干擾SATB1抑制宮頸癌增殖和轉(zhuǎn)移能力及增強宮頸癌放射敏感性的作用研究*

喬 娟,楊 昊,牛麗紅,楊 璐,馬 敬,肖慧英

1.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院內(nèi)蒙古醫(yī)院/內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科,內(nèi)蒙古呼和浩特 010020;2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院內(nèi)蒙古醫(yī)院/內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科,內(nèi)蒙古呼和浩特 010020;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,內(nèi)蒙古呼和浩特 010030

宮頸癌是全球第四大最常見的癌癥和婦科癌癥相關(guān)死亡的原因。據(jù)相關(guān)報道統(tǒng)計,在2020年全球約有60萬名婦女被診斷患有宮頸癌,約34萬人死于宮頸癌[1]。雖然宮頸癌通過化療、放療和手術(shù)切除等治療改善了早期宮頸癌患者的預(yù)后,但是晚期患者的放療敏感性低下和存在化療耐藥性,常常導(dǎo)致復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移甚至死亡,這嚴(yán)重影響了宮頸癌治療的效果,限制了同步放化療的臨床應(yīng)用[2]。因此,需要深入了解宮頸癌發(fā)展的機制,并尋找新的治療分子靶點來改善宮頸癌患者的治療效果。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白1 (SATB1)基因位于3號染色體3短臂23區(qū)上,介導(dǎo)染色質(zhì)重塑,進(jìn)行基因調(diào)控[2]。有研究報道,SATB1在多種腫瘤中過度表達(dá),并發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等重要作用[3-5]。ZHAO等[6]研究發(fā)現(xiàn),SATB1在宮頸癌組織中呈高表達(dá),且SATB1高表達(dá)患者與國際發(fā)立科聯(lián)合會(FIGO)分期、組織學(xué)分級和不良預(yù)后相關(guān)。SATB1作為p21活化激酶5(PAK5)和微小RNA-100(miR-100)的下游調(diào)控基因參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[7]。同時,SATB1在腫瘤治療抵抗中也發(fā)揮著促進(jìn)作用,直腸癌放療患者中報道SATB1陽性與患者術(shù)前放療反應(yīng)降低、早期轉(zhuǎn)移和生存率降低呈獨立相關(guān)性[8]。但SATB1是否與宮頸癌患者放療敏感性相關(guān)尚不清楚,本文對SATB1在宮頸癌增殖、轉(zhuǎn)移和放療抵抗中發(fā)揮的作用進(jìn)行研究,旨在探討SATB1作為宮頸癌治療的潛在分子靶點的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集入住北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院內(nèi)蒙古醫(yī)院/內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(下稱本院)并行子宮手術(shù)切除的62例宮頸癌患者的成對的癌組織和相鄰的非腫瘤組織。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)首次確診為宮頸癌,并經(jīng)病理證實;(2)手術(shù)前未接受過任何形式的抗腫瘤治療;(3)原發(fā)性宮頸癌,未發(fā)生轉(zhuǎn)移,并且未合并其他類型的惡性腫瘤;(4)手術(shù)時間為2014年8月至2017年10月,并且具有完整的隨訪資料;(5)簽署患者知情同意書。本研究所有標(biāo)本操作均由本院倫理委員會審核通過。

1.2主要試劑 無水乙醇、甲醛及二甲苯(廣東中海南聯(lián)能源有限公司);DAKO免疫組化檢測試劑盒(丹麥);枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液和PARP蛋白裂解液(北京索萊寶試劑公司);宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞(CaSki)(美國ATCC細(xì)胞庫);細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(美國Gibco試劑公司);SATB1 siRNA(廣州銳博生物生物技術(shù)有限公司);蛋白高效裂解液(北京Solarbio試劑有限公司);蛋白上樣緩沖液和BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天試劑有限公司);PVDF膜(美國Promega公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(翌圣生物科技上海有限公司);CCK8檢測試劑(英國Abcam公司);Transwell小室(美國Coring公司);SATB1一抗和鼠二抗、兔二抗(美國Proteintech公司)。

1.3免疫組化 所有癌組織和相鄰的非腫瘤組織樣本均用福爾馬林固定24 h。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其包埋為石蠟蠟塊,并經(jīng)切片機制成4 μm厚的切片。根據(jù)免疫組化檢測試劑盒的說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用小鼠IgG代替一抗作為陰性對照。然后,使用顯微鏡觀察切片。在高倍鏡下,在每個切片的5個隨機選擇的視野中測定染色陽性細(xì)胞的數(shù)量和強度。陽性細(xì)胞百分比評分如下:1分為<5%;2分為5%～25%;3分為>25%～50%;4分為>50%～75%; 5分為>75%。強度評分如下:0分為無染色;1分為弱染色;2分為中度染色;3分為強染色。使用以下公式計算總得分:總得分=百分比得分×強度得分。<2分被定義為陰性,≥2分被定義為陽性。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 CaSki細(xì)胞復(fù)蘇后,800 r/min離心去除凍存液,放置在含有10%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)基中,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長。每2天更換一次培養(yǎng)基,待細(xì)胞生長至約80%,用胰蛋白酶消化傳代。取生長良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實驗研究。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長良好的細(xì)胞,在第1天晚上接種至6孔板中,每孔的細(xì)胞密度為70%～80%,并確保細(xì)胞均勻分布在6孔板的底部。待細(xì)胞貼壁后,隨機分為si-NC組和si-SATB1組,并于當(dāng)天上午進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染;si-NC組轉(zhuǎn)染2.5 μg NC siRNA和10 μL Lipo3000;si-SATB1組轉(zhuǎn)染2.5 μg SATB1 siRNA和10 μL Lipo3000。NC siRNA序列為5′-AAG TCT TCT GAC GCT GCT GCC TGG TCC AG-3′,SATB1 siRNA序列為5′-AGA TTC AGC AGG AAA TGA AGC GTG CTA AA-3′ 。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行采用Western blotting檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.6CCK8實驗 細(xì)胞增殖能力檢測:轉(zhuǎn)染48 h后,各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理,制備成單細(xì)胞懸浮液,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),并采用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×103個/毫升,均勻地鋪至96孔板中,在細(xì)胞貼壁后計為0點,每隔24 h計為1個時間點,時間點分別計為0、24、48、72和96 h,每個時間點設(shè)置6個復(fù)孔,放置在37 ℃和5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)。在相對應(yīng)的時間點加入20 μL CCK8試劑,繼續(xù)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔細(xì)胞的吸光度(A)值。

細(xì)胞放療敏感性檢測:轉(zhuǎn)染48 h后,各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理,制備成單細(xì)胞懸浮液。進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),并采用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×103個/毫升,均勻地鋪至96孔板中,在細(xì)胞貼壁后,隨機分為0、2、4、6和8 Gy,每組設(shè)置6個復(fù)孔,進(jìn)行相應(yīng)放射劑量的照射,放置在37 ℃和5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)48 h,并每孔細(xì)胞加入20 μL CCK8試劑,繼續(xù)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔細(xì)胞的A值,計算細(xì)胞存活率=對應(yīng)放射劑量細(xì)胞A值/0 Gy細(xì)胞A值。

1.7Transwell實驗 轉(zhuǎn)染48 h后,各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理,制備成單細(xì)胞懸浮液。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次后,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),并采用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個/毫升。取100 μL細(xì)胞懸浮液緩慢滴入Transwell小室的上室中的聚碳酸酯膜上。取500 μL含有10%胎牛血清的完整培養(yǎng)基加入下室腔中,并在37 ℃和5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)12 h。用棉簽輕輕擦拭并清洗上室膜上未穿透膜的細(xì)胞。用甲醇固定細(xì)胞15 min,蘇木精染色10 min,干燥后,用刀片輕輕切割聚碳酸酯膜至載玻片上,并用中性樹膠固定。在顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)量。隨機選擇5個高倍視野,并拍攝和記錄。

1.8Western blotting檢測蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后,丟棄細(xì)胞培養(yǎng)基。用PBS洗滌3次后,加入制備的RIPA細(xì)胞裂解緩沖液(1×RIPA∶100×CK∶100×磷酸酶抑制劑=100∶1∶1)以充分裂解。將裂解物吸入標(biāo)記的EP管中,放置于超聲機中裂解30 min。12 000×g離心30 min,將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中。用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品與5×SDS加載緩沖液的以體積比4∶1混合,在95 ℃水浴中煮沸10 min。配置10%聚丙烯酰胺凝膠,加樣后進(jìn)行凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)移120 min至PVDF膜上。5%脫脂奶粉孵育PVDF膜60 min,并加入一抗稀釋液在4 ℃下孵育過夜。采用TBST洗滌10 min×3次,加入按適當(dāng)比例稀釋的二抗,室溫孵育60 min,采用TBST洗滌10 min×3次,采用ECL發(fā)光試劑盒暴露并計算目的蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化檢測 SATB1在宮頸癌組織中的表達(dá)水平 免疫組化檢測結(jié)果顯示,SATB1在宮頸癌組織和相鄰的非腫瘤組織中的陽性表達(dá)率分別為53.23%(33/62)和32.26%(20/62)。與非腫瘤組織中SATB1的表達(dá)相比,宮頸癌組織中SATB1的陽性表達(dá)率顯著升高(χ2=5.569,P=0.018),見圖1。

圖1 免疫組化檢測SATB1在宮頸癌組織中的表達(dá)水平(×100)

2.2SATB1表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系χ2檢驗分析顯示,SATB1的表達(dá)水平與宮頸癌患者的年齡、組織學(xué)類型、分化程度和肌層浸潤深度均無相關(guān)性(P>0.05),與宮頸癌腫瘤最大徑、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),SATB1在腫瘤最大徑較大、FIGO分期晚期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中SATB1的陽性表達(dá)率升高(P<0.05)。見表1。

表1 SATB1的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.3SATB1表達(dá)水平對宮頸癌患者預(yù)后的影響 采用Kaplan-Meier繪制生存曲線,Log-Rank分析SATB1表達(dá)水平對宮頸癌患者生存預(yù)后的影響。與低表達(dá)SATB1的宮頸癌患者相比,高表達(dá)SATB1的宮頸癌患者預(yù)后較差(χ2=5.73,P=0.017),見圖2。

圖2 Log-Rank分析SATB1對宮頸癌患者預(yù)后

2.4Western blotting檢測SATB1 siRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞CaSki的效果 采用Western blotting檢測SATB1 siRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞CaSki的效果,結(jié)果顯示si-NC組和si-SATB1組SATB1蛋白表達(dá)量分別為(0.73±0.14)和(0.25±0.04),與si-NC組相比,si-SATB1組細(xì)胞中SATB1蛋白表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.710,P=0.002),見圖3。

圖3 Western blotting檢測SATB1 siRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞效果

2.5CCK8實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細(xì)胞CaSki增殖能力的影響 CCK8實驗結(jié)果顯示與si-NC組細(xì)胞相比,si-SATB1組CaSki細(xì)胞增殖能力降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4和表2。

表2 不同時間點各組CaSki細(xì)胞的A值

圖4 CCK8實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細(xì)胞CaSki增殖能力的影響

2.6Transwell實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細(xì)胞CaSki轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示,si-NC組和si-SATB1組穿膜細(xì)胞數(shù)目為(86.67±12.95)個和(52.33±9.04)個,與si-NC組細(xì)胞相比,si-SATB1組CaSki細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.766,P=0.013),見圖5。

2.7CCK8實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細(xì)胞CaSki放療敏感性的影響 CCK8實驗結(jié)果顯示,與si-NC組相比,si-SATB1組CaSki細(xì)胞的細(xì)胞存活率降低,放療敏感性升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖6和表3。

表3 不同放射劑量處理各組CaSki細(xì)胞的細(xì)胞存活率

圖6 CCK8實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細(xì)胞CaSki放療敏感性的影響

2.8SATB1 siRNA對CaSki細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路及其下游基因表達(dá)的影響 Western blotting實驗結(jié)果顯示,與si-NC組細(xì)胞相比,si-SATB1組CaSki細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin及其下游蛋白cyclinD1、cMYC和MMP-2表達(dá)水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖7和表4。

表4 干擾SATB1的表達(dá)對Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白及其下游基因表達(dá)的影響

圖7 Western blotting實驗檢測SATB1對CaSki細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白和轉(zhuǎn)移蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

宮頸癌的發(fā)病多歸因于人類乳頭瘤病毒(HPV)感染,盡管有效的早期篩查和HPV疫苗接種大大降低了世界范圍內(nèi)的宮頸癌發(fā)病率和病死率,但宮頸癌的臨床癥狀和體征在早期仍然隱匿,不易被發(fā)現(xiàn),確診時往往已處于晚期,導(dǎo)致患者臨床治療效果較差及生存預(yù)后不佳,特別是在低收入國家[1]。因此,識別新的治療靶點對于提供用于宮頸癌治療的有價值的策略具有重要的研究意義。有研究顯示,轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程中不僅影響染色體基因表達(dá)的數(shù)目,還可以對染色體基因表達(dá)造成影響,其表達(dá)水平異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞生長發(fā)育異常,引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SATB1屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的一員,SATB1通過與核基質(zhì)結(jié)合,誘導(dǎo)形成3D染色質(zhì)環(huán),以及通過調(diào)控表觀遺傳組學(xué)包括甲基化和乙?；{(diào)控1 000多個基因表達(dá)[2]。同時,SATB1是一種T細(xì)胞特異性因子,參與胸腺細(xì)胞的發(fā)育。研究顯示,SATB1在腫瘤中的表達(dá)水平異常,并在腫瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。

有研究報道,SATB1在前列腺癌、胃癌和非小細(xì)胞肺癌等實體瘤[3-5]、急性髓系白血病和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤等[10-11]血液系統(tǒng)腫瘤中均發(fā)揮促癌作用。在前列腺癌組織中SATB1表達(dá)水平增加,SATB1表達(dá)水平與患者術(shù)前前列腺特異抗原水平、術(shù)后Gleason評分、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[3]。在胃癌中,SATB1敲低通過抑制HER3的表達(dá)水平,消除HRG對MET的抑制作用,增加胃癌細(xì)胞化療的敏感性[4]。SATB1作為非小細(xì)胞肺癌中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的調(diào)節(jié)因子。這均表明SATB1在惡性腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5],但是SATB1在宮頸癌中發(fā)揮的具體作用尚未見明確報道。ZHAO等[6]對33例宮頸癌組織檢測結(jié)果顯示,SATB1在宮頸癌組織中表達(dá)水平升高,且SATB1高表達(dá)組患者FIGO分期、組織學(xué)分級及預(yù)后均顯示不良,SATB1在宮頸腺癌中的表達(dá)水平顯著高于在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平。本文檢測了62對宮頸癌組織和非癌組織中SATB1的表達(dá)水平情況,同樣得出SATB1在宮頸癌組織中呈高表達(dá),并與宮頸癌腫瘤最大徑、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),但是并沒有顯示SATB1表達(dá)水平與宮頸癌組織類型相關(guān),宮頸癌有兩種主要類型:宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸腺癌,其中宮頸鱗狀細(xì)胞癌占80%～85%[12],ZHAO等[6]研究中包含的宮頸腺癌例數(shù)為8例,本文中宮頸腺癌的例數(shù)為10例,分析原因可能是樣本量較小,后續(xù)會擴大樣本量進(jìn)一步研究。

在組織水平的研究已提示SATB1發(fā)揮促癌作用的情況下,HUO等[7]報道PAK5通過介導(dǎo)SATB1的Ser47位點磷酸化啟動上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程級聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。同時SATB1在胃癌和鼻咽癌中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[4,13],提示SATB1可能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,本文在宮頸癌細(xì)胞中干擾SATB1的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力降低,表明SATB1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。有研究報道,在直腸癌中降低SATB1的表達(dá)并增強直腸癌細(xì)胞敏感性,SATB1可預(yù)測直腸癌術(shù)前放療的反應(yīng)和臨床結(jié)果[8]。本文在放射處理宮頸癌細(xì)胞并干擾SATB1的表達(dá)水平后,發(fā)現(xiàn)干擾SATB1的表達(dá)水平會增強宮頸癌細(xì)胞的放療敏感性。RAO等[14]報道SATB1靶向β-catenin促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力,以及在肺癌細(xì)胞中miR-448靶向SATB1抑制Wnt/β-catenin途徑抵抗腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥性[15],均提示SATB1與Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控密切相關(guān)。Wnt/β-catenin是促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、化療耐藥及放療抵抗等惡性生物學(xué)行為的重要信號通路,在宮頸癌中也處于激活狀態(tài)[16]。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路的活化需要β-catenin累積入細(xì)胞核,激活下游的靶基因,包括增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡、耐藥、放療抵抗及干性等基因,其中cyclinD1、cMYC為增殖相關(guān)基因,MMP-2為侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[17],而本研究發(fā)現(xiàn)干擾SATB1的表達(dá)后宮頸癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin及其下游蛋白cyclinD1、cMYC和MMP2表達(dá)均降低,與RAO等[14]和NING等[15]報道的一致,均顯示SATB1通過靶向β-catenin激活Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用,不同的是在發(fā)揮的作用不同,而本研究提示SATB1可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力和增強放療敏感性。但是SATB1在宮頸癌發(fā)揮生物學(xué)功能的作用機制仍需后續(xù)深入探討。

綜上所述,SATB1在宮頸癌中高表達(dá),可能是患者預(yù)后不良的分子標(biāo)志物,同時SATB1可能通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力,并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞放療抵抗。SATB1具有作為治療宮頸癌分子靶點的潛力。