GC-MS/MS法測(cè)定發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量

陳大鵬

摘 要：本文建立了氣相色譜-一三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的方法。該測(cè)定方法同時(shí)考慮到液體基質(zhì)與固體基質(zhì)，樣品中加入D5-氨基甲酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行結(jié)果監(jiān)測(cè)，并通過(guò)該方法對(duì)市售的8種發(fā)酵食品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，氨基甲酸乙酯線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%，選取的典型液體基質(zhì)與固體基質(zhì)的平均回收率均超過(guò)了100%。該方法可以準(zhǔn)確測(cè)定市售發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量，整體準(zhǔn)確性較高。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵食品；氣相色譜 - 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法；氨基甲酸乙酯

Determination of Ethyl Carbamate Content in Fermented Foods by GC-MS/MS

CHEN Dapeng

（Heilongjiang Agricultural Vocational and Technical College， Jiamusi 154000， China）

Abstract： This article establishes a method for the determination of ethyl carbamate in fermented food using gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry. This measurement method takes into account both liquid and solid matrices， and adds D5 aminoethyl formate as an internal standard to the sample. The results are monitored using a multi reaction monitoring method， and eight commercially available fermented foods are measured using this method. The results showed that the linear relationship of ethyl carbamate was good， with a correlation coefficient of 0.999 9. The relative standard deviation of peak area was 1.57%， and the average recovery rates of the selected typical liquid and solid matrices exceeded 100%. This method can accurately determine the content of ethyl carbamate in commercially available fermented foods， with overall high accuracy.

Keywords： fermented foods; gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry; ethyl carbamate

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）是發(fā)酵食品在發(fā)酵與儲(chǔ)存過(guò)程中形成的污染物，屬于2A類(lèi)致癌物，廣泛存在于黃酒、醬油等食品中[1]。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定》（GB 5009 223—2014）針對(duì)食品中EC的測(cè)定制定了詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)，表明了國(guó)家對(duì)其測(cè)定工作的重視程度[2]。目前，EC測(cè)定方法主要有氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）、分子印跡法和免疫分析法等，而上述方法存在定量不準(zhǔn)確等問(wèn)題[3]?？紤]到EC廣泛存在于各類(lèi)發(fā)酵食品中，本文提出采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行發(fā)酵食品中EC的測(cè)定，了解發(fā)酵食品中EC的污染情況，從而識(shí)別其食品安全風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)消費(fèi)者合理飲食[4]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白酒、料酒、醬油、醋、腐乳、發(fā)酵乳、豆豉以及面包，市售。

Agilent 7890A/7000bGC-MS/MS三重四極桿氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Sartorms CPA225D電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；TDZ5-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；HP-5016SY氮吹儀，上海濟(jì)成分析儀器有限公司；默克Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；MS3基本型渦旋混合器，德國(guó)IKA公司；ST-700A攪碎機(jī)，常州國(guó)華電器有限公司。

EC標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯，美國(guó)TEDIA公司；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈，美國(guó)Burdick-Jackson公司；硅藻土萃取柱，天津博納艾杰爾科技有限公司；D5-氨基甲酸乙酯，CDNISOTOPES。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱(chēng)取10 mg EC標(biāo)準(zhǔn)品于10.0 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用同樣的方式制備質(zhì)量濃度為1 000 μg·L-1的D5-氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)使用液。將不含有EC成分的同基質(zhì)物質(zhì)作為空白樣品，適量吸取質(zhì)量濃度為1 000 μg·L-1的混合對(duì)照品中間液，采用氮吹儀吹至近干，制備成1 mg·mL-1基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別吸取0.01 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL和3.20 mL中間液，采用乙酸乙酯定容，制備成質(zhì)量濃度為1 μg·L-1、l0 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、160 μg·L-1和320 μg·L-1的EC標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3 樣品前處理

液體基質(zhì)：樣品搖勻后稱(chēng)取1 g放入10 mL試管中，加入25 μL 10 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)中間液，除了醬油以外，其他樣品均加入0.3 g氯化鈉，渦旋振蕩5 s，溶解混勻后放入SPE小柱，靜置10 min后，采用正己烷進(jìn)行淋洗，之后采用乙醚-乙酸乙酯進(jìn)行洗脫處理，收集到的洗脫液于40 ℃以下采用氮吹儀吹至近干，并用甲醇定容，制備成供試液。

固體及半固體基質(zhì)：樣品絞碎后稱(chēng)取1 g放入10 mL試管中，加入25 μL 10 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)中間液，渦旋振蕩5 s后，加入0.5 g氯化鈉、1.5 mL乙腈和0.5 mL超純水，渦旋振蕩120 s后，3 000 r·min-1離心15 min，取1 mL上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待分析。

1.4 儀器條件

（1）色譜條件。毛細(xì)管色譜柱，DB-INNOWAX

（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)出口溫度：190 ℃；載氣：高純氮?dú)?；進(jìn)樣方式：脈沖不分流，0.9 mL·min-1的恒流模式；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：50 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1升溫至150 ℃保持2 min，再以30 ℃·min-1升溫至250 ℃保持5 min。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電子轟擊電離；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線(xiàn)溫度：250 ℃；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式；溶液延遲：5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 碰撞能優(yōu)化

采用單四極桿質(zhì)譜獲取到EC的特征粒子包括m/z 44、m/z 62、m/z 74、m/z 89，實(shí)際樣品處理后進(jìn)樣，最終選取豐度大且干擾小的m/z 62作為母離子，開(kāi)展碰撞能優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在10～40 eV（每10 eV設(shè)定一個(gè)等級(jí)）的不同碰撞能下進(jìn)樣，結(jié)果如表1所示。在20 eV碰撞能下可以獲取最大豐度，子離子分別為m/z 44、m/z 44.9，豐度比為100∶33.5。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 線(xiàn)性關(guān)系、檢出限與定量限

分別以對(duì)照品濃度與對(duì)應(yīng)峰面積為橫縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，獲得的標(biāo)曲回歸方程為y=0.007 8x-0.023 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，接近于1，線(xiàn)性關(guān)系良好。分別以3倍信噪比和10信噪比為基準(zhǔn)，進(jìn)行化合物檢出限與定量限測(cè)定，得到EC檢出限為3 ng·mL-1，定量限為10 ng·mL-1。

2.2.2 穩(wěn)定性

將制備好的供試品溶液在室溫內(nèi)進(jìn)行首次測(cè)定，之后分別在2 h、4 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)樣測(cè)定，并記錄相應(yīng)的EC峰面積，通過(guò)EC峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）大小反映測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。測(cè)定結(jié)果顯示，不同時(shí)間段下EC峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%，小于國(guó)際聯(lián)合委員會(huì)（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）提出的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)＜2.0%的要求，說(shuō)明供試品在48 h內(nèi)始終保持穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

精密稱(chēng)取已測(cè)定含量的樣品，加入內(nèi)標(biāo)中間液（液體基質(zhì)100 μL，固體基質(zhì)500 μL），制備加標(biāo)回收率測(cè)定樣品溶液，針對(duì)液體基質(zhì)（料酒）和固體基質(zhì)（面包）進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。可以看出，液體基質(zhì)與固體基質(zhì)的平均回收率分別為100.17%、100.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本文建立的方法對(duì)市售白酒、料酒、醬油、醋、腐乳、發(fā)酵乳、豆豉和面包8種發(fā)酵食品中的EC含量進(jìn)行測(cè)定，每種發(fā)酵食品各10份，測(cè)定結(jié)果取平均值。如表3所示，市售發(fā)酵食品中EC的平均含量為3.44～84.63 ng·g-1。在各類(lèi)市售發(fā)酵食品中，腐乳中的EC平均含量最高，為84.63 ng·g-1，且檢測(cè)出的最高EC含量達(dá)到了246.82 ng·g-1，檢出率達(dá)到了100.00%。在日常飲食中，可將腐乳作為風(fēng)味調(diào)味品使用，但不宜過(guò)多食用，以避免其對(duì)人體造成傷害。酒類(lèi)發(fā)酵食品中EC平均含量也較高，白酒與料酒中的EC平均含量分別為48.24 ng·g-1與20.87 ng·g-1，檢出率均達(dá)到了100.00%。且白酒中的EC含量相對(duì)更高，考慮到白酒的度數(shù)較高，日常飲食中一般不會(huì)出現(xiàn)過(guò)度飲用的現(xiàn)象，且EC處于酒類(lèi)國(guó)際安全限量標(biāo)準(zhǔn)以?xún)?nèi)，對(duì)人體幾乎不會(huì)造成傷害[5]。而料酒的主要功能是調(diào)味，其含量與醬油、醋等日常家用調(diào)味品相近，過(guò)多食用的概率較小，整體較為安全。豆豉、發(fā)酵乳、面包等發(fā)酵食品中的EC平均含量均處于較低水平，檢出率相對(duì)較低。綜上，本文選取的市售發(fā)酵食品中的EC含量整體處于合理范圍，食用量大的發(fā)酵食品EC含量較低，而EC含量較高的發(fā)酵食品多為調(diào)味品或食用量較小的白酒飲品，整體安全性可以得到保障。

3 結(jié)論

EC污染是近些年食品領(lǐng)域面臨的主要安全問(wèn)題。本研究提出了將GC-MS/MS法應(yīng)用到發(fā)酵食品中EC含量的測(cè)定工作中，通過(guò)方法學(xué)評(píng)價(jià)驗(yàn)證了該方法在測(cè)定發(fā)酵食品中EC含量的有效性。同時(shí)，采用GC-MS/MS法對(duì)8類(lèi)市售發(fā)酵食品中的EC含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示，各類(lèi)發(fā)酵食品均有一定量的EC，以腐乳EC含量最高，豆豉、發(fā)酵乳、面包的EC含量低，整體表現(xiàn)出食用量與EC含量呈現(xiàn)反比的關(guān)系，即食用量大的豆豉、發(fā)酵乳、面包EC含量相對(duì)較低，而食用量較小，往往作為調(diào)味品的腐乳、白酒與日用調(diào)味品的EC含量相對(duì)較高，說(shuō)明國(guó)內(nèi)市售發(fā)酵食品的EC含量處于合理范圍，整體安全性較高。

參考文獻(xiàn)

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