五種臨床常用結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法的應(yīng)用性評(píng)價(jià)*

智深深,陶俊吉,丁 燕,李 維△

1.重慶大學(xué)附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 400030;2.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,重慶 400042

結(jié)核病的全球病死率高于艾滋病和瘧疾,是傳染病中的首要死因,這在很大程度上是由于其診斷困難。據(jù)統(tǒng)計(jì),40%的結(jié)核病病例未能被識(shí)別和報(bào)告。據(jù)世界衛(wèi)生組織估算,全球每年新發(fā)結(jié)核病患者超過1 000萬例,死亡患者超過140萬例;中國(guó)新發(fā)患者數(shù)約占全球的8.4%,約83.3萬,居全球第三位,僅次于印度和印度尼西亞。中國(guó)估算結(jié)核病發(fā)病率為58/10萬(2018年61/10萬),在30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中估算結(jié)核病發(fā)病率排第28位,高于俄羅斯(50/10萬)和巴西(46/10萬)[1]。在如此嚴(yán)峻的形勢(shì)下,急需一套靈敏而又特異的檢測(cè)方案來加強(qiáng)對(duì)于結(jié)核分枝桿菌感染者的篩查和診斷,以達(dá)到更高的醫(yī)療效率。目前臨床常用的結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有結(jié)核抗體膠體金法(TB-ab)、結(jié)核分枝桿菌-DNA熒光定量PCR法(TB-DNA)、抗酸染色涂片法(AFS)、液基夾層杯抗酸染色法(LBSC)、結(jié)核特異性γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)等,但各個(gè)方法均有因其自身所導(dǎo)致的一定的局限性[2]。本研究分析了2019年1月至2022年6月于重慶大學(xué)附屬中心醫(yī)院(下稱本院)進(jìn)行TB-DNA、TB-ab、AFS、IGRA、LBSC這5種檢測(cè)方法診斷的患者資料,以臨床最終診斷為金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)5種方法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照和聯(lián)合分析,評(píng)估5種方法在結(jié)核分枝桿菌感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月至2022年6月在本院分別進(jìn)行TB-DNA、TB-ab、IGRA、AFS、LBSC這5種檢測(cè)方法診斷的患者資料,結(jié)核病的臨床診斷參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017)[3],結(jié)核病分類參照中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS196-2017)[4]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)免疫功能缺陷或低下的患者;(2)臨床未給出準(zhǔn)確診斷的患者;(3)無完整病歷資料的患者。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn),排除181例患者,最終共收集5 411例患者,其中男3 356例,女2 055例,年齡(62±18)歲,其中確診為結(jié)核病793例。確診患者中,非活動(dòng)性肺結(jié)核141例;活動(dòng)性肺結(jié)核652例,其中活動(dòng)性肺結(jié)核497例,活動(dòng)性肺外結(jié)核155例。

1.2材料與方法

1.2.1TB-DNA 取患者清晨第一口痰,立即保存送檢。采用圣湘生物結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)和杭州安譽(yù)PCR儀AGS4800進(jìn)行檢測(cè)和分析,按照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作,根據(jù)Ct值是否≤39判斷結(jié)核分枝桿菌DNA是否為陽性。

1.2.2IGRA 采集患者清晨空腹靜脈血,使用萬泰結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒分別吸取1 mL分裝為樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照3管,37 ℃孵育24 h,放入優(yōu)邁科Caris200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)并判斷結(jié)果。

1.2.3LBSC 采用天騎醫(yī)學(xué)抗酸染色液-Ⅰ和天騎醫(yī)學(xué)夾層杯-Ⅰ,將檢測(cè)標(biāo)本(痰液、胸腔積液、腹水、腦脊液)消化后離心,去上清液并烘干,對(duì)杯底的高分子膜及其附著在膜上的有效成分進(jìn)行抗酸染色,按照說明書標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作,通過顯微鏡觀察是否為抗酸桿菌陽性。

1.2.4TB-ab 采用艾博生物醫(yī)藥結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金法),對(duì)患者血清進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)試紙條檢測(cè)線和質(zhì)控線是否出現(xiàn)紫紅色條帶判斷患者是否存在結(jié)核分枝桿菌IgG抗體。

1.2.5AFS 采用龐通醫(yī)療器械抗酸染色液(Ⅲ型),將痰液均勻涂片后,進(jìn)行抗酸染色,通過顯微鏡觀察是否抗酸桿菌陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用IBM SPSS Statistics 24和MedCalc20.022軟件包完成數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)描述以及分析,以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算出各檢測(cè)方法及方法組合的陽性率、靈敏度、特異度,以約登指數(shù)評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的優(yōu)劣,以Kappa一致性系數(shù)評(píng)價(jià)檢測(cè)方法與臨床診斷的一致性,Kappa≥0.75,說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較好,0.40≤Kappa<0.75,說明兩種方法診斷結(jié)果一致性中等,Kappa<0.40,說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較差。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各檢測(cè)方法單獨(dú)使用及聯(lián)合使用對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的診斷的真實(shí)性指標(biāo) 根據(jù)各個(gè)方法的檢測(cè)結(jié)果,以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算相應(yīng)的陽性率、靈敏度、特異度和Kappa值一致性系數(shù)。TB-DNA、TB-ab、IGRA、AFS、LBSC這5種方法用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷的靈敏度分別為71.21%、61.32%、78.16%、21.27%、37.94%;特異度分別為98.11%、63.64%、66.52%、99.59%、99.81%;Kappa值分別為0.453、0.111、0.360、0.247、0.392。單項(xiàng)檢測(cè)中,靈敏度最高的是IGRA(78.16%),特異度最高的是LBSC(99.81%);陽性預(yù)測(cè)值最佳的為L(zhǎng)BSC(95.65%),陰性預(yù)測(cè)值最高的為IGRA(92.83%),約登指數(shù)最高的是TB-DNA(0.693),Kappa值最高的為TB-DNA(0.453),見表1。

表1 各方法單獨(dú)使用及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核病診斷的真實(shí)性指標(biāo)

依據(jù)各方法聯(lián)合使用時(shí)的檢測(cè)結(jié)果,采用平行試驗(yàn)原則,即多種方法聯(lián)合使用時(shí)其中一種方法檢測(cè)為陽性則判斷為陽性,以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算相應(yīng)的陽性率、靈敏度、特異度、約登指數(shù)和Kappa值一致性系數(shù)。聯(lián)合檢測(cè)靈敏度最高的組合是IGRA+LBSC+TB-ab 3項(xiàng)(95.24%),特異度最高的組合是TB-DNA+LBSC(98.23%);約登指數(shù)最高的組合項(xiàng)為IGRA+TB-DNA(0.722),Kappa值一致性系數(shù)最高的組合項(xiàng)是IGRA+TB-DNA(0.558)。IGRA+DNA的約登指數(shù)和Kappa值高于單項(xiàng)和其他組合項(xiàng),在此基礎(chǔ)上聯(lián)合更多的檢測(cè)方法對(duì)于提高診斷效能和診斷一致性并無明顯作用。LBSC+DNA組合的約登指數(shù)和Kappa值雖不如IGRA+TB-DNA,但仍相對(duì)較高,考慮檢測(cè)價(jià)格及開展條件,此組合仍值得推廣。

2.2各檢測(cè)方法及IGRA+TB-DNA對(duì)不同結(jié)核病類型檢測(cè)的陽性率對(duì)比 根據(jù)結(jié)核病的狀態(tài)和部位,將參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017,WS196-2017)確診為結(jié)核病的患者分為3組:活動(dòng)性肺結(jié)核組、非活動(dòng)性肺結(jié)核組、活動(dòng)性肺外結(jié)核組。檢測(cè)方法單獨(dú)使用時(shí),3組中都是IGRA的陽性率最高,分別為83.6%、74.2%、83.8%,而當(dāng)IGRA聯(lián)合TB-DNA使用時(shí),活動(dòng)性肺結(jié)核組和活動(dòng)性肺外結(jié)核組的陽性率相比IGRA單獨(dú)使用都有所提升,分為92.4%、84.6%,而非活動(dòng)性肺結(jié)核組則有所下降,為66.7%。見表2。

表2 各檢測(cè)方法對(duì)不同結(jié)核類型的陽性率(%)

3 討 論

控制傳染源并及早地發(fā)現(xiàn)和治療結(jié)核病患者,尤其是開放性的肺結(jié)核患者是結(jié)核防治的重要手段,結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)是防治的基礎(chǔ),因此,及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)方法尤為重要。然而,目前臨床使用的檢測(cè)方法包括結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)、涂片鏡檢、免疫學(xué)試驗(yàn),均存在不足之處。結(jié)核菌素皮試及TB-ab常出現(xiàn)假陽性,卡介苗接種人群可呈陽性;雖然AFS及LBSC快速簡(jiǎn)單,但檢出率低,且其他分枝桿菌的感染抗酸染色也呈陽性;許多有癥狀的結(jié)核病患者因?yàn)闊o法取到高質(zhì)量或帶菌的標(biāo)本,從而導(dǎo)致AFS無法檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌[5];IGRA雖可排除標(biāo)本采集的影響,但其假陽性較高;雖然培養(yǎng)方法被認(rèn)為是結(jié)核病診斷和耐藥性檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但是需要4～12周才可獲得最終確認(rèn)報(bào)告[6]。因各種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的局限性,導(dǎo)致結(jié)核感染的診斷存在一定困難,而這與結(jié)核病在全球范圍內(nèi)死灰復(fù)燃具有相關(guān)性。因此需要從傳統(tǒng)的疾病診斷方法和管理方法轉(zhuǎn)變方式,引入新的檢測(cè)工具或策略,從而到達(dá)盡早盡快地管控的目的。

本研究通過對(duì)5 411例進(jìn)行了TB-DNA、TB-ab、AFS、IGRA、LBSC的患者的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,探討5種檢測(cè)方法單獨(dú)使用及聯(lián)合使用對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的診斷價(jià)值。為了評(píng)價(jià)并對(duì)比各檢測(cè)方法及方法組合的診斷價(jià)值,本研究將幾種方法聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行邏輯回歸,得到多種方法聯(lián)合的預(yù)測(cè)概率值,以此綜合反映其診斷能力,通過對(duì)各檢測(cè)方法單獨(dú)及聯(lián)合使用的診斷價(jià)值進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),LBSC聯(lián)合TB-DNA使用的診斷一致性與IGRA聯(lián)合TB-DNA的診斷結(jié)果一致性相當(dāng),均高于IGRA單獨(dú)使用,但在此基礎(chǔ)上再增加其他方法聯(lián)合使用并沒有獲得更高的診斷價(jià)值。

本研究中AFS、LBSC和TB-DNA等以痰為標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法在單獨(dú)使用和聯(lián)合使用時(shí),都表現(xiàn)出了高特異度和低靈敏度的特點(diǎn),而這與臨床標(biāo)本取樣質(zhì)量、患者結(jié)核病狀態(tài)和部位、標(biāo)本的處理過程等眾多因素都有所相關(guān)。因此,這些方法單獨(dú)用于早期結(jié)核分枝桿菌感染的診斷的價(jià)值有限[7-8]。

TB-ab和IGRA這兩種以血清為標(biāo)本的免疫學(xué)檢測(cè)方法在本次研究中也呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。TB-ab的靈敏度和特異度都比較低,IGRA雖然特異度較低,但靈敏度高于其他4種檢測(cè)方法。TB-ab簡(jiǎn)單易行,價(jià)格低廉,但非結(jié)核分枝桿菌感染和卡介苗(BCG)的接種也會(huì)導(dǎo)致假陽性,免疫缺陷患者中檢出率也較低,因此不建議單獨(dú)用于結(jié)核分枝桿菌感染的確診[9]。IGRA不受卡介苗的影響,受非結(jié)核分枝桿菌的影響也較小,較少出現(xiàn)假陰性,但其假陽性較多,因此推薦作為結(jié)核分枝桿菌感染的補(bǔ)充檢測(cè)[10],2017版的結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)中也新增了此項(xiàng)作為診斷依據(jù)。

本研究顯示約登指數(shù)最高的組合為IGRA+TB-DNA,在此基礎(chǔ)上聯(lián)合更多的檢測(cè)方法對(duì)診斷價(jià)值的提高并無明顯作用。Kappa值最高的組合IGRA+DNA只有0.558,按照Kappa值對(duì)于診斷試驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn),達(dá)到0.75以上才算診斷一致性較高[11]。出現(xiàn)這種情況,可能是由于本研究篩選的患者雖然去除了免疫低下或缺陷的患者,但仍然存在一部分免疫力有缺陷患者可能并沒有在病歷中描述清楚從而導(dǎo)致免疫學(xué)方法失效。同時(shí),由于潛伏期結(jié)核感染缺乏金標(biāo)準(zhǔn),因此存在潛伏期結(jié)核感染并沒有被臨床醫(yī)生診斷的情況。并且,確診患者中存在非活動(dòng)性肺結(jié)核和肺外結(jié)核,這些患者的痰中存在病原體的概率較小,導(dǎo)致細(xì)菌學(xué)方法和分子生物學(xué)方法對(duì)其的診斷效能大大下降[12]。

在本研究中,AFS、LBSC和TB-DNA等以痰為標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)非活動(dòng)性肺結(jié)核和肺外結(jié)核的陽性率較低,最高只有10.8%,這與文獻(xiàn)[13-15]研究結(jié)果相似,陽性率在0.0%～20.0%。對(duì)于活動(dòng)性肺結(jié)核IGRA的陽性率高達(dá)83.6%,其余4種方法的陽性率最高只有53.1%,有研究顯示IGRA檢測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核非常高的陽性率,在85.0%～90.0%[16-17]。而將IGRA和TB-DNA聯(lián)用時(shí),雖然非活動(dòng)性肺結(jié)核的陽性率有所下降,但活動(dòng)性肺結(jié)核和肺外結(jié)核的陽性率均有所提高,達(dá)到了92.4%、84.6%。因此,臨床醫(yī)生可以根據(jù)臨床情況合理選擇檢測(cè)方式以提高診斷效率。

在對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的診斷試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí),需注意假陽性和假陰性的原因。例如,非結(jié)核分枝桿菌感染的患者進(jìn)行AFS和LBSC檢測(cè)時(shí)因?yàn)橐彩强顾崛旧栃?容易被誤認(rèn)是結(jié)核分枝桿菌,同時(shí)因?yàn)榕R床癥狀和結(jié)核病也比較相似,也易被診斷為結(jié)核病[18]。免疫學(xué)方法TB-ab和IGRA則容易受到患者的免疫狀態(tài)影響,同時(shí)輸入帶有結(jié)核抗體的血液制品也會(huì)導(dǎo)致TB-ab出現(xiàn)假陽性[19]。

IGRA聯(lián)合TB-DNA的檢測(cè)時(shí)間短,靈敏度、特異度都相對(duì)較高,在一定程度上區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌感染,診斷優(yōu)勢(shì)明顯優(yōu)于其他方法聯(lián)合。對(duì)于不能進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和非結(jié)核分枝桿菌鑒定的醫(yī)院來說,IGRA聯(lián)合TB-DNA在結(jié)核分枝桿菌感染的診斷價(jià)值值得臨床醫(yī)生重視;結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率與經(jīng)濟(jì)發(fā)展呈負(fù)相關(guān),除了檢測(cè)方法本身的優(yōu)劣,經(jīng)濟(jì)條件也是需要考慮的重要因素,LBSC聯(lián)合TB-DNA檢測(cè)的靈敏度雖然不如IGRA聯(lián)合TB-DNA,但特異度較高,陽性預(yù)測(cè)值也優(yōu)于后者,加之該方法簡(jiǎn)單易行成本較低,在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)具有較好的應(yīng)用前景。