二代測(cè)序技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)展*

唐 薇 綜述,侯玉磊,陳 輝 審校

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 400016

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)最新發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告,惡性腫瘤仍是人類70歲之前最常見(jiàn)的死因[1]。目前腫瘤的傳統(tǒng)治療手段包括手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療等。手術(shù)切除對(duì)于腫瘤晚期特別是伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者并不適用,傳統(tǒng)的放射治療和化學(xué)治療雖適用于大多數(shù)腫瘤,但其不良反應(yīng)會(huì)給患者帶來(lái)傷害[2-3]。此外,由于腫瘤的異質(zhì)性,并非所有腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)的放化療都具有相同的敏感性,未被有效清除的癌細(xì)胞是癌癥復(fù)發(fā)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。腫瘤異質(zhì)性是指同一種惡性腫瘤在不同患者個(gè)體間或者同一患者體內(nèi)不同部位的腫瘤組織中存在不同類型的亞克隆細(xì)胞,它們?cè)诜只潭?、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及對(duì)藥物的反應(yīng)性等方面均有差異[4]。腫瘤的異質(zhì)性給腫瘤的治療帶來(lái)巨大困擾,為了能針對(duì)性制訂臨床治療方案,有效提升臨床治療效果,需要對(duì)腫瘤異質(zhì)性的生物學(xué)特性進(jìn)行深入了解。

基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變與腫瘤異質(zhì)性的發(fā)生密切相關(guān),近年來(lái),基因測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展,使臨床醫(yī)生對(duì)腫瘤在分子生物學(xué)層面上的認(rèn)識(shí)得到突破性提高[5-8]。二代測(cè)序技術(shù)(NGS)的出現(xiàn),解決了原有基因測(cè)序技術(shù)通量低、成本高等問(wèn)題,加快了研究者們探索腫瘤異質(zhì)性的腳步,為腫瘤患者制訂個(gè)體化治療方案、篩選靶向藥物等奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本文將對(duì)NGS及其在常見(jiàn)惡性腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NGS

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們對(duì)疾病的研究逐漸聚焦于全基因組方向。測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn),為人們深入探索基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了有力手段。傳統(tǒng)的分子診斷方法,如免疫組織化學(xué)檢測(cè)(IHC)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和熒光原位雜交檢測(cè)(FISH)等,由于檢測(cè)應(yīng)用范圍窄、通量低、數(shù)據(jù)產(chǎn)出低、時(shí)間成本高、樣本需求量大等自身局限性,影響臨床診療的使用效率[9-10]。

NGS又稱高通量測(cè)序、大規(guī)模平行測(cè)序,是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來(lái)的DNA測(cè)序技術(shù)。相較于采用合成終止測(cè)序的一代測(cè)序技術(shù),NGS引入了可逆終止末端,實(shí)現(xiàn)了邊合成邊測(cè)序,可以同時(shí)讀取數(shù)以千計(jì)DNA片段,極大地提升了檢測(cè)效率。NGS的基本原理是在DNA片段擴(kuò)增時(shí),從中捕捉新添加的堿基所攜帶的熒光信號(hào),進(jìn)而確定DNA的序列[9]。NGS解決了一代測(cè)序技術(shù)存在的耗時(shí)長(zhǎng)、通量低等問(wèn)題,使基因檢測(cè)的效率得到大幅提升,被廣泛運(yùn)用于生命科學(xué)的研究中[9]。

近年來(lái)有研究顯示,NGS在惡性腫瘤的研究與臨床應(yīng)用中,通過(guò)對(duì)腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行篩查,可以發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)的基因突變以及融合基因等異常,從中挖掘治療靶點(diǎn),選擇靶向藥物,并追蹤患者在治療過(guò)程中腫瘤的演變特征,甚至能夠?qū)颊叩念A(yù)后及復(fù)發(fā)率進(jìn)行評(píng)估[7-8,11-12]。本文將圍繞NGS在常見(jiàn)惡性腫瘤治療中的應(yīng)用及進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 NGS在惡性腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)展

2.1乳腺癌 乳腺癌是女性患者最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤,是45歲以下女性惡性腫瘤死亡的首要原因[1]。乳腺癌具有高度腫瘤異質(zhì)性,發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究者們運(yùn)用對(duì)乳腺癌基因組和分子生物學(xué)方面的知識(shí),發(fā)現(xiàn)了篩查乳腺癌的生物標(biāo)志物,研發(fā)出基于基因突變位點(diǎn)的靶向治療藥物[13]。因此,應(yīng)用NGS對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行基因測(cè)序,可以協(xié)助臨床醫(yī)生進(jìn)行乳腺癌的早期篩查、針對(duì)性制訂和調(diào)整治療方案。

NGS的出現(xiàn)為大規(guī)模篩查乳腺癌關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因提供了更便捷的手段?；贜GS的全面基因組測(cè)序(CGP)技術(shù)可涵蓋具有臨床價(jià)值的基因,在基因變異檢測(cè)上具有較高的敏感性,能夠非常準(zhǔn)確地呈現(xiàn)測(cè)序結(jié)果[14]。ROSS等[14]利用CGP技術(shù)對(duì)8 654例乳腺癌患者的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,80.4%患者至少有1條信號(hào)通路發(fā)生基因突變,超過(guò)一半的患者可能由于基因突變而對(duì)特定的信號(hào)通路抑制劑敏感。利用CGP技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)特定靶基因的改變,臨床可通過(guò)這些改變預(yù)測(cè)患者對(duì)特定治療方法的敏感性;通過(guò)NGS篩查關(guān)鍵信號(hào)通路是否突變,從而有針對(duì)性地制訂個(gè)體化治療方案。

有研究表明,循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)可對(duì)乳腺癌患者在新輔助化療(NAC)中的反應(yīng)和預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)[15-17]。但早期患者血液中的ctDNA水平通常較低,常規(guī)檢測(cè)方法會(huì)受到一定限制,NGS具有高敏感、樣本消耗少等優(yōu)點(diǎn),運(yùn)用NGS檢測(cè)ctDNA,在提示早期乳腺癌患者根治性術(shù)后存在微小殘留病灶(MRD),以及預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)等方面均顯示出較好的臨床應(yīng)用價(jià)值[18]。MAGBANUA等[17]從84例高危早期乳腺癌患者在不同治療時(shí)期采集的血液中提取出游離DNA,通過(guò)NGS檢測(cè)治療前后患者的血液中ctDNA的變化。結(jié)果表明,ctDNA清除不足是治療效果不佳和腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的顯著預(yù)測(cè)因素。由此可見(jiàn),ctDNA測(cè)序結(jié)果是乳腺癌NAC療效和轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)的重要預(yù)測(cè)因子,在患者NAC期間對(duì)其ctDNA水平變化進(jìn)行監(jiān)測(cè),有助于實(shí)時(shí)評(píng)估治療反應(yīng),及時(shí)改善治療方案。

綜上所述,NGS在乳腺癌的篩查、個(gè)體化治療等方面發(fā)揮了巨大作用。

2.2肺癌 肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因,也是男性患者中最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。根據(jù)病理組織學(xué)可將肺癌大致分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)兩大類[19],其中NSCLC約占80%～85%。作為一種異質(zhì)性疾病,肺癌的病變過(guò)程與基因組的改變緊密相關(guān)。其中,表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡信號(hào)通路的改變是NSCLC發(fā)生的重要原因。有研究表明,EGFR突變是NSCLC已知的治療靶點(diǎn),19號(hào)外顯子的缺失突變和21號(hào)外顯子的點(diǎn)突變是最常見(jiàn)的突變類型,約占EGFR突變類型的85%以上[20],因此,臨床可以通過(guò)檢測(cè)EGFR的突變預(yù)測(cè)NSCLC患者對(duì)靶向藥物的反應(yīng)性。對(duì)EGFR突變的檢測(cè),早前常依賴于一代測(cè)序,雖然它能夠檢測(cè)特定基因組區(qū)域內(nèi)的所有突變,但當(dāng)樣本中腫瘤細(xì)胞富集不足時(shí),存在較大假陰性風(fēng)險(xiǎn)[21]。突變特異性PCR試劑盒雖能檢測(cè)腫瘤細(xì)胞含量低至1%～5%的樣本[22],但目前可用的PCR試劑盒不能充分覆蓋EGFR突變類型[23-24],可能會(huì)遺漏潛在的可用于指導(dǎo)選擇靶向藥物的EGFR位點(diǎn)改變。

隨著NGS的出現(xiàn),EGFR罕見(jiàn)突變的檢出率也逐步提高。作為一種高靈敏的技術(shù),NGS可對(duì)罕見(jiàn)基因突變進(jìn)行分子評(píng)估,還能從不同患者的樣本中檢測(cè)到多個(gè)熱點(diǎn)基因,具有更高的診斷準(zhǔn)確性,且節(jié)省了樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間[24]。目前,常用的NGS檢測(cè)組合已能同時(shí)分析包括EGFR在內(nèi)的大量與臨床相關(guān)的熱點(diǎn)基因[25]。

EML4-ALK融合基因是NSCLC靶向治療的重要靶點(diǎn)[26]。ALK抑制劑可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。最初對(duì)ALK基因重排檢測(cè)依賴于FISH技術(shù),但該方法較為復(fù)雜,對(duì)標(biāo)本質(zhì)量和設(shè)備要求高,目前正逐步選用其他方法補(bǔ)充或替代FISH技術(shù)?；贜GS所設(shè)計(jì)的專門(mén)用于檢測(cè)融合基因的方法,還可以進(jìn)行更為復(fù)雜的基因重排分析,在實(shí)際應(yīng)用中展現(xiàn)出良好的性能[27]。

此外,KRAS、BRAF、NTRK等是NSCLC中變異率相對(duì)較低的驅(qū)動(dòng)基因。針對(duì)這些基因變異的靶向藥物仍處于前瞻性臨床研究階段。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不能完全覆蓋上述基因的突變類型,而基于NGS的檢測(cè)可以滿足相關(guān)需求。

隨著NGS在肺癌診療中的應(yīng)用,會(huì)極大促進(jìn)了肺癌分子生物學(xué)研究,同時(shí)為患者在診斷、用藥指導(dǎo)等方面提供強(qiáng)有力的支持。

2.3結(jié)直腸癌(CRC) CRC是世界第三大常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。CRC的主要治療方式為手術(shù)切除,但對(duì)于中晚期患者來(lái)說(shuō),往往需要加入常規(guī)化療或靶向藥物治療。NGS技術(shù)為CRC的靶向藥物選擇提供了實(shí)驗(yàn)室支撐。利用NGS檢測(cè)CRC患者中KRAS/NRAS/BRAF的突變,得到了美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)發(fā)布的《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》的推薦:所有轉(zhuǎn)移性CRC患者均應(yīng)進(jìn)行RAS和BRAF突變的基因分型,可以單獨(dú)檢測(cè),也可以作為NGS檢測(cè)組合的一部分進(jìn)行檢測(cè)[28]。

靶向治療和常規(guī)化學(xué)治療產(chǎn)生藥物耐受的重要機(jī)制之一是腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(ITH)。研究者們對(duì)NGS測(cè)得的核苷酸序列進(jìn)行深入分析,結(jié)合突變-等位基因腫瘤異質(zhì)性(MATH)評(píng)分來(lái)衡量ITH的程度,為CRC治療方案提供指導(dǎo)[29]。GREENBAUM等[30]通過(guò)NGS對(duì)超過(guò)400個(gè)癌癥相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè),分析直腸癌患者M(jìn)ATH得分與NAC治療效果之間的關(guān)系。結(jié)果表明,MATH得分與NAC療效成反比,分?jǐn)?shù)越高則療效越差。因此,利用NGS結(jié)合MATH評(píng)分來(lái)對(duì)ITH程度進(jìn)行評(píng)估,有利于為患者選擇恰當(dāng)?shù)闹委煼桨浮?/p>

微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性(MSI-H)常用來(lái)判斷CRC的化療效果以及預(yù)后評(píng)估。但反映MSI狀態(tài)的DNA序列在腫瘤組織中含量很低,NGS在MSI的檢測(cè)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì),該技術(shù)可一次性捕獲多段基因組序列,在對(duì)腫瘤進(jìn)行基因分型、檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因變異的同時(shí),完成對(duì)MSI的狀態(tài)評(píng)估,極大地提高了低含量樣本的分子診斷效率。此外,基于ctDNA的MSI-NGS也逐步應(yīng)用到臨床,為病理組織取樣困難的患者提供更多選擇[31]。隨著NGS在CRC臨床應(yīng)用中的拓展,將有助于CRC的早期診斷、治療、判斷療效及預(yù)后評(píng)估。

2.4白血病 白血病是一組具有異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,以造血干細(xì)胞惡性增殖,引起白血病細(xì)胞浸潤(rùn)組織器官為特征,繼而影響人體正常造血功能?；瘜W(xué)治療和造血干細(xì)胞移植是白血病常用的治療手段,近年來(lái),NGS逐步在白血病分子靶向治療藥物的研發(fā)和選擇中起到指導(dǎo)作用[32-34]。

急性髓系白血病(AML)是正常髓系造血干細(xì)胞基因突變所致,在成人急性白血病中多見(jiàn)。由于測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步,研究者們得以更深入地了解AML的基因突變情況,NGS的出現(xiàn)為AML的分型、治療方案選擇、預(yù)后評(píng)估等方面提供了重要幫助[35]。白血病細(xì)胞存在成百上千種基因突變類型,但只有少數(shù)關(guān)鍵基因突變會(huì)導(dǎo)致AML發(fā)生。通過(guò)NGS篩選出的AML相關(guān)突變基因包括NPM1、RUNX1、FLT3、TP53、IDH1/2、ASXL1等,已被歐洲白血病網(wǎng)納入為AML的治療靶點(diǎn)[36]。選擇基于這些靶點(diǎn)研發(fā)的分子靶向藥物進(jìn)行治療能提高AML患者的療效。例如二代FLT3激酶抑制劑喹扎替尼,臨床試驗(yàn)表明,它對(duì)難治性AML療效確切,完全緩解率可達(dá)44%,目前該藥聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療方案仍處于試驗(yàn)階段,有望成為合并FLT3突變的AML患者的較好選擇[37];針對(duì)IDH1/2突變的靶向藥物恩西地平和艾伏尼布在治療IDH1/2突變的初發(fā)AML的研究中也已取得顯著成果[37]。同樣,包括FLT3抑制劑、IDH抑制劑、RUNX1抑制劑等在內(nèi)的AML治療藥物的選擇,都可通過(guò)NGS來(lái)提供實(shí)驗(yàn)室支撐。

NGS在急性淋巴系白血病(ALL)的靶向藥物選擇方面也提供了較大幫助。融合基因的產(chǎn)生是ALL最常見(jiàn)的基因突變類型[38]。針對(duì)BCR-ABL融合基因的TKIs(伊馬替尼、泊那替尼)和JAK抑制劑(盧克替尼)等已被證實(shí)對(duì)存在BCR-ABL突變或Ph+的ALL患者具有療效[32]。NGS在大型基因檢測(cè)中的應(yīng)用能較全面地識(shí)別ALL患者的基因突變情況,為尋找潛在治療靶點(diǎn)帶來(lái)更多可能,也為ALL治療方案的選擇指明方向。

MRD指腫瘤患者經(jīng)過(guò)治療后體內(nèi)仍殘留少量腫瘤細(xì)胞,是對(duì)患者療效和預(yù)后進(jìn)行評(píng)估的重要指標(biāo),快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)MRD是白血病治療過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[39]。常規(guī)檢測(cè)MRD多利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-qPCR)[40],但有研究表明,NGS在該項(xiàng)檢測(cè)中靈敏度更高[34]。KOTROVA等[41]對(duì)76例患者分別通過(guò)NGS和RT-qPCR檢測(cè)得到的MRD結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)NGS能夠更精確地預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)率,還能夠提供關(guān)于B淋巴細(xì)胞重排等信息。雖然NGS還尚未常規(guī)用于MRD的檢測(cè),但此技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值已獲得國(guó)內(nèi)外專家的認(rèn)可[42]。

可以預(yù)見(jiàn),隨著NGS應(yīng)用的拓展,白血病的治療前景也將愈加廣闊。

2.5其他腫瘤 此外,NGS技術(shù)在多種惡性腫瘤的治療中都發(fā)揮著作用。85%的鼻咽癌患者均存在EGFR高表達(dá)[43],NGS在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制的研究和靶向治療藥物的選擇上能提供有力支持。前列腺癌是男性第二高發(fā)癌癥[1],利用NGS對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行深度測(cè)序,可以更加清晰地闡明影響前列腺腫瘤發(fā)生的機(jī)制,加深人們對(duì)前列腺癌生物學(xué)特性理解[44],為治療方案的選擇提供參考。甲狀腺癌是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤,BRAF突變使甲狀腺結(jié)節(jié)惡性風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)99.8%,針對(duì)甲狀腺癌的分子檢測(cè)已從單基因BRAF檢測(cè)發(fā)展到多基因多位點(diǎn)變異分析,NGS可以更全面、高效地檢測(cè)到基因突變類型,為甲狀腺癌相關(guān)基因譜的完善做出貢獻(xiàn)[45]。

無(wú)論是探索疾病的發(fā)病機(jī)制還是尋找更精確的治療靶點(diǎn),都離不開(kāi)對(duì)突變基因進(jìn)行深入分析,NGS作為一種高效、靈敏且全面的檢測(cè)方法,在其中的作用越來(lái)越明晰。

3 總結(jié)與展望

隨著NGS在科學(xué)研究和臨床診療中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛,人們可以更高效地獲取腫瘤細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)水平等遺傳信息,有利于腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究;還能更全面地檢測(cè)目標(biāo)基因的變異,為靶向藥物的研發(fā)和選擇提供巨大的支持。但是,NGS對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求較高,中小型醫(yī)院一般不具備開(kāi)展NGS檢測(cè)的條件,此外,該技術(shù)的應(yīng)用必將產(chǎn)生大量的生物信息數(shù)據(jù),對(duì)患者的個(gè)人隱私也會(huì)造成一定威脅。不過(guò)筆者仍然相信,隨著科技與經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、政策的不斷完善,NGS在惡性腫瘤治療中的創(chuàng)造的價(jià)值會(huì)更加璀璨。