例如重組胰島素、生長(zhǎng)因子和單克隆抗體;三是關(guān)于重組蛋白疫苗的研究,即利用重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)抗原代替?zhèn)鹘y(tǒng)的減毒活病毒或者是完全滅活的細(xì)菌或病毒作為疫苗的免疫原[3]。重組蛋白疫苗系指利用基因重組技術(shù)將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因重組到細(xì)菌、酵母或細(xì)胞中后,經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、增殖、提取、純化所表達(dá)的保護(hù)性抗原而制成的疫苗。但由于在體外合成純化,重組蛋白難以保持天然構(gòu)象表位,從而誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)較弱,必要時(shí)需尋找合適的免疫佐劑或是接種多針以達(dá)到免疫效果,此外重組蛋白也有引起抗體免疫增強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)[4]。

2 重組蛋白疫苗的質(zhì)量評(píng)價(jià)

與一般藥品不同,疫苗的用途主要在于預(yù)防疾病,接種人群是健康人群。我國(guó)將疫苗劃分為兩類(lèi),其中第一類(lèi)包括所有國(guó)家級(jí)計(jì)劃免疫疫苗,由政府進(jìn)行管理并免費(fèi)向14歲以下兒童提供,盡管及時(shí)接種第一類(lèi)疫苗并非強(qiáng)制性,但其被視為一項(xiàng)與公眾健康息息相關(guān)的社會(huì)責(zé)任[5-6]。正因疫苗的用途特殊性以及受眾廣泛性,疫苗必須被證明是安全有效和質(zhì)量可控的,政府和公眾對(duì)疫苗的安全與質(zhì)量有著更高的要求和關(guān)注[5-6]。

重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜的生物合成過(guò)程,蛋白質(zhì)產(chǎn)物通常會(huì)表現(xiàn)出異質(zhì)性,并且蛋白質(zhì)大分子自身結(jié)構(gòu)也很復(fù)雜。重組蛋白的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)引入雜質(zhì)及污染物,雜質(zhì)包括宿主細(xì)胞相關(guān)雜質(zhì)、過(guò)程相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì);污染物則主要為熱原、病毒和微生物等。這些潛在的雜質(zhì)和污染顯著影響甚至決定著重組蛋白制品的安全性、質(zhì)量以及效力,需要采取合適的方法對(duì)雜質(zhì)加以控制和消除[7-8]。

3 重組蛋白疫苗的電荷異質(zhì)性

在重組蛋白生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等各個(gè)環(huán)節(jié)中引發(fā)的化學(xué)或物理變化會(huì)引起異質(zhì)體的產(chǎn)生,而異質(zhì)體被定義為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)還是產(chǎn)品變體則取決于與目標(biāo)產(chǎn)品的性質(zhì)是否一致,例如溶解度、體內(nèi)外穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及免疫原性等性質(zhì)[7]。這些物理和化學(xué)變化極大地影響著蛋白產(chǎn)物的表面電荷,化學(xué)變化為共價(jià)變化,包括氨基酸序列變異以及包括糖基化、脫酰胺、氧化和水解等在內(nèi)的各種翻譯后修飾;物理變化則為聚集、沉淀和變性的非共價(jià)變化[7-8]。這些種種變化可綜合表現(xiàn)為重組蛋白的電荷異質(zhì)性,由此產(chǎn)生的不同電荷異構(gòu)體對(duì)重組蛋白制品的生物學(xué)活性、穩(wěn)定性和免疫原性都有不同影響[9-10]。因此在重組蛋白制品的質(zhì)量控制中有必要對(duì)電荷異質(zhì)性加以關(guān)注。

4 電荷異質(zhì)性分析的優(yōu)勢(shì)以及分析方法

4.1電荷異質(zhì)性分析的意義 一方面,電荷異質(zhì)性分析有助于推動(dòng)生產(chǎn)工藝的優(yōu)化,通過(guò)改進(jìn)工藝參數(shù)以減少變異體的產(chǎn)生。另一方面,監(jiān)測(cè)重組蛋白的電荷變異體水平能夠保持產(chǎn)品的批間一致性、反映生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)流程的變化與規(guī)范與否,從而保證重組蛋白產(chǎn)品是安全有效和質(zhì)量可控[7,9]。在生物制藥工業(yè)中,監(jiān)測(cè)、定量分析和表征重組蛋白的電荷異質(zhì)性是生物制藥產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的重要組成部分,需要開(kāi)發(fā)快速穩(wěn)健的電荷異質(zhì)性分析方法以支持的產(chǎn)品釋放和穩(wěn)定性研究以及制劑開(kāi)發(fā)和其他表征研究[11-12]。

4.2電荷異質(zhì)性的分析方法 目前分析生物藥物電荷異質(zhì)性的經(jīng)典方法主要有IEC和等電聚焦法(IEF),可用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)電荷異質(zhì)性以評(píng)估產(chǎn)品的質(zhì)量和批間一致性以及提供蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和純度信息[11-12]?；诿?xì)管電泳的三種技術(shù),毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管等電聚焦電泳(cIEF)以及WCID-CIEF也是分析生物制品電荷異質(zhì)性的重要方法[13]。此外,反相高效液相色譜(RP-HPLC)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[10]等也可用作電荷異質(zhì)性分析的手段。

IEC根據(jù)蛋白分子表面電荷的差異分離蛋白質(zhì)。分離取決于蛋白質(zhì)與固定相的相互作用,離子交換色譜法有鹽梯度分離和pH分離兩種分離模式,其分離度良好[14]。在治療性蛋白質(zhì)表征中,離子交換色譜法可對(duì)不同氨基酸變體、不同糖型修飾、水解或其他修飾的蛋白質(zhì)變體進(jìn)行分離回收,進(jìn)一步聯(lián)合質(zhì)譜細(xì)化表征和鑒別[14-15]。IEC是蛋白質(zhì)分離純化時(shí)去除雜質(zhì)的首選方法,其分析過(guò)程可以維持蛋白藥物原有的空間結(jié)構(gòu),保持藥物的生物學(xué)活性和功能[9],是重組蛋白制品質(zhì)量控制與分析的重要手段。相較于cIEF等技術(shù),IEC方法也存在一些局限性,比如方法開(kāi)發(fā)耗時(shí)、分辨率較低、難以保證變異體的高度分離、不穩(wěn)健且試劑耗材成本高等問(wèn)題[14]。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)根據(jù)分析物的凈電荷和流體動(dòng)力學(xué)半徑進(jìn)行分離,其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速,分辨率也較高。MORITZ等[12]對(duì)毛細(xì)管區(qū)帶電泳用于分析生物制品電荷異質(zhì)性進(jìn)行了評(píng)估,結(jié)果表明毛細(xì)管區(qū)帶電泳可用于分析pI范圍為7.4～9.5的蛋白質(zhì)。

IEF是依據(jù)待測(cè)物pI不同從而在pH梯度中得以分離的一種高分辨率的生物化學(xué)分離技術(shù)[9,16]。傳統(tǒng)的IEF平板凝膠技術(shù),由于操作耗時(shí)復(fù)雜且無(wú)法提供準(zhǔn)確的定量信息,已逐漸被取代。cIEF是以毛細(xì)管作為分離通道進(jìn)行的等電聚焦電泳,其運(yùn)行流程為:將樣品與兩性電解質(zhì)混勻充進(jìn)毛細(xì)管,外加電壓運(yùn)行,兩性電解質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)形成pH梯度,當(dāng)樣品不同組分遷移至相應(yīng)等電點(diǎn)位置時(shí),便停止遷移而產(chǎn)生分離聚焦,被分離樣品遷移至檢測(cè)窗口而被檢測(cè)[13]。相比于傳統(tǒng)凝膠或IEC,cIEF具有可定量分析、分析速度快、操作簡(jiǎn)便、樣品試劑消耗少、分辨率更高和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。但是cIEF在聚焦完成后需要一個(gè)額外的移動(dòng)過(guò)程,把完成分離聚焦的蛋白推動(dòng)到檢測(cè)器進(jìn)行單點(diǎn)檢測(cè),這一過(guò)程會(huì)造成檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)、蛋白可能發(fā)生沉淀、pH梯度失真以及由于移動(dòng)速度不均衡而導(dǎo)致分辨率下降的問(wèn)題[16],從而影響檢測(cè)的重現(xiàn)性。

WCID-CIEF采用的是短毛細(xì)管柱,通過(guò)對(duì)整個(gè)毛細(xì)管柱進(jìn)行實(shí)時(shí)掃描成像,克服了cIEF移動(dòng)檢測(cè)過(guò)程所帶來(lái)的缺點(diǎn),使得檢測(cè)時(shí)間顯著縮短,方法開(kāi)發(fā)時(shí)間也更短。WCID-CIEF的重現(xiàn)性體現(xiàn)在兩個(gè)方面:一是相應(yīng)pI值的柱內(nèi)位置,二是定量的峰高或峰面積。基于實(shí)時(shí)成像檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)和采用pI標(biāo)志物來(lái)定位蛋白質(zhì)峰之間的相對(duì)位置,WCID-CIEF可實(shí)現(xiàn)高重現(xiàn)性且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可控制在0.1%范圍內(nèi)[16]。在檢測(cè)方面,WCID-CIEF檢測(cè)采用通用性強(qiáng)的紫外可見(jiàn)光吸收檢測(cè)器和靈敏度最高的激光誘導(dǎo)熒光成像檢測(cè)器,高靈敏度的熒光成像模式使得WCID-CIEF非常適用于低濃度樣品分析和免疫分析[16]。

WCID-CIEF的毛細(xì)管涂層常采用線(xiàn)性聚丙烯酰胺進(jìn)行化學(xué)涂覆,或是采用氟碳化合物進(jìn)行物理涂覆,氟碳化合物涂覆更堅(jiān)硬,可長(zhǎng)期使用,毛細(xì)管涂層的主要作用是消除電滲流以及減少溶質(zhì)吸附[16-17]。但在實(shí)際過(guò)程運(yùn)行中,毛細(xì)管涂層隨使用次數(shù)的增加會(huì)有磨損導(dǎo)致電滲流增大,而蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)因?yàn)榫哂懈嗟慕Y(jié)合位點(diǎn)更易于發(fā)生不均勻的管壁吸附,造成遷移速率不均勻和檢測(cè)峰變化[18]。

綜上所述,各種分析方法在分析蛋白的電荷異質(zhì)性方面各有優(yōu)勢(shì),在具體分析時(shí)應(yīng)根據(jù)需求選擇合適的方法,也可采用不同方法進(jìn)行相互驗(yàn)證以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性?？紤]到方法開(kāi)發(fā)快速、操作簡(jiǎn)便、可自動(dòng)化以及高分辨率的需求,WCID-CIEF與CZE比IEC更具優(yōu)勢(shì),但只有WCID-CIEF才能提供準(zhǔn)確精密的pI值測(cè)定[19]。一般而言,CZE的電泳遷移率值可應(yīng)用于生物表征分析以及在純化過(guò)程中監(jiān)測(cè)蛋白純度,而WCID-CIEF提供的蛋白pI值和峰形可以用作生化指紋用以證明生物產(chǎn)品的一致性,可用于蛋白鑒別、穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)以及蛋白表征[15]。以下部分將主要對(duì)WCID-CIEF在不同重組蛋白質(zhì)疫苗的質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

5 WCID-CIEF在重組蛋白疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

5.1人乳頭瘤病毒(HPV)樣顆粒(HPV-VLP)疫苗 HPV屬于DNA病毒,其基因組長(zhǎng)度約為7～8 kb,主要可分為編碼不同蛋白的早期區(qū)、晚期區(qū)和非編碼區(qū),其中病毒的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白L1和L2主要由晚期區(qū)基因所編碼。病毒顆粒中L2含量少,但對(duì)病毒的組裝和感染具有重要作用。5個(gè)L1即可構(gòu)成五聚體的基本結(jié)構(gòu),72個(gè)五聚體進(jìn)一步組裝成二十面體的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu),也稱(chēng)之為VLP,基于L1的VLP是目前上市的預(yù)防性疫苗的主要抗原成分[20-21]。

ZHOU等[22]首次利用了WCID-CIEF測(cè)定了10種類(lèi)型的重組HPV-VLP(16L1、18L1、6L1、11L1、58L1、31L1、33L1、45L1、52L1和58L1)的pI值,并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終檢測(cè)條件為:(1)兩性電解質(zhì)使用4% Pharmalyte pH 3～10;(2)2 mol/L尿素作為穩(wěn)定劑;(3)最佳HPV-VLP檢測(cè)濃度為0.2 mg/mL;(4)甲基纖維素最佳濃度分別為0.35%和1.00%;(5)最佳鹽濃度為5 mmol/L NaCl;(6)聚焦時(shí)間為1 500 V 1 min和3 000 V 3 min。經(jīng)過(guò)方法驗(yàn)證,該方法具有良好的重現(xiàn)性和分辨率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10種重組HPV-VLP的實(shí)測(cè)pI值與理論pI值相差在0.05～0.95之間。一般來(lái)說(shuō)結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)的理論pI與實(shí)測(cè)pI差值一般在0.5以?xún)?nèi),但VLP結(jié)構(gòu)復(fù)雜且相對(duì)分子質(zhì)量高達(dá)千萬(wàn)級(jí),因此實(shí)測(cè)pI的波動(dòng)范圍也就更大。雖然如此,WCID-CIEF獲得的pI值和指紋圖譜仍有希望應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制中的表征、鑒定和放行以及疫苗的穩(wěn)定性研究等。

ZHOU等[22]同時(shí)采用WCID-CIEF對(duì)解聚組裝前后的VLP進(jìn)行了pI測(cè)定,結(jié)果顯示解聚重組裝過(guò)程會(huì)導(dǎo)致HPV-VLP實(shí)際pI值發(fā)生變化。這也為在純化過(guò)程中采用解聚重組裝工藝以獲得結(jié)構(gòu)均一VLP提供了依據(jù)[23]。MACH等[24]也發(fā)現(xiàn)在酵母系統(tǒng)中表達(dá)的HPV L1蛋白形成的VLP顆粒與基因型相關(guān),HPV 18L1蛋白傾向于組裝形成均勻的直徑為60 nm的VLP,其穩(wěn)定性更好,而HPV 6、11和16L1蛋白傾向于形成直徑為30～50 nm的不規(guī)則顆粒,研究顯示這類(lèi)HPV-VLP具有免疫原性,并且相對(duì)于18型VLP保質(zhì)期更短,通過(guò)調(diào)整離子濃度與pH的方法,使得這類(lèi)HPV-VLP解聚后自發(fā)組裝成均勻的60 nm VLP,改善了免疫原性與穩(wěn)定性。

5.2諾如病毒(NoV)樣顆粒(NoV-VLP)疫苗 NoV是具有高度傳染性的RNA病毒,嬰幼兒、老年人與免疫功能低下者易感染,引起嚴(yán)重腹瀉或急性腸胃炎,死亡率高。NoV基因組全長(zhǎng)約7.6 kb,可分為3個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF),其中ORF2編碼病毒的主要衣殼蛋白VP1,目前人諾如病毒(HuNoV)的基因分型主要也是依據(jù)ORF2的序列不同而分,NoV不同基因組之間常發(fā)生重組而產(chǎn)生新的變體,變異性高,因此開(kāi)發(fā)多價(jià)疫苗更能有效預(yù)防疾病發(fā)生[25-26]。已有研究發(fā)現(xiàn),重組NoV的主要衣殼蛋白VP1可在某些表達(dá)系統(tǒng)中可自組裝成為VLP,基于此研發(fā)了NoV-VLP疫苗。

GOODRIDGE等[27]于2004年提出采用靈敏度更高、更快捷的WCID-CIEF檢測(cè)病毒的pI值來(lái)代替常規(guī)電子顯微鏡以及PCR法診斷疾病。該實(shí)驗(yàn)采用了高純度的VLP以及試劑,證明了WCID-CIEF具有檢測(cè)NoV-VLP的能力。研究結(jié)果表明,即使在同一基因組內(nèi),不同基因型的NoV-VLP的實(shí)測(cè)pI值與理論pI值差異的變異范圍也很大(0.1～1.7)。在最近的一項(xiàng)研究中,DU等[26]也采用WCID-CIEF檢測(cè)了構(gòu)成候選多價(jià)疫苗的四個(gè)不同基因組和基因型的HuNoV-VLP(GⅠ.1、GⅡ.3、GⅡ.4 和GⅡ.17),使用8 M尿素將VLP分解為單體VP1蛋白以進(jìn)行電泳指紋圖譜分析。結(jié)果顯示體外表達(dá)的VP1蛋白經(jīng)翻譯后修飾具有豐富的電荷異質(zhì)性,不同的基因組和基因型的病毒顆粒具有顯著不同的可重現(xiàn)的譜圖特征,并且過(guò)期HuNoV VLP的指紋圖譜發(fā)生了顯著變化。以上研究均支持將WCID-CIEF作為一項(xiàng)新的檢測(cè)手段,用于NoV及VLP疫苗的檢測(cè)、鑒別以及穩(wěn)定性研究,以消除遺傳多樣性對(duì)NoV檢測(cè)的遺傳或免疫學(xué)方法的阻礙。

5.3腸病毒71型病毒樣顆粒(EV71-VLP)疫苗 腸病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒,是手足口病的主要致病病原體之一,感染后常并發(fā)神經(jīng)功能障礙,5歲以下幼兒易感染而引發(fā)嚴(yán)重疾病甚至有可能導(dǎo)致死亡[28]。EV71直徑在25 nm左右,形狀為20面體,擁有約7 500個(gè)核苷酸的單鏈RNA基因組,由一個(gè)單鏈開(kāi)放閱讀框(ORF)組成,ORF可被分為P1、P2和P3區(qū)并表達(dá)為一個(gè)大的多聚蛋白可,其中P1區(qū)編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1～4。水解酶3D將多聚蛋白水解成VP0、VP1、VP3,這3種結(jié)構(gòu)蛋白可自發(fā)組裝形成晶體病毒樣顆粒。其中VP0在病毒衣殼蛋白與病毒核酸組裝形成新病毒顆粒后被誘導(dǎo)加工為VP2和VP4[28-29]。

王文偉等[30]建立了一種采用WCID-CIEF測(cè)定重組人EV71-VLP等電點(diǎn)的方法,主要對(duì)聚焦時(shí)間以及尿素濃度進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。最終選擇不添加尿素以及聚焦時(shí)間為1 500 V 1 min和3 000 V 5 min。方法經(jīng)驗(yàn)證,專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性和中間精密度均良好,重組人EV71-VLP的實(shí)測(cè) pI 值為6.46,與理論 pI(6.08)相差 0.38,基本一致。表明該方法可作為EV71-VLP疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效手段。

5.4乙型肝炎病毒(HBV)疫苗 HBV是傳染性強(qiáng)的DNA病毒,持續(xù)攜帶病毒者會(huì)有發(fā)展為慢性肝病、肝硬化和肝癌的可能。HBV是直徑為42 nm的包封球體,表面抗原嵌在磷脂包膜上,遺傳物質(zhì)被核衣殼蛋白包裹在磷脂膜內(nèi),其基因組長(zhǎng)度為3.2 kb。1986年世界上第一種人用重組亞單位HBV疫苗被批準(zhǔn)使用,重組HBV疫苗的主要抗原成分是HBsAg,一種堿性脂質(zhì)結(jié)合表面蛋白,在酵母表達(dá)系統(tǒng)中,約100個(gè)HBV表面抗原(HBsAg)可自組裝成一個(gè)直徑為22 nm的VLP[15,31]。

RUSTANDI等[15]于2014年首次使用成像毛細(xì)管等電聚焦電泳來(lái)表征HBsAg產(chǎn)品。HBsAg的理論pI為8.2,但由于磷脂的存在(約占20%),實(shí)測(cè)pI值會(huì)偏小,預(yù)測(cè)的實(shí)測(cè)值會(huì)接近2.6。該研究通過(guò)添加酸性阻滯劑磷酸以及改變阻滯劑濃度、調(diào)整兩性電解質(zhì)比例和聚焦時(shí)間來(lái)優(yōu)化方法,最終確定的條件為:12 mmol/L H3PO4作為酸性阻滯劑;兩性電解質(zhì)組合為Servalyt 2-4、Servalyt 4-7和Pharmalyste 2.5-5;尿素終濃度為6 mol/L;pI標(biāo)志物分別為3.59、4.65。后續(xù)該方法又被用來(lái)表征HBsAg-VLP參比標(biāo)準(zhǔn)品在3種不同配方緩沖液中經(jīng)過(guò)多次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性,選出了可提供最佳穩(wěn)定性的配方,并將結(jié)果與毛細(xì)管區(qū)帶電泳所得結(jié)果對(duì)比,結(jié)果一致。

5.5嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)蛋白亞單位疫苗 2019年末全球爆發(fā)一種未知冠狀病毒感染導(dǎo)致的嚴(yán)重呼吸道傳染疾病,后該病毒病原體被命名為SARS-CoV-2,是第7種可感染人類(lèi)的冠狀病毒,為單股正鏈RNA包膜病毒[32-33]。冠狀病毒表面暴露的跨膜結(jié)構(gòu)S糖蛋白介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞。S蛋白為同源三聚體,包含兩個(gè)功能亞單位S1和S2。S1暴露在外并含有受體結(jié)合域(RBD),RBD可結(jié)合靶細(xì)胞上表達(dá)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)受體。S2錨定在病毒內(nèi),可促進(jìn)病毒與細(xì)胞的融合[32,34-35]。SARS-CoV-2的S蛋白大小為180×103～200×103,總長(zhǎng)度在1 273～1 300個(gè)氨基酸之間[36]。S蛋白是治療病毒感染疾病時(shí)藥物開(kāi)發(fā)和疫苗設(shè)計(jì)的重要蛋白。針對(duì)SARS-CoV-2所開(kāi)發(fā)的疫苗有病毒載體疫苗、核酸疫苗、滅活疫苗以及以S蛋白和RBD為抗原的重組亞單位疫苗。如前所述,重組蛋白疫苗占比超過(guò)1/3。

FINJA 等[37]采用WCID-CIEF測(cè)定了幾種商業(yè)化的SARS-CoV-2相關(guān)蛋白的pI值,包括帶有His和Fc標(biāo)記的RBD、帶有His標(biāo)記的S1亞基、帶有His標(biāo)記的S1/S2亞單位。研究結(jié)果顯示,雖然由于異構(gòu)體的存在導(dǎo)致每個(gè)蛋白顯示出多個(gè)峰形,但是其pI的實(shí)驗(yàn)測(cè)定范圍都能覆蓋理論pI值。本實(shí)驗(yàn)室最近也利用WCID-CIEF技術(shù)對(duì)一種基于RBD三聚體的候選SARS-CoV-2疫苗進(jìn)行了電荷異質(zhì)性分析[38]。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,充分展示了三聚體RBD天然形態(tài)的電泳指紋圖譜,并且通過(guò)不同批次、加熱穩(wěn)定性、不同酸堿條件、不同氧化程度的研究,證明WCID-CIEF指紋圖譜可用于鑒定、批次間一致性評(píng)估,以及該候選疫苗的穩(wěn)定性研究,作為質(zhì)量控制策略的一部分。除此之外,pI的應(yīng)用也可以對(duì)SARS-CoV-2不同變異株進(jìn)行定性鑒別[39]。

6 總 結(jié)

管壁吸附和聚焦不穩(wěn)定影響檢測(cè)重復(fù)性是限制毛細(xì)管電泳技術(shù)擴(kuò)大應(yīng)用范圍的主要問(wèn)題,對(duì)疫苗來(lái)說(shuō)尤其如此,因?yàn)橐呙绲目乖煞指鼮閺?fù)雜,不同的疫苗種類(lèi)所涉及的成分結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性也各不相同。盡管如此,毛細(xì)管電泳技術(shù)在微生物和疫苗領(lǐng)域的研究一直在繼續(xù),在產(chǎn)品表征、生產(chǎn)過(guò)程控制和質(zhì)量監(jiān)測(cè)方面毛細(xì)管電泳技術(shù)得到了越來(lái)越多的應(yīng)用[40-42]。目前重組蛋白疫苗的研發(fā)在我國(guó)仍處于發(fā)展早期,相關(guān)研發(fā)和質(zhì)量控制技術(shù)仍需積極跟進(jìn)國(guó)際先進(jìn)水平。一方面,在研發(fā)初期,應(yīng)結(jié)合多種方法對(duì)蛋白疫苗電荷變異體逐步進(jìn)行完整的分離鑒定和表征,嚴(yán)格評(píng)估變異體與主成分的性質(zhì)是否一致,以及變化的影響程度以及免疫原性等,以確定變異體是否作為雜質(zhì)處理控制。另一方面,在質(zhì)量控制階段,采取自動(dòng)化、快速和高分辨率的方法來(lái)監(jiān)測(cè)產(chǎn)品的生產(chǎn)一致性和穩(wěn)定性更加合適。成像毛細(xì)管等電聚焦電泳提供的疫苗蛋白pI值和峰形的生化指紋有助于對(duì)疫苗的多種蛋白成分進(jìn)行定性分析,熒光檢測(cè)模式也有助于對(duì)低濃度蛋白進(jìn)行分離分析。此外,成像毛細(xì)管等電聚焦電泳所具有的高分辨率和高靈敏度優(yōu)勢(shì)是液相色譜所沒(méi)有的,將其與質(zhì)譜進(jìn)行聯(lián)用來(lái)進(jìn)一步分析蛋白的電荷異質(zhì)性一直是毛細(xì)管電泳研究的熱門(mén)方向,微芯片技術(shù)解決了成像毛細(xì)管等電聚焦電泳與質(zhì)譜相連分辨率變差的問(wèn)題[43]?；诔上衩?xì)管等電聚焦電泳的以上優(yōu)勢(shì)以及與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展,WCID-CIEF在重組蛋白疫苗電荷異質(zhì)性研究方面具有良好的應(yīng)用前景。