唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白凝集素6的生物信息學(xué)分析及多克隆抗體制備

王晨陽,徐 鵬,魏墨林,張 瑋,曹海濤

1.中國人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,河北保定 071000;2.中國人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院衛(wèi)勤處,河北保定 071000;3.保定市人民醫(yī)院健康管理中心,河北保定 071000;4.中國人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院門診部,河北保定 071000

唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白凝集素(Siglec)一般是在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上表達(dá)[1],由于其唾液酸配體的特異性,Siglecs呈現(xiàn)多樣化的特性,并且,表達(dá)在天然免疫細(xì)胞上的Siglecs大多數(shù)都是抑制性受體,通過對有關(guān)損傷模式分子(DAMPs)和病原體的相關(guān)模式分子(PAMPs)的調(diào)控來影響炎癥反應(yīng),這個分子譜系含有許多與黏附及吞噬有關(guān)的分子,以及與含有DAP12轉(zhuǎn)換子的酪氨酸依賴性活化基序(ITAM)相關(guān)受體,Siglecs可以通過連接表達(dá)在同樣細(xì)胞上的順式配體和對唾液酸糖結(jié)合物衍生的病原體起反應(yīng),從而發(fā)揮抑制免疫細(xì)胞的功效[2]。它們可以幫助維持B淋巴細(xì)胞的耐受能力,并對常規(guī)DC前體和類漿細(xì)胞的DC前體前體的激活進(jìn)行調(diào)控[3],通過直接或間接的方式調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能[4],Siglecs通過影響免疫系統(tǒng)中的每一個細(xì)胞來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),與健康和疾病是密切相關(guān)的。

對于Siglec-6的基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能,目前國內(nèi)外所知甚少。本文通過對Siglec-6結(jié)構(gòu)、基本物理化學(xué)性質(zhì)、功能分類和抗原表位的分析,提出了一種新型的多肽抗原免疫新西蘭兔方法,為進(jìn)一步研究Siglec-6創(chuàng)造條件,生產(chǎn)出 Siglec-6蛋白的多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1主要材料來源 新西蘭兔(2 kg,購自從軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的動物中心);血藍(lán)蛋白(KLH)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、戊二醛(購自西格瑪公司),弗氏全佐劑和不全佐劑;牛血清清蛋白(BSA)、甘氨酸(Glycine)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(Vector公司);抗體親和層析試劑盒(PIERCE公司);本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建生產(chǎn)TK-4T1融合蛋白;預(yù)染蛋白相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)試劑采購自德國Fermentas公司(MBI);PVDF膜(德國Schleicher &Schuell公司);化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)從PIERCE公司采購。

1.2生物信息分析過程 登錄NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),利用“protein blast”方法對Siglec-6序列(NP_001236)進(jìn)行同源性檢索。采用Geneious軟件和Lasergene軟件分別對Siglec-6的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、抗原特異性、親疏水性、與其他分子的結(jié)合位點(diǎn)、氨基酸組成的負(fù)荷帶電屬性等物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析;用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast分析及Geneious軟件進(jìn)行同源性比較;用Lasergene軟件對Siglec-6蛋白進(jìn)行功能和分類預(yù)測。

1.3Siglec-6的設(shè)計與免疫原及包被原的合成 Siglec-6位于人類第19號染色體19q13.3上,本文根據(jù)同源性、抗原性、親疏水性等因素進(jìn)行分析,分別設(shè)計了位于N端和C端的兩個多肽,多肽合成和純化由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司采用固相多肽合成法合成,經(jīng)質(zhì)譜鑒定和高效液相色譜(HPLC)純化,純度為98.0%。

1.4Siglec-6多克隆抗體的制備及純化 取200 μg的多肽免疫原,用0.9%的NaCl注射液稀釋至200～500 μL,然后添加等體積弗氏佐劑(初次免疫用弗氏全佐劑,加強(qiáng)免疫用弗氏不全佐劑),將溶液和佐劑用混合設(shè)備混合均勻,從而形成油包水。將攪拌好的多肽免疫原在日本大耳白兔的背部選取8～10個點(diǎn)進(jìn)行皮膚下注射。在首次免疫之后的第4周進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫,之后每隔2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫1次,共完成加強(qiáng)免疫3次。最后一次免疫后的第7天,采用耳緣靜脈取血,經(jīng)過ELISA測定加強(qiáng)免疫后的抗體效價,在達(dá)到理想的抗體效價后,從新西蘭兔的頸動脈采血,用采集到的血清進(jìn)行親和層析分離純化,將純化的抗體進(jìn)行分裝,保存到-70 ℃的超低溫冰箱待用。

1.5Siglec-6多克隆抗體的效價測定 用包被液對抗原進(jìn)行稀釋(多肽偶聯(lián)BSA),使其濃度達(dá)到2 μg/mL,每孔加入100 μL,4 ℃,孵化過夜,洗液沖洗2次。之后用封閉液進(jìn)行封閉,每孔加入200 μL,37 ℃溫箱孵育2 h;再用洗液沖洗1次。兔的多抗血清從200倍稀釋濃度開始以2倍濃度的梯度進(jìn)行稀釋(in PBS),陰性對照(negative)為未免疫的兔血清進(jìn)行200倍稀釋(in PBS),空白對照(blank)是PBS;每孔加入100 μL,37 ℃溫箱孵育1 h,洗液沖洗3次。然后加入稀釋后的二抗(用 PBS稀釋20 000倍),每孔加入100 μL,37 ℃溫箱孵育1 h,之后取出,再用洗液沖洗3次。進(jìn)行顯色,每孔加入100 μL顯色液,顯色5～15 min。每個樣品孔中添加入50 μL顯色終止液,完成終止。用吸光光度計在波長(450～630)nm下測量吸光度(A),保存并記錄數(shù)據(jù)資料,進(jìn)行作圖深入分析。效價值為大于最大A值50%的A值最小讀數(shù)對應(yīng)的稀釋度值。

1.6檢測Siglec-6多克隆抗體特異性 首先對Siglec-6多克隆抗體進(jìn)行純化,然后針對293T融合表達(dá)的Siglec-6蛋白進(jìn)行Western blotting檢測以鑒定多克隆抗體的特異度。

2 結(jié) 果

2.1氨基酸序列相似性比對 在NCBI上檢索Siglec-6(NP_001236),同時檢索到同源序列rhSiglec-3、 rhSiglec-5、rhSiglec-9、rhSiglec-10、 rhSiglec-7、rhSiglec-11。用NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫Blast分析Geneious軟件對Siglec-6及其同源蛋白序列進(jìn)行比對,結(jié)果顯示,同源序列之間相似性非常高,本文根據(jù)比對序列選取差異區(qū)域的3組序列:Pep-1為ERRFQLEGP,Pep-2為VQNTDDVNPVMV,Pep-3為VQPQEPKVTDT。同時,Geneious軟件和Lasergene軟件分析Siglec-6親疏水性抗原性、表面可及性及二級結(jié)構(gòu)可知,本文選擇的3條多肽都可以作為抗原表位。

2.2多肽抗體的制備和效價 由于Pep-2和Pep-3都位于N端,本文選取Pep-1和Pep-3作為Siglec-6的多肽抗原序列,將設(shè)計的多肽序列合成后分別與KLH交聯(lián),并分別免疫新西蘭兔,之后取血清進(jìn)行倍比稀釋,ELISA測定Pep-1效價為1∶51 200,Pep-3效價為1∶12 800,表明兩組都獲得高效價的多抗。采用親和層析技術(shù)對抗血清進(jìn)行純化。

2.3對Siglec-6多克隆抗體特異度進(jìn)行檢測 為測定血清抗體的特異度,筆者把經(jīng)過純化后的抗體進(jìn)行稀釋,稀釋濃度1∶1 000,然后進(jìn)行Western blotting檢測,對印跡分析(參見圖1),結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)染后首次抽取的293T細(xì)胞蛋白組分中,所使用的多克隆抗體的特異性均可探測到單個相對分子質(zhì)量為90×103的陽性染色條帶(參見圖1),結(jié)果表明,制備的多克隆抗體在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染48 h后,均可檢測到單一的相對分子質(zhì)量為90×103的陽性染色條帶,與GFP-S6蛋白相對分子質(zhì)量的理論值相符,而免疫前陰性血清在轉(zhuǎn)染后48 h提取的293T細(xì)胞蛋白組分中未檢測到對應(yīng)的條帶,說明獲得了特異度較好的抗Siglec-6多克隆抗體。

3 討 論

使用互聯(lián)網(wǎng)的核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,對功能尚不明確的一些基因所編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入的分析和預(yù)測,目前已成為探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的一種高效便捷的手段。有研究表明,在特定條件下,通過數(shù)據(jù)庫和軟件預(yù)測得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能和實(shí)驗(yàn)測定的結(jié)果相一致[5]。這些生物信息學(xué)方法在基因辨識、推測蛋白質(zhì)生物功能、確定蛋白質(zhì)的生理范圍、預(yù)測蛋白質(zhì)多維結(jié)構(gòu)等方面都具有十分重要的作用。本文利用這些高效的方法,來對Siglec-6的抗原特異性、跨膜結(jié)構(gòu)域、高級結(jié)構(gòu)、親疏水性、結(jié)合特異位點(diǎn)、氨基酸序列的正負(fù)電屬性、所選擇氨基酸偏移的酸堿性,以及合成多肽的難易等進(jìn)行了綜合分析[6]。本文對以上因素進(jìn)行充分評估后,確定了針對Siglec-6不同表位的兩條多肽,制備了針對Siglec-6不同表位的多克隆抗體。由于合成的多肽經(jīng)過純化后純度高達(dá)98.0%,且靶向Siglec-6表位的C端和N端,可能具有較高的效價和純度,并且具有較強(qiáng)的特異度。

獲得多肽抗體后,對該多抗的特異度和反應(yīng)度進(jìn)行了檢測。除了抗體的效價外,還有另外一個檢驗(yàn)抗體質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn),就是制備的抗體在不同條件下與抗原的結(jié)合能力。有些肽段形成的抗原決定簇在特殊條件下會受到變性和破壞,因此針對這些特殊肽段的抗體不會用Western blotting方法進(jìn)行檢測。本研究的結(jié)果顯示,制備的Siglec-6多肽抗體可以用Western blotting成功的檢測到(圖1),說明本文制備的抗體在不同條件下的抗原結(jié)合能力均能滿足通常的實(shí)驗(yàn)要求。

人體的大量Siglecs表達(dá)在B細(xì)胞上包括Siglec-2、5、6、9、10[7],在艾滋病患者中,衰竭的B細(xì)胞高表達(dá)很多抑制型受體,包括Siglec-6。用siRNA敲除可以下調(diào)Siglec,能使B細(xì)胞功能恢復(fù)[8]。雖然Siglec-2/CD22 knockout和knockin小鼠在最近幾十年得以廣泛的研究,但是經(jīng)常得到相互矛盾的結(jié)論,因此Siglecs在B細(xì)胞中的功能還沒有定論。對突變小鼠的研究表明,Siglec/SIAE/Lyn/SHP-1路徑對B細(xì)胞耐受和防止自身免疫都起著積極作用[9]。唾液酸乙酰酯酶在疾病中很少出現(xiàn)遺傳性變型,揭示了它可以避免人類的自身免疫和慢性炎癥混亂[10],但是其在細(xì)胞中的生化功能仍然不完全了解。

對Siglecs的研究進(jìn)一步證實(shí)了Siglec-6可能在感染和免疫疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用,具有廣闊的應(yīng)用前景。這也說明了Siglec-6單克隆抗體和多克隆抗體等相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)具有潛在的應(yīng)用價值。綜上所述,采用合成多肽技術(shù),對不同 Siglec-6表位的多克隆抗體進(jìn)行制備,不但提供了一種簡單、高效的方法,而且為Siglec-6相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)以及Siglec-6相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。