血漿生物標(biāo)志物MMP-8在預(yù)測活動(dòng)性肺結(jié)核病診斷效能的評價(jià)*

張雅曦,張潔云,張明霞,楊倩婷,陳 騎

深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所,廣東深圳 518112

結(jié)核病(TB)是全球單一傳染源的大流行病,每年有近1 040萬新發(fā)TB病例和180萬例TB患者死亡[1]。據(jù)估計(jì),全球三分之一的人口潛伏感染結(jié)核分枝桿菌(MTB),其中約10%的人可能會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核[1]。盡管近年來有一些新藥研發(fā),但仍需要新的短程高效治療手段和深入了解TB潛在的發(fā)病機(jī)制。早發(fā)現(xiàn)早治療是傳染病的基本防控策略,也是降低發(fā)病率和病死率的重要措施。

活動(dòng)性肺結(jié)核(ATB)患者肺腔里存在肺組織的損傷,其特點(diǎn)是MTB載量高,大量巨噬細(xì)胞吞噬MTB導(dǎo)致肉芽腫形成和氣蝕破壞基質(zhì)[2],從而使其失去穩(wěn)態(tài)保護(hù)作用和損傷后的組織重塑和修復(fù)能力,并釋放細(xì)胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物和侵蝕肉芽腫干酪化壞死,肺組織空化和破壞持續(xù)擴(kuò)散,導(dǎo)致MTB進(jìn)一步傳播[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是結(jié)核組織破壞的關(guān)鍵效應(yīng)物[4]。抑制MMP活性來阻止基質(zhì)被破壞并使結(jié)核相關(guān)的發(fā)病率和病死率降低,以及改善TB的治療效果[5-6]。MMP活性增加與多種感染以及非感染性肺部疾病中的炎癥反應(yīng)有關(guān)[7]。

在前期工作中,本團(tuán)隊(duì)利用蛋白芯片和流式技術(shù)比較不同類型的臨床樣本,篩選出多個(gè)血漿中生物標(biāo)志物,其中發(fā)現(xiàn)在ATB患者M(jìn)MP-8的表達(dá)水平顯著高于健康對照者(HC)和結(jié)核感染潛伏者(LTBI)。為了建立更為快速、便捷、應(yīng)用廣泛的檢測方法,在此基礎(chǔ)上,本文采用化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)核菌多肽刺激后血漿中標(biāo)志物MMP-8的表達(dá)水平,為ATB的輔助診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇于2022年5-9月在本院肺病醫(yī)學(xué)部住院的ATB患者143例,其中痰涂片陽性肺結(jié)核(AFB+TB)患者48例,平均年齡(43±18)歲;痰涂片陰肺性結(jié)核(AFB-TB組)患者95例,平均年齡(42±16)歲;LTBI患者44例,平均年齡(44±11)歲。另選取同期體檢的HC 120例,平均年齡(42±12)歲。各組間年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),具有可比性。診斷依據(jù)《肺結(jié)核診斷和治療指南》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),入組標(biāo)準(zhǔn):年齡在18～68歲,無自身免疫性疾病、未合并基礎(chǔ)疾病。ATB判定標(biāo)準(zhǔn):(1)細(xì)菌學(xué)包括涂片抗酸桿菌檢查陽性和結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性患者;(2)分子生物學(xué)僅分枝桿菌核酸檢測陽性;(3)影像學(xué)有胸部影像有ATB相符的病變;(4)病理學(xué)在肺組織病理符合TB病理改變。其中,AFB+TB患者微生物細(xì)菌學(xué)痰、肺泡灌洗液涂片陽性或培養(yǎng)陽性,AFB-TB患者細(xì)菌學(xué)陰性。LTBI入組標(biāo)準(zhǔn):有結(jié)核接觸史,特異性結(jié)核分枝桿菌刺激γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs)檢測陽性,影像學(xué)胸部X線片正常,臨床表現(xiàn)無癥狀且痰涂片中無結(jié)核分枝桿菌。(3)HC入組標(biāo)準(zhǔn):均經(jīng)胸部X線或CT 檢查,排除肺內(nèi)外結(jié)核菌感染。既往無TB史,未服用抗結(jié)核藥物。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2研究方法

1.2.1試劑與儀器:TB-DNA檢測試劑(達(dá)安基因股份有限公司),PCR擴(kuò)增儀ABI-7500;痰培養(yǎng)試劑、全自動(dòng)快速結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)儀BD-960;IGRAs檢測試劑盒(北京同生時(shí)代生物科技有限公司);斑點(diǎn)Elispot讀板儀(美國CTL公司);化學(xué)發(fā)光試劑盒、MMP-8試劑、化學(xué)發(fā)光儀器i2000(新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)。

1.2.2標(biāo)本采集:用肝素鋰抗凝管采集各受試者10 mL全血,避免溶血。IGRAs檢測:取5 mL全血分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),PRMI1640培養(yǎng)基洗滌并計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù),終濃度為2×106/mL,每個(gè)樣本設(shè)陽性對照、空白對照和抗原檢測孔。全程嚴(yán)格按說明書執(zhí)行。MMP-8檢測:取2 mL全血加入結(jié)核分枝桿菌特異性多肽PB、P8、P10(結(jié)核分枝桿菌多肽實(shí)驗(yàn)室制備)5 μg/mL,混勻放置37 ℃培養(yǎng)箱孵育16～18 h,離心收集上清用于化學(xué)發(fā)光檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism V7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料采用百分率表示,采用χ2檢驗(yàn),通過受試者工作特征(ROC)曲線確定最佳閾值,計(jì)算曲線下面積(AUC)及95%置信區(qū)間(95%CI),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基于MMP-8化學(xué)發(fā)光檢測建立用于ATB診斷的預(yù)測 通過ROC曲線分析標(biāo)志物表達(dá)水平對TB、LTBI和HC組的鑒別能力。閾值為10.84 ng/mL(超過閾值)時(shí),MMP-8檢測結(jié)果能較好鑒別AFB+TB和HC,AUC為0.95(95%CI:0.92～0.98),準(zhǔn)確度為0.85,靈敏度為0.94,特異度為0.83。在區(qū)分AFB-TB和HC對照組中AUC為0.89(95%CI:0.85～0.94),準(zhǔn)確度為0.76,靈敏度為0.94,特異度為0.76。此外,鑒別AFB+TB和LTBI的AUC為0.96(95%CI:0.94～0.98),靈敏度為0.83,特異度為0.98。區(qū)分AFB-TB和LTBI的AUC為0.93(95%CI:0.90～0.97),靈敏度為0.76,特異度為0.98。見圖1。

圖1 ROC曲線分析MMP-8表達(dá)水平在各組間鑒別ATB中的預(yù)測

2.2不同檢測方法診斷AFB-TB、AFB+TB的效能評估 基于血漿多肽刺激的生物標(biāo)志物在診斷應(yīng)用的比較,本文評估了TB-DNA、痰培養(yǎng)、IGRAs和MMP-8檢測等方法對AFB-TB、AFB+TB患者的診斷效能。AFB+TB的檢出率分別為79.17%、52.08%、83.33%和85.42%。在AFB-TB的檢出率為21.05%、15.79%、61.05%和75.78%。同時(shí),平行比較AFB-TB中MMP-8標(biāo)志物檢測與其他3種方法在診斷效能方面,其各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 不同檢測方法在AFB-TB、AFB+TB的診斷效能[n(%)]

3 討 論

TB是全球主要的公共衛(wèi)生問題,特別是在發(fā)展中國家。TB高發(fā)的國家,耐多藥TB、糖尿病合并TB和人類缺陷病毒(HIV)合并TB等患者逐年增多,其臨床癥狀并不典型,即便聯(lián)合多種方法檢測臨床診斷依然困難,是結(jié)核感染者死亡的諸多原因之一[1]。

大多數(shù)TB診斷依賴于細(xì)菌學(xué)結(jié)核分枝桿菌涂片和培養(yǎng),也是診斷TB的金標(biāo)準(zhǔn)[2-3];其中分子生物學(xué)Gene Xpert、TB-DNA檢測快速具有較高的靈敏度和特異度[7-8],但檢測受樣本限制;IGRAs檢測結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激產(chǎn)生γ-干擾素,只能鑒別是否為MTB感染[9-10]。流式CD161檢測技術(shù)在菌陰、HIV合并感染、部分TB患者無痰或兒童可提高輔助診斷[11-12]。另一種基于尿液的生物標(biāo)志物脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)被世界衛(wèi)生組織推薦床旁快速有效,在HIV合并TB患者CD4<200個(gè)/微升,尿液檢出LAM有較好的特異性[13-14]。臨床微創(chuàng)支氣管纖維鏡檢查的開展,更直觀了解MTB引起的肺部病灶,其中病理組織學(xué)檢測和肺泡灌洗液的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)可提高無痰患者、AFB-TB患者的檢出率[15]。然而,即使采用上述多種檢測方法,ATB的檢出率也不足50%,其主要原因?yàn)槭軜颖鞠拗?、高端檢測平臺(tái)無普及優(yōu)勢、價(jià)格高昂、輔助性診斷局限等。這提示對診斷和預(yù)測標(biāo)志物的深入研究是合理的,檢測血清或血漿中的生物標(biāo)志物作為痰標(biāo)本的替代方法,被認(rèn)為是高危人群TB診斷的有效輔助方法[16]。因此,研發(fā)針對ATB的快速,有效的非痰診斷和預(yù)測方法以提高涂陰及不典型ATB診斷是目前面臨的重要挑戰(zhàn)。

MMP是一個(gè)蛋白水解酶家族,屬于鋅依賴性蛋白酶,結(jié)合鏈內(nèi)切酶,具有多種生理作用,在酶催化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[17];MMP的分泌主要受NF-κB、P38和MAPK信號通路的調(diào)節(jié),參與組織細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜各種蛋白分解以及隨之而來的MTB釋放到氣道[18]。破壞細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障,避免導(dǎo)致組織破壞、疾病傳播和死亡的酶[19-20]。MMP和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)是ATB免疫病理學(xué)的潛在調(diào)節(jié)劑[21]。也是肺結(jié)核(PTB)和肺外結(jié)核(EPTB)的非基于痰標(biāo)本的生物標(biāo)志物的候選者[22-24]。另外,本研究基于蛋白芯片檢測的結(jié)果篩選,通過化學(xué)發(fā)光法檢測血漿MMP-8水平建立判斷方法,其檢測結(jié)果更為穩(wěn)定直觀、高效、便捷、特異、準(zhǔn)確、實(shí)用,可為提高TB診斷提供有利支持。

化學(xué)發(fā)光法檢測血漿中MMP-8水平,能有效分辨出ATB患者及HC,其辨別AFB+TB和HC效能的靈敏度、特異度為0.94和0.83,AFB-TB和HC的靈敏度、特異度為0.94和0.76,在區(qū)分AFB+TB和LTBI效能的靈敏度、特異度為0.83和0.98,AFB-TB和LTBI的靈敏度、特異度為0.76和0.98。該檢測技術(shù)在涂陰結(jié)核的陽性率為75.78%,顯著高于其他檢測方法。本研究結(jié)果顯示,在AFB+TB和AFB-TB患者,MMP8檢測均能很好區(qū)分肺結(jié)核和健康人群。但目前臨床患者疾病類型復(fù)雜,包括細(xì)菌性肺炎疾病、非結(jié)核分枝桿菌感染和肺炎合并LTBI等炎癥反應(yīng)與ATB患者非常相似,臨床常常難以區(qū)分LTBI或ATB(特別是AFB-TB者)。MMP-8檢測在AFB+TB和LTBI感染者鑒別中有較高診斷效率;但在AFB-TB和LTBI感染者中鑒別區(qū)分能力的特異性相對略低,可能存在肺組織部分感染或非感染性疾病引起的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的非特異性影響。菌陰結(jié)核者在各結(jié)核檢測方法中比較,MMP-8檢測陽性率乃高于其他方法,在對提高AFB-TB的診斷有輔助效能。

綜上所述,本研究結(jié)果表明以結(jié)核分枝桿菌多肽刺激血漿MMP-8為標(biāo)志物檢測可作為提高無痰或AFB-TB陽性率的輔助診斷技術(shù),并在區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和LTBI者具有較好的輔助效能。未來臨床抗結(jié)核治療用藥指導(dǎo)和EPTB的預(yù)測有待進(jìn)一步研究。本研究為小樣本量數(shù)據(jù)結(jié)果,還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心檢測進(jìn)行下一步研究。