土茯苓總黃酮對兔離體胸主動脈環(huán)的舒張作用及機制

吳文斌，周江峰，周 熒，潘永明，屠 玨，蔡兆偉，王德軍

（1.浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院動物實驗研究中心，浙江 杭州 310053；2.上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心，上海 201203）

高血壓是一種以收縮壓或舒張壓異常升高為特征的常見心血管疾病，是誘發(fā)心腦血管疾病最常見的風險因素。血管的舒縮張力失常是引起高血壓的一大重要影響因素，與血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和血液中的血管舒縮因子的濃度直接相關(guān)［1］。血管內(nèi)皮細胞參與對平滑肌的保護，并釋放內(nèi)皮衍生舒縮因子和其他血管舒縮因子，共同參與對血管平滑肌細胞的調(diào)控［2］。一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）是一種內(nèi)皮衍生舒張因子，從內(nèi)皮擴散到平滑肌，誘導舒張［3］。另外，血管平滑肌還會受到來自細胞外的刺激，開放受體調(diào)控鈣離子通道或電壓依賴性鈣離子通道（voltage dependent calcium channel，VDCC），導致胞外鈣離子內(nèi)流或肌漿網(wǎng)鈣離子外流，激活肌球蛋白輕鏈磷酸化而導致血管收縮，反之則介導血管舒張［4-5］。然而，盡管臨床治療高血壓藥物種類繁多，但均有不良反應(yīng)，因此仍需研發(fā)新型的抗高血壓藥物［6］。

傳統(tǒng)中藥具有藥效好、副作用低等特點，被廣泛用于慢性疾病的治療。土茯苓是百合科植物光葉菝葜（SmilaxglabraRoxb.）的干燥根莖，性平味甘，具有解毒祛濕、通利關(guān)節(jié)等功效［7］?，F(xiàn)代藥理研究表明，土茯苓中的活性成分具有抗炎、抗氧化和保護心血管等作用［8］。本課題組前期研究表明，土茯苓具有血壓調(diào)節(jié)作用，并可能與NO 有關(guān)［9］。本研究利用大孔吸附樹脂法提取土茯苓中的主要黃酮類活性成分，命名為土茯苓總黃酮（Smilaxglabraflavonoids，SGF），通過離體兔胸主動脈環(huán)實驗研究SGF 對血管舒縮活性的作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

SGF 來源及制備：土茯苓，購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司，批號18062524，由浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院藥學院科研中心公共平臺委托提取，項目編號2018010006。取適量土茯苓粉碎至40～60 mm，用60%乙醇作提取劑，100 V，閃式提取2 次，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，高速冷凍離心2830×g，10 min，取上清液，稀釋后利用大孔吸附樹脂提取法提取洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸提膏，冷凍干燥后得到SGF。采用紫外分光光度法檢測總黃酮含量達92.59%。用生理鹽水配制成濃度為25 g·L-1的SGF 母液。大孔吸附樹脂，購自安徽三星樹脂有限公司，型號HP-20，批號：20180728。β2腎上腺素能受體阻滯劑ICI118551（鹽酸鹽），美國MCE 公司；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME），美國Sigma 公司；重酒石酸去氧腎上腺素（phenylephrine，PE）注射液，杭州遠大醫(yī)藥有限公司；鹽酸去甲腎上腺素（norepinephrine，NE），阿拉丁公司；氯化乙酰膽堿，上海麥克林生化科技有限公司。其他試劑均為分析純。

Krebs-Henseleit（KH）生理溶液（mmol·L-1）：NaCl 118.3，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO325，D-葡萄糖11，CaCl22.5，超聲促溶；無鈣KH 液除了將CaCl22.5 mmol·L-1換成EDTA 0.1 mmol·L-1外，其他成分同KH液。

SQG-4 型四腔器官浴槽系統(tǒng)和HSS-1（B）型恒溫浴槽，成都儀器廠；MedLab-U/8c 生物信號采集處理系統(tǒng)，南京美易科技有限公司；JZ101型張力換能器，北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司。

1.2 動物和離體兔胸主動脈環(huán)制備

清潔級新西蘭白兔43只，3～4月齡，2.5～3.5 kg，雌雄兼用（杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)專業(yè)合作社），實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2017-0004；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心普通級兔實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2021-0012，室溫20～22 ℃，相對濕度40%～60%，12 h 明暗交替，自由攝食飲水。所有實驗步驟均經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學動物福利與倫理審查委員會批準（編號：IACUC-20221008-02）。

根據(jù)文獻［10］所述，將兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（35 mg·kg-1）后，快速剪開胸腔取出胸主動脈，置預(yù)冷的95% O2∶5% CO2混合氣飽和的KH 液中。小心去除血管周圍的脂肪與結(jié)締組織，并切成約4 mm 胸主動脈環(huán)，并用濕棉簽輕輕摩擦胸主動脈環(huán)內(nèi)表面以去除內(nèi)皮。將一對不銹鋼鉤穿過胸主動脈環(huán)段中間將其懸掛，血管張力可通過張力換能器記錄于生物信號采集處理系統(tǒng)。將胸主動脈環(huán)浸入6 mL KH 液浴槽中并持續(xù)通入95% O2∶5% CO2混合氣，水浴維持37℃。實驗前用2.0 g 張力平衡1 h，每30 min 更換1次KH液。開始正式實驗前，用KCl 60 mmol·L-1刺激胸主動脈環(huán)收縮，達最大張力后洗脫，重復(fù)3次。隨后使用PE 1 μmol·L-1刺激胸主動脈環(huán)收縮，達最大張力后使用氯化乙酰膽堿20 μmol·L-1誘導胸主動脈環(huán)舒張。舒張程度＞60%認為是內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)，＜20%則認為是去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)［11］。

1.3 實驗分組

1.3.1 內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)

取1.2 制備的內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)，進行如下分組處理：①分為SGF 組和溶劑對照組。SGF 組用KCl 60 mmol·L-1誘導胸主動脈環(huán)收縮，達最大張力且處于平臺期后，采用累計加藥的方法，每6 min 加入不同體積SGF 溶液，使SGF 終濃度達15.625，31.25，62.5，125 和250 mg·L-1；溶劑對照組加入等體積生理鹽水代替SGF 溶液，其余操作與SGF 組一致。②分為SGF 組和溶劑對照組。SGF 組用PE 或NE 1 μmol·L-1分別誘導胸主動脈環(huán)收縮，達最大張力且處于平臺期后，采用累計加藥的方法，每6 min加不同體積SGF溶液，使SGF終濃度達15.625，31.25，62.5，125，250 和500 mg·L-1；溶劑對照組加等體積生理鹽水代替SGF 溶液，其余操作與SGF 組一致。③分為L-NAME 組及其溶劑對照組和ICI1185513 組及其溶劑對照組。L-NAME組和ICI1185513組用L-NAME 100 μmol·L-1或ICI118551 0.1 μmol·L-1分別預(yù)處理30 min，隨后加NE 1 μmol·L-1誘導胸主動脈環(huán)收縮，達最大張力且處于平臺期后，采用累計加藥的方法，每6 min加不同體積SGF 溶液，使其終濃度達15.625，31.25，62.5，125，250 和500 mg·L-1；溶劑對照組加等量生理鹽水分別代替L-NAME 或ICI118551，其余操作與L-NAME組或ICI118551組一致。

1.3.2 去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)

取1.2 制備的去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)，進行如下分組處理：①分為SGF 組和溶劑對照組。SGF 組用PE 或NE 1 μmol·L-1分別誘導胸主動脈環(huán)收縮，達最大張力且處于平臺期后，采用累計加藥方法，每6 min 加不同體積的SGF 溶液，使其終濃度達15.625，31.25，62.5，125 和250 mg·L-1；溶劑對照組加等體積生理鹽水代替SGF 溶液，其余操作與SGF 組一致。②分為SGF 組和溶劑對照組。SGF組胸主動脈環(huán)在KH 液中穩(wěn)定1.5 h，換成無鈣KH液平衡20 min，用KCl 60 mmol·L-1誘導胸主動脈環(huán)去極化，同步加SGF 500 mg·L-1預(yù)處理20 min，達最大張力且處于平臺期后，采用累計加藥方法，每6 min加不同體積的CaCl2溶液，使其終濃度達0.15，0.3，0.6，1.2和2.4 mmol·L-1；溶劑對照組加等體積生理鹽水代替SGF 溶液，其余操作與SGF組一致。

1.4 血管張力計算

取1.3.1①②③和1.3.2①②分組處理的胸主動脈環(huán)，利用MedLab-U/8c生物信號采集處理系統(tǒng)將血管張力信號轉(zhuǎn)換為電信號，記錄各時間點血管張力變化，計算胸主動脈環(huán)舒張率，并以各組收縮劑上升的張力為100%繪制濃度-反應(yīng)曲線。舒張率（%）=（給藥前血管張力-給藥后血管張力）/（給藥前血管張力-靜息血管張力）×100%，收縮率（%）=1-（給藥前血管張力-給藥后血管張力）/（給藥前血管張力-靜息血管張力）×100%。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 SGF 對KCl 預(yù)收縮內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)張力的影響

如圖1 所示，SGF 15.625～250 mg·L-1對KCl 60 mmol·L-1預(yù)收縮內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)有輕微的舒張作用，但舒張率無統(tǒng)計學差異。

Fig.1 Effect of Smilax glabra flavonoids（SGF）on thoracic aortic rings with intact endothelium pretreated with potassium chloride KCl 60 mmol·L-1.KCl 60 mmol·L-1 was added to pre-contract thoracic aortic rings for 10 min. SGF was added once every 6 min，and the change of vascular tension was detected at the cumulative concentration of SGF 15.625-250 mg·L-1.±s，n=8.

2.2 SGF 對PE 或NE 預(yù)收縮內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)張力的影響

如圖2 所示，SGF 62.5～500 mg·L-1對PE 或NE 1 μmol·L-1預(yù)收縮內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)均有明顯的舒張作用，最大舒張率達（56±12）%和（76±13）%（P＜0.01）。在SGF 15.625～62.5 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，其舒張率隨濃度上升而增加，并在濃度62.5～250 mg·L-1內(nèi)達到平臺期。在SGF 500 mg·L-1作用下，不論以PE 或NE 作為收縮劑，胸主動脈環(huán)舒張率均下降，舒張率分別為（40±10）%和（46±15）%。

Fig.2 Effect of SGF on thoracic aortic rings with intact endothelium pretreated with phenylephrine（PE）or norepinephrine（NE）. PE 1 μmol·L-1 or NE 1 μmol·L-1 was added to pre-contract thoracic aortic rings for 10 min，respectively.SGF was added once every 6 min，and the change of vascular tension was detected at the cumulative concentration of SGF 15.625-500 mg·L-1. ±s，n=6-8. ＊＊P＜0.01，compared with NE group；##P＜0.01，compared with PE group.

2.3 L-NAME 預(yù)處理對SGF 在內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)中舒張作用的影響

圖3 結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，L-NAME 顯著降低SGF 31.25～500 mg·L-1誘導的胸主動脈環(huán)舒張率（P＜0.01）。

2.4 lCl118551 預(yù)處理對SGF 在內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)中舒張作用的影響

如圖4 所示，與溶劑對照組相比，ICI118551 顯著降低SGF 62.5～500 mg·L-1誘導的胸主動脈環(huán)舒張率（P＜0.01）。此外，ICI118551 組舒張率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，與溶劑對照組一致，提示SGF可能與β2腎上腺素受體阻滯劑存在協(xié)同作用。

Fig. 4 Effect of β2-adrenoceptor blocker lCl118551 pretreatment on SGF-induced vasodilation on thoracic aortic rings with intact endothelium pretreated with NE.β2-adrenoceptor blocker ICI118551 0.1 μmol·L-1 was added to thoracic aortic rings for 30 min for pretreatment. NE 1 μmol·L-1 was added to pre-contract thoracic aortic rings for 10 minutes.SGF was added once every 6 min，and the change of vascular tension was detected at the cumulative concentration of SGF 15.625-500 mg·L-1. ±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with SGF+NE+saline group.

2.5 SGF 對PE 或NE 處理去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)張力的影響

如圖5 所示，胸主動脈環(huán)去除內(nèi)皮后，無論是NE 還是PE 作為收縮劑，SGF 組與溶劑對照組的舒張率之間均無明顯差異，表明內(nèi)皮可能是SGF誘導胸主動脈環(huán)舒張的重要因素。

2.6 SGF 預(yù)處理對鈣離子收縮去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)張力的影響

如圖6所示，CaCl2誘導胸主動脈環(huán)收縮率逐步升高，而采用SGF 500 mg·L-1預(yù)處理去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)20 min 后，CaCl20.6～2.4 mmol·L-1誘導的胸主動脈環(huán)收縮率顯著下降（P＜0.01），提示SGF可能具有鈣離子通道阻滯劑的作用。

Fig.6 Effect of SGF pretreatment on calcium-induced contraction on thoracic aortic rings with denuded endothelium. KCl 60 mmol·L-1 was added to pre-contract thoracic aortic rings for 20 min in a calcium-free environment，while SGF 500 mg·L-1 was added. CaCl2 was added once every 6 min，and the change of vascular tension was detected at the cumulative concentration of CaCl2 0.15-2.4 mmol·L-1. ±s，n=9. ＊＊P＜0.01，compared with CaCl2 saline+KCI group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮完整條件下，SGF 可顯著誘導胸主動脈環(huán)舒張，而這種作用在去內(nèi)皮或eNOS 抑制的胸主動脈環(huán)中幾乎完全喪失，說明內(nèi)皮舒張因子NO 在其中可能起關(guān)鍵作用。實驗結(jié)果顯示，SGF 可部分阻斷Ca2+誘導的胸主動脈環(huán)收縮，說明SGF 還可能通過非內(nèi)皮依賴方式舒張血管。因此，SGF 通過內(nèi)皮依賴和非依賴的途徑共同發(fā)揮作用，而NO依賴性誘導血管舒張可能是其主要機制。

NO 是誘導血管舒張的重要激活劑。前期有研究在腎性高血壓大鼠上發(fā)現(xiàn)，土茯苓水提物可顯著改善高血壓大鼠的收縮壓和舒張壓，并能增加NO水平［9］。在本研究中，去除血管內(nèi)皮或添加eNOS抑制劑L-NAME 可以顯著阻斷SGF 誘導的舒張作用，進一步說明NO可能是SGF發(fā)揮作用的主要內(nèi)皮舒張因子。此外，本研究發(fā)現(xiàn)SGF 500 mg·L-1對胸主動脈環(huán)的舒張作用減弱。先前已有研究表明，土茯苓提取物赤土茯苓苷具有β腎上腺素能受體阻滯樣作用［12］?？紤]到血管上主要分布β2受體，激動β2受體具有平滑肌松弛和血管舒張等作用，推測SGF 對血管的舒張作用減弱可能與β2受體抑制有關(guān)，因此本研究采用β2腎上腺素能受體阻滯劑ICI118551 進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)ICI118551 進一步減弱了SGF 誘導的胸主動脈環(huán)舒張。然而，Tan 等［13］在利用普萘洛爾預(yù)處理離體主動脈環(huán)對白藜蘆醇誘導的血管舒張作用的研究中并未出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。因此，未來仍需明確SGF 的β2腎上腺素能受體阻滯樣作用。SGF 是土茯苓的提取物，本文研究結(jié)果也進一步支持了土茯苓具有β受體阻滯樣的作用。

研究證實，胸主動脈環(huán)在加入鈣鰲合劑EGTA的無鈣高鉀KH 液中孵育后，細胞處于去極化的狀態(tài)，VDCC 處于活化狀態(tài)，此時加入鈣離子所引起的胸主動脈環(huán)收縮主要是細胞外鈣通過鈣通道流入細胞內(nèi)所引起［14］。已有研究表明，SGF 可以顯著抑制由PE 和血管緊張素Ⅱ誘導的心肌鈣離子依賴性收縮，并與蘭尼堿受體相關(guān)［15］，說明SGF 在鈣平衡中起到重要作用。本研究證實，SGF 500 mg·L-1對外源性CaCl2誘導的胸主動脈環(huán)收縮有抑制作用，而對KCl誘導的胸主動脈環(huán)收縮作用較弱，表明SGF 能拮抗細胞外鈣的作用，因此可能具有鈣離子通道阻滯劑效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SGF在內(nèi)皮完整和破壞的兔離體胸主動脈環(huán)模型上通過信號通路發(fā)揮其血管舒張作用，初步揭示了SGF具有治療高血壓的潛力，但其臨床作用和干預(yù)機制仍需進一步研究和探索。