一氧化氮與肺動(dòng)脈高壓及基于一氧化氮信號(hào)通路的肺動(dòng)脈高壓治療藥物研究進(jìn)展

劉賽利，艾可龍，胡長(zhǎng)平，2，3

（1.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410078；2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山西 長(zhǎng)治 046000；3.心血管研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410078）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種進(jìn)行性肺血管疾病，當(dāng)機(jī)體受到膠原血管病、先天性心臟病、門脈高壓、艾滋病、藥物和毒素等多種因素威脅時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肺血管損傷，肺血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙［1］，血管舒張因子如一氧化氮（nitric oxide，NO）和前列腺素I2（prostaglandin I2，PGI2）產(chǎn)生減少，而血管收縮因子如血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）和內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）產(chǎn)生增多，打破肺血管舒張和收縮平衡，導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMC）的異常增殖和早期內(nèi)膜增生。在PH 發(fā)展進(jìn)程中，肺動(dòng)脈管腔逐漸變窄，肺動(dòng)脈阻力逐漸變大；在疾病進(jìn)展晚期，叢狀病變和原位血栓形成使肺血管腔閉塞，右心后負(fù)荷增大導(dǎo)致右心肥大，之后出現(xiàn)右心衰竭最終導(dǎo)致死亡［2-3］。2018 年，世界肺動(dòng)脈高壓大會(huì)調(diào)整PH 的最新診斷標(biāo)準(zhǔn)為靜息時(shí)平均肺動(dòng)脈壓（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）≥20 mmHg，肺動(dòng)脈楔壓≤15 mmHg，以及肺血管阻力（pulmonary vascular resistance，PVR）＞2 WOOD單位［4］。

自1987 年發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮衍生松弛因子NO 后，這種無(wú)色無(wú)味的氣體在人類生理和疾病研究中占據(jù)著越來(lái)越重要的地位［5-6］。NO 是一種自分泌和旁分泌信號(hào)分子，其功能包括松弛平滑肌、抑制血小板聚集、介導(dǎo)中樞和自主神經(jīng)傳遞、裂解腫瘤細(xì)胞、殺滅細(xì)菌和刺激激素釋放等［7-8］。本文概述NO 的來(lái)源、舒血管作用機(jī)制及其在PH 病理生理中的作用，和目前正在研究的針對(duì)PH 中NO 信號(hào)通路的靶向治療藥物，特別是納米載體藥物的研究進(jìn)展。

1 NO的來(lái)源及其舒張血管作用機(jī)制

在血管壁中，NO 主要是在內(nèi)皮細(xì)胞由L-精氨酸和分子氧經(jīng)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）催化合成［9］。NO 也可通過(guò)亞硝酸鹽還原生成，這種不依賴NOS 的NO形成途徑首次在缺血心肌組織中被發(fā)現(xiàn)，在酸性和低氧條件下更易發(fā)生，后來(lái)被證明有助于調(diào)節(jié)機(jī)體血液流動(dòng)和血壓［10］。生理?xiàng)l件下，NO 一經(jīng)產(chǎn)生即迅速擴(kuò)散到血管平滑肌細(xì)胞中，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC），催化GTP轉(zhuǎn)化為第二信使環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），后者激活cGMP 依賴的蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）使血管舒張，并抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和血小板聚集。肺血管平滑肌細(xì)胞中的磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDE），尤其是PDE5，通過(guò)水解將cGMP 轉(zhuǎn)化為5-GMP 使其失活，從而呈現(xiàn)反調(diào)節(jié)功能［11-12］。PH 時(shí)超氧陰離子產(chǎn)生增多，導(dǎo)致eNOS 關(guān)鍵輔酶因子四氫生物蝶呤氧化，使eNOS 解偶聯(lián)，NO 產(chǎn)生減少；且NO 會(huì)迅速與超氧陰離子反應(yīng)形成過(guò)氧亞硝酸鹽（peroxynitrite anion，ONOO-），其可與組織中酪氨酸結(jié)合，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用和細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死；且可引起PKG 硝化，NO 生物利用度降低，導(dǎo)致血管收縮和平滑肌細(xì)胞異常增殖［13-14］。

2 靶向NO/sGC/cGMP 信號(hào)通路治療肺動(dòng)脈高壓的藥物

目前針對(duì)NO/sGC/cGMP 信號(hào)通路的PH 靶向治療藥物主要有3種，分別是PDE5抑制劑、sGC 激動(dòng)劑和吸入性NO。

2.1 PDE5抑制劑

迄今為止，成功增強(qiáng)NO/sGC/cGMP 信號(hào)通路的方法是使用PDE5抑制劑阻止細(xì)胞內(nèi)cGMP水解代謝［15］。常用的PDE5抑制劑包括西地那非（sildenafil）、他達(dá)那非（tadalafil）和伐地那非（vardenafil）等。此類藥物對(duì)肺循環(huán)血管床的擴(kuò)張程度遠(yuǎn)大于體循環(huán)血管床。西地那非可抑制登山者肺血管平滑肌增殖和低氧性肺動(dòng)脈壓升高，亦能降低PH 患者PVR，減輕突然停止吸入NO后的反彈性PH。在安慰劑對(duì)照試驗(yàn)中，西地那非可改善PH 患者6 min步行距離，2005 年被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于治療成人PH［16］。西地那非也被用于治療新生兒、嬰兒和兒童PH 以及多種心肺疾病相關(guān)的PH［17］。由于細(xì)胞內(nèi)cGMP 是由NO 與sGC 中的血紅素鐵結(jié)合促進(jìn)形成的，NO 缺失可導(dǎo)致cGMP 缺失［10］。理論上，PDE5 抑制劑會(huì)隨著cGMP 合成減少而失效。因此，對(duì)于NO/sGC/cGMP 信號(hào)通路受損的PH 患者，其療效可能有限。

2.2 sGC激動(dòng)劑

sGC 是目前唯一已知的NO 受體，可被NO 激活催化GTP 轉(zhuǎn)化為第二信使cGMP。在PH 患者肺動(dòng)脈中，sGC 因NO 生物利用度降低、活性氧的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激引起的血紅素-鐵氧化導(dǎo)致的sGC 氧化以及相關(guān)的血紅素組酶的丟失而功能降低［18］。由于PDE5 抑制劑治療效果取決于基線NO 水平，而基線NO水平在PH患者中降低，因此直接作用于sGC 的治療可能比PDE5 抑制劑對(duì)NO 通路受損的PH 患者療效更好。利奧西呱（riociguat）是由拜耳公司研發(fā)的sGC 激動(dòng)劑，可直接激活sGC，也能穩(wěn)定NO-sGC 結(jié)合，從而上調(diào)第二信使cGMP，顯著提高PH 患者的運(yùn)動(dòng)耐量，改善血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和心功能［19-21］。利奧西呱已于2013 年10 月8 日獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療慢性血栓栓塞性PH［22］。

2.3 吸入性NO

吸入性NO 是一種選擇性肺血管舒張劑，可在不影響心臟指數(shù)和全身血管阻力的情況下，顯著降低mPAP 和PVR，提高動(dòng)脈氧水平，降低體外膜式氧合需要，可通過(guò)氣管插管、面罩持續(xù)吸入或脈沖鼻給藥［23］。對(duì)于吸入性NO 治療有效的PH 患者，突然停藥時(shí)會(huì)出現(xiàn)PAP 和PVR 顯著上升以及心排血量和血氧飽和度明顯下降等反跳現(xiàn)象，部分患者癥狀輕，經(jīng)吸氧等治療后可緩解，重者可危及生命。造成這種反跳現(xiàn)象的原因可能與吸入NO 對(duì)內(nèi)源性NO 合成減少和（或）ET-1 水平升高有關(guān)［24］。治療時(shí)應(yīng)緩慢逐漸停藥，并根據(jù)血氧飽和度、血壓和患者的癥狀調(diào)整停藥速度。在持續(xù)給予NO 的過(guò)程中，NO 氧化產(chǎn)物二氧化氮（nitrogen dioxide，NO2）可在低濃度時(shí)積聚并引起氣道亢進(jìn)，高濃度時(shí)引起肺水腫；NO 可與血紅蛋白結(jié)合生成亞硝酸血紅蛋白，繼而迅速氧化形成高鐵血紅蛋白，后者在循環(huán)中濃度過(guò)高可導(dǎo)致組織產(chǎn)生嚴(yán)重的低氧血癥［21，24］。故其應(yīng)用過(guò)程需嚴(yán)格控制NO 輸送的濃度及速度，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)毒性產(chǎn)物NO2的濃度。這需要一系列復(fù)雜的輸送及監(jiān)測(cè)設(shè)備，包括氣瓶、壓力調(diào)節(jié)器、監(jiān)測(cè)儀和呼吸機(jī)等設(shè)備，以及訓(xùn)練有素的呼吸治療師［25-26］；成本高、需實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)且需負(fù)擔(dān)笨重的氣體處理設(shè)備，阻礙了吸入性NO 的廣泛使用。目前，吸入性NO主要用于新生兒持續(xù)性PH及圍手術(shù)期PH的治療［21］。

3 NO供體的舒血管作用

吸入性NO 由于其輸送的復(fù)雜性，其使用幾乎僅限于PH 患者重癥監(jiān)護(hù)環(huán)境。NO 供體是外源性給藥后在體內(nèi)釋放NO，補(bǔ)充內(nèi)源性NO 不足，可為PH 日常治療提供潛在可能性。代表性的NO 供體包括有機(jī)硝酸鹽、金屬亞硝基化合物、亞硝酸鹽、N-重氮鎓二酸鹽（NONOate）。

3.1 有機(jī)硝酸鹽

有機(jī)硝酸鹽，如硝酸甘油、硝酸異山梨酯和單硝酸異山梨酯，是具有硝酸酯（-O-NO2）基團(tuán)的前藥，在血管平滑肌細(xì)胞中經(jīng)過(guò)線粒體的乙醛脫氫酶及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的細(xì)胞色素P450 酶等系統(tǒng)進(jìn)行代謝后釋放NO［27］。該類藥物存在較高的選擇性，只有在靜脈等乙醛脫氫酶含量豐富的血管平滑肌中才能釋放NO，在大動(dòng)脈中作用較差，在冠狀動(dòng)脈大血管中有一定作用，但在小動(dòng)脈中則基本不釋放NO。其短時(shí)間內(nèi)即可快速起效，但連續(xù)用24 h 可產(chǎn)生耐藥性，可應(yīng)用于高血壓危重癥患者的搶救［28］。

3.2 金屬亞硝基化合物

NO 是金屬離子的強(qiáng)配體，在金屬的配位域中占主導(dǎo)地位，NO 與金屬離子結(jié)合形成金屬亞硝基化合物，可作為NO 的供體。目前研究最多的金屬亞硝基化合物是硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）［29］。SNP 是由1 個(gè)亞鐵離子中心與5 個(gè)氰基基團(tuán)和1 個(gè)亞硝基組成的無(wú)機(jī)鹽，入血后可直接降解為亞硝酸鹽，在血液中即可自發(fā)釋放NO，無(wú)需進(jìn)入平滑肌細(xì)胞代謝，其作用靶點(diǎn)無(wú)選擇性，可引起全身性低血壓，同時(shí)釋放氰化物，故接受硝普鈉治療的患者必須監(jiān)測(cè)氰化物中毒癥狀，如精神狀態(tài)改變、癲癇發(fā)作和代謝性酸中毒等。SNP 作用迅速，降壓作用強(qiáng)大，但半衰期很短，其效果在1～2 min內(nèi)消失，目前主要應(yīng)用于高血壓危重癥患者的搶救［30-31］。

3.3 亞硝酸鹽

研究表明，血漿中硝酸鹽和亞硝酸鹽水平在PH 等內(nèi)皮功能障礙疾病中較低［32］；亞硝酸鹽和硝酸鹽是NO 代謝的氧化產(chǎn)物，亞硝酸鹽可以敏感地反映eNOS 活性的急性變化［33］。通過(guò)補(bǔ)充亞硝酸鹽可以還原得到NO，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能。吸入霧化的亞硝酸鈉已被證明可以在脫氧血紅素的亞硝酸鹽還原酶作用下釋放NO，產(chǎn)生選擇性的、持續(xù)的肺血管舒張作用，改善低氧引起的動(dòng)物和人類PH，其作用維持時(shí)間比吸入性NO 長(zhǎng)，而血液高鐵血紅蛋白水平無(wú)顯著升高［34-35］。亞硝酸鹽和硝酸鹽的血管舒張作用弱于有機(jī)硝酸鹽（硝酸甘油）和金屬亞硝基化合物（硝普鈉），但不像有機(jī)硝酸鹽產(chǎn)生快速耐受和顯著的全身血管舒張作用［36］。

3.4 N-重氮鎓二酸鹽

NONOate 是研究最廣泛的NO 供體之一。NONOate 一般由仲胺與氣態(tài)NO 在高壓下反應(yīng)合成，該方法可以合成從小分子到聚合物的各種壬酸鹽，如二乙烯三胺/NO（DETA/NO）、精胺壬酸鹽（SPER/NO）、脯氨酸壬酸鹽（PROLI/NO）、丙胺丙胺壬酸鹽（PAPA/NO）等［37］。NONOate不需要任何激活機(jī)制，在生理pH 下便可以通過(guò)水解自發(fā)釋放NO［38］。研究發(fā)現(xiàn)，在PH 豬模型中，經(jīng)NONOates氣霧劑治療后，可改善氧合并顯著降低PVR，同時(shí)不引起顯著的全身毒性［39］。然而，這種快速的NO釋放作用時(shí)間短，且對(duì)特定器官、組織或細(xì)胞類型的選擇性有限，限制了其在臨床的潛在治療應(yīng)用。

4 NO 及其供體納米遞送系統(tǒng)對(duì)肺動(dòng)脈高壓的潛在治療作用

為實(shí)現(xiàn)NO 持續(xù)、受控釋放和靶點(diǎn)特異性，目前大量科研人員致力于開(kāi)發(fā)新的載體系統(tǒng)遞送NO 供體，為其應(yīng)用于PH的日常給藥治療提供可能。

4.1 納米粒子直接遞送NO氣體

Huang等［40］采用加壓冷凍法將NO氣體和氬氣（Ar）包封于含磷脂和膽固醇的回聲脂質(zhì)體（echogenic liposomes，ELIP）中（NO/Ar-ELIP），可保護(hù)和輸送NO 到靶組織，具有氣體輸送可視化和控制治療性氣體釋放的潛力。Ar的加入可以防止NO與氧氣反應(yīng)生成NO2，并可通過(guò)調(diào)節(jié)其與NO 的比例從而調(diào)節(jié)NO 的釋放速率，延長(zhǎng)NO 在體內(nèi)的釋放時(shí)間。NO/Ar-ELIP 體外釋放譜顯示，脂質(zhì)體釋放NO 的速度較慢，可形成持續(xù)的釋放譜。此外，NO/Ar-ELIP 能保護(hù)NO 不受血紅蛋白等微環(huán)境清道夫的侵害，體外培養(yǎng)的大鼠PASMC 與NO/Ar-ELIP 孵育時(shí)，PASMC 攝取的NO 比給予游離NO 時(shí)增加7 倍，且未顯示任何毒性。NO/Ar-ELIP 具有回聲性，可增強(qiáng)超聲造影成像，監(jiān)測(cè)NO/Ar-ELIP 在體內(nèi)的遞送過(guò)程，且可通過(guò)使用高頻率超聲實(shí)現(xiàn)NO/Ar-ELIP 在特定組織可控釋放NO。

4.2 基于亞硝酸鹽的NO遞送系統(tǒng)

Mohamed 等［41］開(kāi)發(fā)了一種新型水凝膠狀聚合物復(fù)合納米顆粒用于遞送NO，即以亞硝酸鹽作為NO 供體，復(fù)合水凝膠型聚合物制成NO 釋放納米顆粒（NO-releasing nanoparticles，NO-RNP）。NO-RNP 的NO 釋放動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，其約在120 min 達(dá)到峰值，并持續(xù)釋放8 h 以上，選擇性地靶向低氧誘導(dǎo)的PH 小鼠肺動(dòng)脈，并產(chǎn)生濃度依賴性的肺血管松弛作用，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的活性和炎癥反應(yīng)均無(wú)影響。

4.3 基于NONOate的NO遞送系統(tǒng)

NONOate 具有較高的NO 負(fù)載能力，每摩爾NONOate 功能化分子可以釋放2 摩爾NO。然而，NONOate 中NO 分子不受控制的自發(fā)釋放限制了其臨床應(yīng)用潛力。為克服NONOate 中NO 的釋放缺陷，研究者采用了幾種策略，包括將NONOate 偶聯(lián)到大分子支架中或物理封裝到載體系統(tǒng)內(nèi)。最近，Nahar 等［42］開(kāi)發(fā)了一種長(zhǎng)效NO 供體的肽修飾脂質(zhì)體，即將DETA/NO 包封在經(jīng)歸位肽修飾的脂質(zhì)體中。硫酸肝素是一種參與炎癥過(guò)程的內(nèi)源性物質(zhì)，主要聚集在肺血管系統(tǒng)PH 病灶中，作為歸位肽的配體，可引導(dǎo)DETA/NO 歸位肽修飾的脂質(zhì)體靶向肺血管并釋放NO，引起肺血管特異性舒張，在不改變體循環(huán)血管壓力的情況下可降低肺動(dòng)脈壓力。該脂質(zhì)體半衰期為27 h，較長(zhǎng)的半衰期可降低持續(xù)吸入的需求，并減少PH 反彈的發(fā)生率。以上研究表明，開(kāi)發(fā)NO納米遞送系統(tǒng)對(duì)PH的藥物治療具有重大意義。

5 結(jié)語(yǔ)

NO 是調(diào)節(jié)肺血管功能的關(guān)鍵信號(hào)分子，其生物利用度降低可導(dǎo)致PH 的發(fā)生發(fā)展。目前針對(duì)NO 通路的特異性治療藥物對(duì)PH 患者的運(yùn)動(dòng)能力和肺血流動(dòng)力學(xué)有一定的改善作用，但由于藥物生物利用度低，靶向性差，不良反應(yīng)多，患者的長(zhǎng)期生存狀況仍不理想。NO 供體普遍存在水中穩(wěn)定性差、釋放不受控、靶向性差等問(wèn)題，限制了其對(duì)PH 的治療應(yīng)用。因此，為實(shí)現(xiàn)NO 持續(xù)、受控釋放和靶點(diǎn)特異性，目前大量科研人員致力于開(kāi)發(fā)新的載體系統(tǒng)遞送NO 供體。迄今為止，通過(guò)將NO 供體與功能納米材料結(jié)合作為載體，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一些NO 釋放納米平臺(tái)，體外和體內(nèi)研究均表明，與游離NO 供體相比，NO 釋放納米平臺(tái)可持續(xù)穩(wěn)定地釋放NO，選擇性地靶向肺動(dòng)脈，在PH 的日常給藥治療方面具有較大的應(yīng)用潛力。然而，從納米療法的基礎(chǔ)研究向臨床試驗(yàn)轉(zhuǎn)化的挑戰(zhàn)仍有待解決，納米載體對(duì)治療藥物的遞送仍處于早期階段，在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多不足，如納米藥物在粒徑、穩(wěn)定性、溶解度、藥物釋放和無(wú)菌性方面細(xì)微變化的可控和可重復(fù)制造仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。同時(shí)，納米藥物在人體中的長(zhǎng)期毒性和功效是否與動(dòng)物模型的結(jié)果一致尚未得到證實(shí)。總之，需要進(jìn)一步研究以優(yōu)化納米材料在PH中的應(yīng)用。