循環(huán)腫瘤細胞形態(tài)診斷參數(shù)測量方法的研究進展

王偉浩 馬 瑩 李 勝，

1. 山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院普外科，山東 泰安 271016；2. 山東省藥物研究院研發(fā)部，山東 濟南 250014

循環(huán)腫瘤細胞（circuiting tumor cells， CTCs）具有細胞及細胞核體積大、細胞核深染、核膜增厚、核偏位等惡性細胞形態(tài)特征，其形態(tài)與正常血細胞有所差異。在腫瘤早期，通過細胞化學染色，光鏡下依據(jù)細胞病理學原理對異常形態(tài)細胞進行判讀是目前主要鑒定CTCs的方法之一。

光鏡下判別CTCs 細胞病理學鑒定標準主要包含以下幾點：細胞或細胞核直徑，核質比，細胞核性狀與染色情況，核仁、核膜性狀等，其中細胞直徑、細胞核直徑、核質比定量結果是各診斷標準中的關鍵指標。目前，CTCs 尚無統(tǒng)一形態(tài)診斷標準，各診斷標準均未對CTCs 形態(tài)診斷參數(shù)測量方法進行介紹，因此，形態(tài)診斷參數(shù)測量方法的不統(tǒng)一可能是導致CTCs形態(tài)診斷標準差異的原因之一。

本研究從細胞學、組織病理學中細胞形態(tài)參數(shù)測量的方法角度，對目前CTCs 形態(tài)診斷參數(shù)測量方法進行評價，提出CTCs 形態(tài)診斷參數(shù)測量方法建議。

1 CTCs核質比測量方法現(xiàn)狀

核質比是細胞核體積與細胞質的體積比（細胞核體積/細胞體積-細胞核體積）［1］，用于表示細胞核的相對大小。在CTCs 形態(tài)診斷標準中，核質比是重要診斷參數(shù)。

1.1 細胞學中細胞核質比測量方法

在涂片細胞學中，細胞核質比測量方法有細胞核體積/細胞質體積，細胞核面積/細胞質面積2種方法。由于鏡下觀察涂片細胞為二維平面，因此準確測量細胞/細胞核體積有一定困難。目前，常用的細胞體積測量方法有體視學測量法和公式計算法。體視學是由二維信息推導出三維結構信息的一個新興學科，可采用體視學參數(shù)構建對象三維形態(tài)。2011 年，胡納等［2］采用體視學點計數(shù)方法對腫瘤細胞B16/F10、B16/Vector 及B16GPR4 各20 組的共聚焦顯微鏡圖像進行測量，定量分析了其三維形態(tài)參數(shù)的差異，成功得到細胞核體積。

公式計算法是通過鏡下測量細胞面積，通過等面積圓直徑方法計算細胞體積或測量細胞長徑、短徑，以橢球體積公式計算體積［3-5］，2種方法根據(jù)細胞形態(tài)不同進行選擇。

目前，采用熒光染色和共聚焦顯微鏡二維測量貼壁細胞細胞核與細胞質的面積比是目前測量核質比的常用方法［6-8］。此外，細胞核直徑/細胞直徑也是計算核質比方法之一［9］，但文獻報道較少，其準確性差。

1.2 組織病理學中細胞核質比測量方法

同涂片細胞學，組織細胞學中核質比測量方法也分為細胞核體積/細胞質體積、細胞核面積/細胞質面積2 種方法。在組織細胞學中，細胞體積可通過連續(xù)切片可以獲取細胞厚度，再基于體視學原理的轉矩測量法［10］、點取截距法［11］、核距法［12-16］進行測量。其中，核距法是基于體視學原理的細胞體積測量方法中最為常用的測量方法。此外，細胞核面積/細胞質面積因其簡便性，在組織學細胞學核質比測量方法中也有較多應用［8，17］。

1.3 CTCs核質比測量方法

既往文獻報道的CTC 核質比測量方法有2 種：細胞核面積/細胞質面積和細胞核面積/細胞面積。2014年，Park等［18］采用細胞核面積/細胞質面積作為核質比測量方法測量523個去勢抵抗性前列腺癌患者CTC，其測量結果發(fā)現(xiàn)，核質比中位數(shù)為1.43；課題組既往采用細胞核面積/細胞面積方法計算61個腎癌CTC 核質比，其核質比為0.711 ± 0.104。因此，目前CTCs 核質比測量方法均不符合標準核質比測量方法，應采用細胞核體積/細胞質體積測量CTCs核質比。

標準核質比的計算需要獲取細胞核及細胞體積，但體積的測量在鏡下難以獲取，體視學是一種基于數(shù)學幾何原理的、快速的、無偏的、非侵入性的定量測量方法，但其測量過程復雜，甚至需依托特殊設備，所以其測量效率低，不易實現(xiàn)。相較于體視學，通過球體體積公式估算細胞/細胞核體積是一種易于操作的方法。1997 年，夏潮涌等［16］使用TIGER細胞圖像分析儀采用5種測量和計算體積的方法，比較它們對初級精母細胞組織切片上細胞核體積測量結果的可靠性和影響。結果發(fā)現(xiàn)，核距法與等面積圓直徑所計算出細胞核體積無明顯差異，其余（隨機Feret直徑、等周長圓直徑、最小外截圓直徑）方法計算的細胞核體積值明顯大于等面積圓直徑和核距計算的體積值。由于CTCs 鏡下一般呈橢圓形，采用等面積圓直徑估算CTCs 體積可能存在誤差。高澤霞等［3］、張瀾瀾等［4］、江振華等［5］將細胞短徑作為細胞厚度成功測量了鯰魚細胞體積。因此將細胞短徑作為細胞厚度，通過橢球體積公式計算可能是CTCs體積有效且便于操作的測量方法。

2 CTCs細胞及核長徑測量方法現(xiàn)狀

目前尚無文獻單獨報道CTCs 細胞長徑、細胞核長徑測量方法。課題組既往通過圖像處理軟件ImageJ 中直線工具人工判讀長徑位置，測量直線長度的方法測量細胞及核長徑。由于此方法需要人工判讀，因此結果存在一定主觀因素。在調研長徑測量方法過程中發(fā)現(xiàn)有文獻將Feret 直徑作為描述細胞直徑大小的參數(shù)，因此對測量Feret 直徑作為CTCs細胞及細胞核長徑測量方法可行性進行分析。

2.1 Feret直徑定義

Feret 直徑是一個幾何參數(shù)，也稱為卡尺直徑，是物體輪廓任意選定角度相對兩側的兩條平行切線之間的距離，一般用于光學顯微鏡測量不規(guī)則形狀顆粒的大小［19-20］，是顯微鏡法測量幾何學粒徑的常用方法［21］。與廣義上的直徑不同，F(xiàn)eret直徑指的是一組直徑，包括最大、最小Feret直徑，即給定方向上測量的2 個最遠或最近點之間的距離。Feret 直徑也可以是多個方向的平均值，故可以稱為平行于某個固定方向的物體相對兩側的兩條切線之間的平均距離［22］。

Feret直徑是基于物體的二維圖像，與其他測量方法相比，使用Feret直徑的主要優(yōu)勢在于與物體的真實物理直徑相對應［22］。大多數(shù)圖像分析軟件如ImageJ、Image pro plus 等都含有測量Feret 直徑的功能，可以通過快速、準確自動測得其數(shù)值。但需要注意的是，2個具有相同F(xiàn)eret 直徑的物體可能具有非常不同的形狀［23］。

2.2 Feret直徑在細胞學中的應用

在細胞學中，F(xiàn)eret直徑常用于量化細胞及顯微結構的尺寸，如描述腫瘤細胞［21-23］、線粒體［24-26］、血細胞［27-30］、神經(jīng)細胞［31-33］、骨細胞［33-37］的大小。

2.3 Feret直徑在組織病理學中的應用

在組織病理學中，F(xiàn)eret直徑廣泛應用于描述肌纖維橫截面尺寸［38-48］，且最小Feret’s直徑（肌纖維相對邊界處平行切線的最小距離）作為肌纖維橫截面測量參數(shù)，證明了最小Feret直徑能夠最大程度地降低切片角度帶來的誤差［48］。此外，在影像組學中Feret直徑也常用于描述病灶大?。?9-58］。

2.4 Feret直徑在CTCs形態(tài)診斷中的應用

截止到2022 年12 月，以Feret 直徑、CTCs 為關鍵詞全文檢索Pubmed、CNKI數(shù)據(jù)庫，未檢索到相關文獻。由于在光鏡下觀察同一個細胞，其最大Feret直徑是固定且唯一的，用其判斷細胞直徑更為客觀，可以有效避免不同觀察者間的差異，因此考慮通過測量最大Feret 直徑是客觀、準確測量CTCs 細胞及細胞核直徑的方法。

3 展 望

本文通過對涂片細胞學、組織細胞學中細胞形態(tài)參數(shù)測量方法進行綜述，提出了采用測量Feret直徑作為CTCs細胞及細胞核直徑測量方法的建議，

下一步可用以上2種測量方法測量CTCs 細胞/細胞核直徑、核質比，對比既往CTCs 形態(tài)測量結果，重新總結CTCs 形態(tài)規(guī)律，基于新的測量方法下的測量結果改良CTCs形態(tài)診斷標準。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突