芽孢桿菌35家族β-半乳糖苷酶的性質(zhì)及其在合成低聚半乳糖中的應(yīng)用

王建宇, 李 婷, 李 敬, 江正強(qiáng), 閆巧娟,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院/中國(guó)輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100083;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院, 北京 100083)

低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)為乳糖的非還原端半乳糖上連接不同數(shù)量(2～8個(gè))的半乳糖,是一種功能性低聚糖,常作為健康食品原料廣泛應(yīng)用于食品等行業(yè),多年來(lái)備受關(guān)注[1-2]。GOS除具有益生活性外,還有預(yù)防蛀牙和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等功效[1,3]。GOS的安全性已得到廣泛認(rèn)可,如美國(guó)已將其作為公認(rèn)安全的食品原料,我國(guó)也批準(zhǔn)其為營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑和新食品原料。GOS與人乳中的人乳寡糖在結(jié)構(gòu)與功能上具有一定的相似性,可被人體內(nèi)的腸道微生物特異性利用,已批準(zhǔn)用于嬰幼兒配方奶粉中[4]。

酶法合成GOS是目前研究最多的GOS合成方法,也是工業(yè)化生產(chǎn)GOS的方法[4]。β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一種糖苷水解酶,既可以催化糖類(lèi)化合物中非還原端β-半乳糖殘基的水解,也能夠以高濃度乳糖作為底物,通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷作用合成GOS。β-半乳糖苷酶合成GOS的過(guò)程為,β-半乳糖苷酶首先水解乳糖,然后利用其轉(zhuǎn)糖基活性將半乳糖轉(zhuǎn)移至不同的糖基受體上,從而形成GOS[1,5]。β-半乳糖苷酶廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物中。微生物具有來(lái)源廣、繁殖速度快以及生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn),是β-半乳糖苷酶的主要來(lái)源[6]。工業(yè)化生產(chǎn)GOS所用的β-半乳糖苷酶多數(shù)來(lái)源于乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)以及環(huán)狀芽孢桿菌等[1],但是大多數(shù)仍存在GOS產(chǎn)率低的問(wèn)題[7]。因此,發(fā)掘酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良且轉(zhuǎn)糖苷活性高的β-半乳糖苷酶至關(guān)重要。

芽孢桿菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶性質(zhì)優(yōu)良,但是多數(shù)研究集中于β-半乳糖苷酶的水解活性[8-12]。另外,芽孢桿菌β-半乳糖苷酶也具有較好的GOS合成能力,如已有報(bào)道,芽孢桿菌[13]和巴倫葛茲類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillusbarengoltzii)[14]β-半乳糖苷酶均能夠合成GOS,產(chǎn)率分別為36%和47.9%,其中,多數(shù)GH35家族β-半乳糖苷酶合成GOS的產(chǎn)率較高,可達(dá)40%[15-17]。然而,迄今利用芽孢桿菌β-半乳糖苷酶合成GOS的報(bào)道仍舊較少,不足以滿足工業(yè)化大量和高效生產(chǎn)GOS的需求。因此,從芽孢桿菌中發(fā)掘高效合成GOS的新型β-半乳糖苷酶可以為工業(yè)化生產(chǎn)GOS提供更多的選擇。

本研究擬從芽孢桿菌基因組中發(fā)掘新的糖苷水解酶35家族β-半乳糖苷酶基因。將該基因在大腸桿菌中表達(dá),研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì),并利用該酶制備GOS,以期為GOS的酶法合成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α和大腸桿菌 BL21 (DE3),北京博邁德生物技術(shù)公司;限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶,美國(guó)NEB公司;TransStart FastpfuDNA 聚合酶和ExTaq DNA聚合酶,北京全式金生物技術(shù)有限公司;人工合成糖苷[oNP-β-galactopyranoside(β-oNPGal)、pNP-β-galactopyranoside(β-pNPGal)、pNP-β-fucopyranoside(pNP-Fuc)、pNP-β-glucopyranoside(β-pNPGlu)、pNP-β-mannopyranoside(β-pNPMan)、pNP-β-xylopyranoside(β-pNPXyl)、pNP-β-N-acetylglucosaminide(β-pNPGlcNAc)、pNP-α-galactopyranoside(α-pNPGal)和pNP-α-glucopyranoside(α-pNPGlu)],美國(guó)Sigma公司;標(biāo)準(zhǔn)品(乳糖、葡萄糖和半乳糖),上海源葉生物科技有限公司。其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler型PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀和Power Pac BasicTM型電泳儀,美國(guó)Bio-Rad公司;TU-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝科技股份有限公司;KTA型蛋白純化系統(tǒng),美國(guó)GE公司;1260 Infinity型高效液相色譜儀,美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1β-半乳糖苷酶基因的克隆與表達(dá)

芽孢桿菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A)序列從NCBI (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)上獲得,由上海擎科生物科技有限公司合成。根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)BABgal35A上游引物(5′-GAATTCATGTTAACGTTTAATGAAAAAT CATTTTT-3′)和下游引物(5′-GCGGCCGCTTATCCTAAAACGGGCGTATCAA-3′)。上下游引物分別包含NdeⅠ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)(下劃線表示),以合成的BABgal35A基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃,5 min;94 ℃,30 s;54 ℃,30 s;72 ℃,1 min;34個(gè)循環(huán);72 ℃,5 min。凝膠回收的PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體(Invitrogen公司)用NdeⅠ和BamH Ⅰ雙酶切,構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中,篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子和提取重組質(zhì)粒pET-28a-BABgal35A。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中,于37 ℃培養(yǎng) 12 h。 挑取單菌落接種至15 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h作為種子液。種子液按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種至300 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)菌體密度OD600達(dá)0.6～0.8后,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,在20 ℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。

1.3.2β-半乳糖甘酶的純化

發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心3 min,收集菌體細(xì)胞并用緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,pH值為8.0)懸浮細(xì)胞。懸浮液超聲破壁后,10 000 r/min離心10 min,收集上清液即為粗酶液。粗酶液上樣到預(yù)先用緩沖液A平衡的Ni-IDA(1 cm×10 cm)上,在蛋白純化系統(tǒng)上用緩沖液A和緩沖液B(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,200 mmol/L咪唑,pH值為8.0)以-1 mL/min的流速對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行 20～200 mmol/L梯度咪唑的線性洗脫。收集具有β-半乳糖苷酶活性的洗脫液,在磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L,pH值為8.0)中透析過(guò)夜,采用 SDS-PAGE 法分析蛋白純度。將該蛋白重組酶命名為BABgal35A。

1.3.3BABgal35A酶活力和蛋白含量的測(cè)定

β-半乳糖苷酶的酶活力測(cè)定以225 μL 50 mmol/L 乙酸鹽緩沖液(pH值為5.0)配制的5 mmol/L β-oNPGal為底物,加入25 μL稀釋的酶液,55 ℃反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后,加入750 μL Na2CO3(2 mol/L)終止反應(yīng),測(cè)定OD410值。酶活力單位定義:在pH值為5.0和溫度為55 ℃條件下,每分鐘水解β-oNPGal產(chǎn)生1 μmoloNP所需酶量,為1個(gè)酶活力單位(U)。

蛋白含量參照Lowry法測(cè)定[18],以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.4BABgal35A的酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.3.4.1 最適pH值和酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定

利用不同pH值(3.0～9.0)的緩沖液(50 mmol/L)配制5 mmol/L的β-oNPGal,所用緩沖液包括檸檬酸鹽緩沖液(pH值為3.0～6.0)、乙酸鹽緩沖液(pH值為4.0～6.0)、MES 緩沖液(pH值為5.5～6.5)、磷酸鹽緩沖液(pH值為6.0～8.0)和Tris-HCl 緩沖液(pH值為7.0～9.0)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定不同pH值下的酶活力。以最高酶活力為100%,計(jì)算各pH值下的相對(duì)酶活。酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定:用不同pH值的緩沖液將酶液稀釋,在40 ℃保溫30 min,立即冰水浴30 min,按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定殘余酶活,以未處理的酶液酶活力為100%,分別計(jì)算各pH值下的相對(duì)酶活。

1.3.4.2 最適溫度、熱穩(wěn)定性以及半衰期的測(cè)定

用50 mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH值為5.0)配制5 mmol/L的β-oNPGal,測(cè)定不同溫度(20～75 ℃)下的酶活力。以最高酶活為100%,分別計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活。熱穩(wěn)定性的測(cè)定:用50 mmol/L 乙酸鹽緩沖液(pH值為5.0)稀釋酶液并置于不同溫度(20～55 ℃)下保溫30 min,立即冰水浴30 min,按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定殘余酶活;以未處理的酶液酶活力為100%,分別計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活力。半衰期的測(cè)定:用50 mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH值為5.0)稀釋酶液,分別在40、45、50 ℃下保溫,在不同時(shí)間點(diǎn)取樣后立即冰水浴30 min,在最適條件(55 ℃,pH值為5.0)下測(cè)定殘余酶活;以未處理酶液的酶活力為100%,分別計(jì)算各溫度處理后的相對(duì)酶活,酶活降低至50%所需的時(shí)間即為半衰期。

1.3.5BABgal35A的底物特異性與動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

1.3.5.1 底物特異性的測(cè)定

分別以人工合成糖苷(β-oNPGal、β-pNPGal、pNP-Fuc、β-pNPGlu、β-pNPMan、β-pNPXyl、β-pNPGlcNAc、α-pNPGal和α-pNPGlu)和乳糖為底物測(cè)定BABgal35A的底物特異性。人工合成糖苷的酶活按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。乳糖的測(cè)定參照葡萄糖氧化酶法,即用50 mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH值為5.0)配制質(zhì)量濃度為50 g/L的乳糖并加入稀釋的酶液,55 ℃反應(yīng)10 min,葡萄糖的含量利用葡萄糖氧化酶試劑盒測(cè)定。酶活力單位定義:每分鐘水解人工合成糖苷或乳糖產(chǎn)生1 μmoloNP/pNP或葡萄糖所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。以β-oNPGal為底物時(shí)的酶活力為100%,計(jì)算不同底物下酶活力的相對(duì)值。

1.3.5.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

用50 mmol/L pH值5.0 的乙酸鹽緩沖液配制底物濃度為 0.4～4.0 mmol/L 的β-oNPGal,按照標(biāo)準(zhǔn)方法于55 ℃ 反應(yīng)5 min后測(cè)定其酶活力,通過(guò)GraFit軟件計(jì)算出米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

1.3.6BABgal35A合成低聚半乳糖條件的優(yōu)化

在50 mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH值為5.0)體系下,以乳糖為底物,研究底物濃度、加酶量、反應(yīng)溫度和時(shí)間4個(gè)因素對(duì)BABgal35A合成GOS能力的影響。選擇質(zhì)量濃度為300～500 g/L的乳糖,加入 2 U/mL 的酶液,35 ℃反應(yīng)12 h后,沸水浴5 min。確定最適乳糖濃度后,其他條件不變,優(yōu)化BABgal35A合成GOS的加酶量(1～10 U/mL)。反應(yīng)溫度的優(yōu)化是在最優(yōu)乳糖濃度和最適加酶量的條件下進(jìn)行的,在不同溫度(25～45 ℃)下反應(yīng)12 h。利用 50 mmol/L 乙酸鹽緩沖液(pH值為5.0)配制質(zhì)量濃度為400 g/L的乳糖溶液,加入5 U/mL的BABgal35A,40 ℃反應(yīng)24 h,分別在不同時(shí)間點(diǎn)取樣,根據(jù)式(1)計(jì)算GOS產(chǎn)率。采用高效液相色譜法分析樣品,檢測(cè)條件參照文獻(xiàn)[14]。

GOS產(chǎn)率 =(M-m)/M×100%。

(1)

式(1)中,M,初始乳糖質(zhì)量濃度,g/L;m,不同時(shí)間點(diǎn)樣品的乳糖、葡萄糖以及半乳糖的質(zhì)量濃度之和,g/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖片處理,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 BABgal35A的克隆與序列分析

芽孢桿菌來(lái)源的BABgal35A全長(zhǎng)為1 740 bp,編碼579個(gè)氨基酸。利用ExPASy ProtParam tool預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量和等電點(diǎn),分別為66.6 kDa和4.99。NCBI-BLAST分析表明(圖1),BABgal35A與環(huán)狀芽孢桿菌來(lái)源的GH35家族β-半乳糖苷酶(Genbank no. 4MAD_A)[19]同源性最高,為 79.9%。其次,與候選菌門(mén)BRC1細(xì)菌HGW-BRC1-1(candidate division BRC1bacteriumHGW-BRC1-1, Genbank no. PKO20086.1)[20]、厚壁菌門(mén)細(xì)菌(Firmicutesbacterium, Genbank no. HHV43508.1)[21]以及梭菌目細(xì)菌(Clostridialesbacterium, Genbank no. HBG75975.1)[22]來(lái)源的β-半乳糖苷酶的同源性分別為56.3%、56.0%和55.4%。因此,BABgal35A可能是一個(gè)新型的GH35家族β-半乳糖苷酶。

多重序列比對(duì)的序列分別為BABgal35A及環(huán)狀芽孢桿菌(4MAD_A)、候選菌門(mén)BRC1細(xì)菌HGW-BRC1-1(PKO20086.1)、厚壁菌門(mén)細(xì)菌(HHV43508.1)和梭菌目細(xì)菌(HBG75975.1)來(lái)源的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列。相同的殘基在紅色背景上顯示為白色,保守殘基在白色背景上顯示為紅色。圖1 BABgal35A與其他β-半乳糖苷酶氨基酸序列的多重序列比對(duì)Fig.1 Multiple alignment of amino acid sequences of BABgal35A and other β-galactosidases

2.2 BABgal35A的表達(dá)和純化分析

BABgal35A在大腸桿菌中可溶表達(dá)。粗酶液和經(jīng)過(guò)Ni-IDA純化后的酶液組成的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖2。由圖2可知,純酶的分子質(zhì)量約為60 kDa,與預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量接近。BABgal35A的純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1顯示,酶活力的回收率為88.3%,純化倍數(shù)為5.0。

表1 BABgal35A純化結(jié)果

泳道M為高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白,泳道1為粗酶液,泳道2為純酶。圖2 BABgal35A的純化電泳分析結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified BABgal35A

目前已報(bào)道的β-半乳糖苷酶分子質(zhì)量一般在50～180 kDa,BABgal35A的分子質(zhì)量約為60 kDa,與蜜源芽孢桿菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶(57 kDa)[23]同屬于低分子質(zhì)量的β-半乳糖苷酶。BABgal35A的分子質(zhì)量低于大多數(shù)GH 35家族的β-半乳糖苷酶,如土壤宏基因組的Bgal_144-3(65.6 kDa)和Bgal_375(112 kDa)[24],以及產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)31B來(lái)源的3個(gè)β-半乳糖苷酶[25](115、110、120 kDa)。

2.3 BABgal35A的酶學(xué)性質(zhì)分析

BABgal35A的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果見(jiàn)圖3。BABgal35A的最適pH值為5.0[圖3(a)],用不同緩沖液處理30 min后,該酶在pH值為4.5～8.0的緩沖液中仍能保持80%以上的酶活力[圖3(b)]。該酶的最適溫度為55 ℃[圖3(c)],在20～45 ℃處理30 min,殘余酶活力仍高于80%[圖3(d)]。在不同溫度下處理酶,測(cè)得該酶在40、45、50 ℃的半衰期分別為605、85、15 min[圖3(e)]。

圖3 BABgal35A的酶學(xué)性質(zhì)Fig.3 Enzymatic properties of BABgal35A

大多數(shù)微生物來(lái)源的β-半乳糖苷酶最適pH值為3.0～8.5[6],其中,芽孢桿菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶最適pH值多數(shù)在中性范圍內(nèi)(6.0～8.0)[8-13]。GH 35家族的β-半乳糖苷酶最適pH值大多在酸性范圍內(nèi),本研究中,BABgal35A的最適pH值為5.0[圖3(a)],與土壤宏基因組[24]和產(chǎn)黃青霉菌31B[25]來(lái)源GH35家族的Bgal_137和PcBGAL35B最適pH值相同,低于Bgal_144-3(pH值為6.0)和PcBGAL35C(pH值為5.5)的最適pH值。BABgal35A在pH值為4.5～8.0時(shí),40 ℃處理30 min仍保持80%以上的酶活力[圖3(b)],具有較寬的酸堿穩(wěn)定范圍,優(yōu)于巴倫葛茲類(lèi)芽孢桿菌(pH值為6.0～8.0)[14]、阿耶波多氏芽孢桿菌(pH值為5.0～7.0)[10]和米曲霉(pH值為5.0～7.5)[26]等來(lái)源的β-半乳糖苷酶。該酶最適溫度為55 ℃[圖3(c)],在20～45 ℃保持穩(wěn)定[圖3(d)]。已報(bào)道的β-半乳糖苷酶最適溫度在20～105 ℃,BABgal35A的最適溫度處于中等水平,比巴倫葛茲類(lèi)芽孢桿菌(45 ℃)[14]來(lái)源的β-半乳糖苷酶要高,低于芽孢桿菌(60 ℃)[13]來(lái)源的β-半乳糖苷酶。不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性差異較大,BABgal35A的熱穩(wěn)定性范圍比米曲霉(<40 ℃)[26]和乳酸克魯維酵母(<40 ℃)[27]來(lái)源的β-半乳糖苷酶寬,與巴倫葛茲類(lèi)芽孢桿菌(<45 ℃)[14]來(lái)源的β-半乳糖苷酶相近。而蜜源芽孢桿菌[23]來(lái)源的β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性更好,在70 ℃以下保持穩(wěn)定。

BABgal35A的底物特異性分析結(jié)果見(jiàn)表2。在最適條件下,該酶對(duì)β-oNPGal的水解活性最高(100%),其余依次為β-pNPGal、pNP-Fuc和乳糖,對(duì)其他底物沒(méi)有水解活性。BABgal35A對(duì)β-oNPGal的Km和Vmax值分別為1.14 mmol/L和21.53 μmol/(min·mg)。BABgal35A對(duì)3種人工底物具有水解活性,同時(shí)具有β-半乳糖苷酶和巖藻糖苷酶活性,相較于多數(shù)β-半乳糖苷酶具有優(yōu)勢(shì)。如巴倫葛茲類(lèi)芽孢桿菌[18]和深海交替單胞菌ML52(deep-sea BacteriumAlteromonassp. ML52)[28]來(lái)源的β-半乳糖苷酶都只具有β-半乳糖苷酶活性而不具有巖藻糖苷酶活性。因此,BABgal35A具有廣泛的底物特異性,應(yīng)用前景廣闊。

表2 BABgal35A的底物特異性

2.4 BABgal35A合成低聚半乳糖的優(yōu)化結(jié)果

乳糖濃度、加酶量、反應(yīng)溫度以及時(shí)間對(duì)BABgal35A合成GOS產(chǎn)率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度為400 g/L時(shí),GOS產(chǎn)率(26%)達(dá)到最高[圖4(a)]。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為400 g/L的乳糖時(shí),GOS的產(chǎn)率隨著加酶量的增加先快速增加而后出現(xiàn)明顯下降,5 U/mL是BABgal35A合成GOS的最適加酶量[圖4(b)]。溫度顯著影響GOS的產(chǎn)率,當(dāng)溫度從25 ℃提高到40 ℃時(shí),GOS的產(chǎn)率呈上升趨勢(shì),而進(jìn)一步提高溫度,GOS的產(chǎn)率下降,因此,GOS的產(chǎn)率在40 ℃時(shí)達(dá)到最高,為34%[圖4(c)]。在優(yōu)化條件下,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,GOS產(chǎn)率明顯增加,反應(yīng)進(jìn)行到12 h時(shí)達(dá)到最高,產(chǎn)率為34%,隨著反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行,GOS含量下降[圖4(d)]。

圖(e)表示利用50 mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH值為5.0)配制質(zhì)量濃度為400 g/L的乳糖溶液,加入5 U/mL的BABgal35A,40 ℃反應(yīng)12 h后,產(chǎn)物的HPLC。圖4 BABgal35A合成GOS的最適條件和HPLC分析結(jié)果Fig.4 Optimal conditions for synthesis of GOS by BABgal35A and results of HPLC

目前,已有多種β-半乳糖苷酶用于GOS的合成,產(chǎn)率通常在12%～50%[13-14,27,29-31]。Hsu等[30]對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)BCRC15708來(lái)源的β-半乳糖苷酶進(jìn)行表達(dá),以質(zhì)量濃度為400 g/L的乳糖為底物,反應(yīng)10 h后GOS產(chǎn)率達(dá)32.5%。Arreola等[31]利用短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)DSM 20213來(lái)源的β-半乳糖苷酶合成GOS,產(chǎn)率最高為33%。本研究中,β-半乳糖苷酶(BABgal35A)利用乳糖為底物合成GOS的產(chǎn)率達(dá)34%[圖4(d)],與長(zhǎng)短兩種雙歧桿菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶合成GOS的產(chǎn)率相近,處于較高水平。其產(chǎn)率高于乳酸克魯維酵母(12.2%)和米曲霉(26.7%)來(lái)源的β-半乳糖苷酶[27,29],而低于巴倫葛茲類(lèi)芽孢桿菌(47.9%)來(lái)源的β-半乳糖苷酶[14]。因此,芽孢桿菌來(lái)源的BABgal35A是一種高效合成GOS的β-半乳糖苷酶,可以作為GOS工業(yè)化生產(chǎn)的選擇。

3 結(jié) 論

實(shí)現(xiàn)了一種芽孢桿菌來(lái)源的新型β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá),并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征。BABgal35A的最適pH值為5.0,溫度為55 ℃,在pH值為4.5～8.0時(shí)具有良好的酸堿穩(wěn)定性。BABgal35A具有廣泛的底物特異性。在最適條件下,BABgal35A合成GOS的產(chǎn)率達(dá)34%,處于較高水平。本研究為酶法合成GOS提供了更多選擇。此外,為進(jìn)一步提高BABgal35A合成GOS的產(chǎn)率,可以對(duì)該酶進(jìn)行分子改造,例如定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)等。