芬太尼對斑馬魚幼魚的心臟和神經(jīng)毒性及機(jī)制

王斌杰，付立斌，葉昕宇，卓曉聰，姚偉宣，秦亞洲，劉 猛，吳元釗

（1.浙江警察學(xué)院浙江省毒品防控技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 310053；2.杭州市公安局蕭山分局刑事科學(xué)技術(shù)室，浙江 杭州 311200）

芬太尼（及其衍生物）屬于阿片μ 受體激動劑，具有較強(qiáng)的麻醉和鎮(zhèn)痛作用，臨床用于術(shù)后、外科和急診中的心肌梗死、外傷和燒傷等的止痛，及作為麻醉劑用于癌癥和其他晚期病癥引起的慢性疼痛的輔助治療［1］。芬太尼類藥物親脂性強(qiáng)，可快速透過血腦屏障進(jìn)入大腦，極易導(dǎo)致藥物依賴，毒販們將其摻雜在低純度海洛因或可待因中銷售［2-3］，常導(dǎo)致呼吸抑制、心臟驟?；驀?yán)重過敏反應(yīng)致死案件［4］。芬太尼類藥物相對分子質(zhì)量小、離子化程度低、脂溶性強(qiáng)，能夠通過胎盤進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，且具有一定蓄積能力［5］，使其對孕婦及胎兒的風(fēng)險進(jìn)一步增加［6］。一項通過硬膜外腔給予芬太尼進(jìn)行椎管內(nèi)麻醉的剖宮產(chǎn)術(shù)結(jié)果顯示，母體與胎兒血漿中芬太尼的濃度分別達(dá)到0.31和0.25 ng·L-1，其胎盤轉(zhuǎn)移率高達(dá)89.20%［7］。有報道顯示，懷孕早期使用阿片類藥物進(jìn)行鎮(zhèn)痛治療與嬰兒的部分出生缺陷有關(guān)，如先天性心臟病、脊柱缺陷、腦積水和青光眼等病癥［8］。孕婦產(chǎn)前接觸過量阿片類藥物還會導(dǎo)致新生嬰兒的神經(jīng)行為改變，如認(rèn)知延遲和認(rèn)知功能缺陷［9］，甚至精神運(yùn)動系統(tǒng)發(fā)育遲緩［10］。Sonia等［11］提出，新生兒的焦慮、攻擊、排斥感和破壞性與孕期阿片類藥物暴露相關(guān)。由于藥效高、起效快、成本低，芬太尼的臨床應(yīng)用廣泛，因此需要更多動物模型研究充分揭示其發(fā)育毒性。

芬太尼類藥物對人體的毒理作用體現(xiàn)在神經(jīng)毒性、呼吸系統(tǒng)毒性和心血管系統(tǒng)毒性，這些毒性在斑馬魚模型上也有報道［12］。Zaig等［13］報道了芬太尼對斑馬魚胚胎產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效果和呼吸抑制毒性。Cooman 等［14］發(fā)現(xiàn)芬太尼100 μmol·L-1暴露會導(dǎo)致斑馬魚胚胎產(chǎn)生明顯發(fā)育毒性，包括尾部發(fā)育缺陷和心包水腫。有報道，過量攝入芬太尼后人體血藥濃度達(dá)到1～10 mg·L-1［15］，同時芬太尼類藥物在常規(guī)臨床使用中血藥濃度也可達(dá)到0.4～20 μg·L-1［16-17］。本研究以斑馬魚為實驗動物，研究芬太尼5～20 mg·L-1暴露對幼魚的心臟毒性和神經(jīng)毒性，同時檢測心臟和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子（NK2 homeobox 5，nkx2.5）、神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4a（neuronal PAS domain protein 4a，npas4a）、心房型利鈉肽原B（natriuretic peptide B，nppb）和高遷移率族轉(zhuǎn)錄因子9b（SRY-box transcription factor 9b，sox9b）的表達(dá)，探討毒性的可能分子機(jī)制，評估芬太尼對胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的心臟和神經(jīng)毒性，為評估孕期接觸或使用芬太尼風(fēng)險提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和主要儀器

斑馬魚品種為野生WT/AB 系和熒光標(biāo)記新生神經(jīng)元的Tg（elavl3：EGFP）轉(zhuǎn)基因系斑馬魚，魚齡2～4個月，體重0.5～1.0 g，均購自武漢中國斑馬魚資源中心。芬太尼鹽酸鹽（純度99.5%），上海原思標(biāo)物科技有限公司。斑馬魚胚胎培養(yǎng)在E3 培養(yǎng)液（mg·L-1：NaCl 5，KCl 0.17，CaCl20.33，MgSO40.33）中。Trizol 試劑，美國Thermo Fisher Scientific 公司；cDNA First Strand Synthesis Kit 和BioEasy SYBR Green Ⅰ熒光PCR 試劑盒，日本Takara 公司。SZX2 體視顯微鏡，日本Olympus 公司；Danio-Scope 斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)，荷蘭Noldus 公司；QuantStudio 6 Flex 實時熒光定量PCR，美國Thermo Fisher Scientific 公司。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成，序列見表1。

Tab.1 Primers for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 動物分組和染毒

成年斑馬魚按照雌雄比例1∶1 置于魚缸內(nèi)，用隔板隔開后在黑暗的孵化箱中過夜，第2 天早上拔掉隔板后通過光刺激獲得受精卵，按照標(biāo)準(zhǔn)方案選擇健康胚胎進(jìn)行實驗［18］。選取受精后2 h（2 h post fertilization，2 hpf）發(fā)育健康的受精胚胎清洗完畢并轉(zhuǎn)移至6 孔板中。每孔放30 個胚胎，吸去多余液體。正常對照組每孔加入10 mL E3培養(yǎng)溶液，實驗組每孔分別加入10 mL濃度為5，10和20 mg·L-1芬太尼水溶液，隨后在28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)暴露120 h。實驗過程中每24 h 更換1 次暴露溶液，以保證溶液參數(shù)穩(wěn)定。

1.3 體視顯微鏡觀察斑馬魚胚胎畸形表型，分析畸形率和存活率

用體視顯微鏡觀察24，48，72，96 和120 hpf斑馬魚胚胎發(fā)育畸形表型，包括心包水腫、心率異常、血流缺失、眼睛異常、肝臟變性、體長變短、著色異常和卵黃囊吸收延遲等表型；計算斑馬魚胚胎發(fā)育畸形率，發(fā)育畸形率（%）=（畸形個體數(shù)/ 初始個體數(shù)）×100%。以斑馬魚胚胎心率消失確定胚胎的死亡，計算存活率。存活率（%）=（存活個體數(shù)/初始個體數(shù)）×100%。

1.4 斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)統(tǒng)計斑馬魚幼魚心率、心包面積和靜脈竇與動脈球（sinus venosusbulbus arteriosus，SV-BA）距離

72，96 和120 hpf，通過斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)進(jìn)行心率統(tǒng)計，記錄幼魚在1 min 內(nèi)的心跳次數(shù)。每組包含20條斑馬魚幼魚，實驗重復(fù)3次。120 hpf，進(jìn)行心臟拍攝，每個濃度隨機(jī)統(tǒng)計20條幼魚，實驗重復(fù)3次，利用Image J軟件分析心包面積和SV-BA距離。

1.5 HE 染色法觀察斑馬魚幼魚心房心室結(jié)構(gòu)和心肌細(xì)胞特征

120 hpf，對斑馬魚幼魚進(jìn)行HE 染色。首先用4%多聚甲醛固定斑馬魚并進(jìn)行脫水處理，隨后進(jìn)行石蠟包埋和組織切片（切片厚5 μm），使用HE 染色劑將細(xì)胞核染成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色，接著分別使用梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。使用體視顯微鏡觀察斑馬魚幼魚心房心室結(jié)構(gòu)和心肌細(xì)胞特征。

1.6 體視顯微鏡檢測斑馬魚幼魚新生神經(jīng)元面積和密度

120 hpf，通過體視顯微鏡對Tg（elavl3：EGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚的新生神經(jīng)元進(jìn)行拍攝，圖片用Image J 軟件進(jìn)行熒光面積和熒光強(qiáng)度分析。每個濃度隨機(jī)統(tǒng)計6 條斑馬魚幼魚數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3 次。分別以熒光面積和熒光強(qiáng)度反映新生神經(jīng)元的面積和密度。

1.7 熒光定量PCR 檢測斑馬魚幼魚心臟和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因nkx2.5，npas4a，nppb和sox9b mRNA表達(dá)水平

120 hpf 斑馬魚幼魚，按照Trizol 試劑說明書操作，從每個濃度中隨機(jī)抽取30條幼魚勻漿后進(jìn)行總RNA 提取。使用cDNA First Strand Synthesis Kit 對純化的總RNA（1 μg）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照SYBR Green Master Mix試劑盒說明書，采用熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，實驗重復(fù)3 次。循環(huán)條件為：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)。β-肌動蛋白作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示nkx2.5，npas4a，nppb和sox9bmRNA表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 芬太尼對斑馬魚畸形率和存活率的影響

芬太尼10和20 mg·L-1對斑馬魚胚胎發(fā)育有明顯毒性，主要表現(xiàn)為孵化不完全、脊柱彎曲、尾部畸形和心包水腫。120 hpf，與正常對照組相比，芬太尼各濃度組斑馬魚幼魚存活率均無明顯變化（圖1A）。96 和120 hpf，芬太尼10 和20 mg·L-1組幼魚畸形率顯著升高（P＜0.01）（圖1B）。

Fig.1 Effect of fentanyl exposure on zebrafish embryo survival and malformation rates. Zebrafish embryos were exposed to fentanyl 0（normal control），5，10 and 20 mg·L-1 at 2 h post fertilization（2 hpf）and observed under a stereomicroscope at 24，48，72，96 and 120 hpf，respectively. A：survival rate at 120 hpf；B：malformation rate. ±s，n=3（30 zebrafish embryos for each replicate experiment）. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 芬太尼對不同發(fā)育階段斑馬魚幼魚心率的影響

結(jié)果如圖2 所示。72 hpf，與正常對照組相比，芬太尼5 和10 mg·L-1組幼魚心率無顯著差異，20 mg·L-1組顯著下降（P＜0.01）；96 hpf，芬太尼10 和20 mg·L-1組幼魚心率顯著下降（P＜0.01）；120 hpf，芬太尼各濃度組幼魚心率均顯著降低（均P＜0.01）。

Fig.2 Effect of fentanyl exposure on embryonic heart rate in zebrafish from 72 to 120 hpf. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment. ±s，n=20. ＊＊P＜0.01，compared with corresponding normal control group.

2.3 芬太尼對斑馬魚幼魚心包面積和SV-BA 距離的影響

120 hpf 微視行為系統(tǒng)實驗結(jié)果如圖3 所示。與正常對照組相比，芬太尼20 mg·L-1組幼魚心包面積顯著增加（P＜0.01），SV-BA距離顯著增加（P＜0.01）；芬太尼5 和10 mg·L-1組幼魚心包面積和SV-BA距離均無顯著差異。

Fig.3 Effect of fentanyl exposure on pericardial area and sinus venosus-bulbus arteriosus（SV-BA） distance of zebrafish larvae at 120 hpf. Zebrafish embryos were exposed to fentanyl 0（normal control），5，10 and 20 mg·L-1 at 2 hpf and observed under a stereomicroscope at 120 hpf. ±s，n=20.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 芬太尼對斑馬魚幼魚心房心室結(jié)構(gòu)和心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

HE 染色結(jié)果（圖4）顯示，正常對照組斑馬魚心房心室大小正常，細(xì)胞間間隙正常，心肌細(xì)胞層數(shù)多且厚，而芬太尼20 mg·L-1組斑馬魚產(chǎn)生明顯心包水腫，心房心室明顯腫大，心肌細(xì)胞層數(shù)少且薄。

Fig.4 Effect of fentanyl exposure on structures of atria,ventricles and cardiomyocytes of zebrafish larvae by HE staining. See Fig.3 for zebrafish larvae treatment. A represents the atrium of zebrafish，V represents the ventricle，and B represents the arterial bulb.

2.5 芬太尼對斑馬魚幼魚新生神經(jīng)元面積和密度的影響

芬太尼對斑馬魚幼魚新生神經(jīng)元的毒性結(jié)果如圖5所示。與正常對照組相比，芬太尼20 mg·L-1組幼魚新生神經(jīng)元面積顯著降低（P＜0.05），新生神經(jīng)元密度顯著降低（P＜0.01），說明芬太尼暴露對頭部新生神經(jīng)元的正常發(fā)育造成影響。

Fig.5 Effect of fentanyl exposure on area and density of new neurons of zebrafish larvae. See Fig.3 for zebrafish larvae treatment. ±s，n=6. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group. The arrows show the location of new neurons in the head of zebrafish larvae.

2.6 芬太尼暴露對斑馬魚幼魚心臟和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

芬太尼暴露后120 hpf 幼魚的心臟和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因nkx2.5，npas4a，nppb和sox9bmRNA 表達(dá)結(jié)果如圖6 所示。與正常對照組相比，芬太尼5，10 和20 mg·L-1組斑馬魚nkx2.5mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；芬太尼10 和20 mg·L-1組斑馬魚npas4amRNA 表達(dá)顯著降低（均P＜0.01）；芬太尼20 mg·L-1組斑馬魚nppbmRNA表達(dá)顯著提高（P＜0.01）；芬太尼10 和20 mg·L-1組斑馬魚sox9bmRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.6 Effect of fentanyl exposure on mRNA expressions of nkx2.5，npas4a，nppb and sox9b in zebrafish larvae at 120 hpf by fluorescence quantitative PCR. See Fig.3 for zebrafish embryo treatment. ±s，n=3（30 zebrafish larvae for each replicate experiment）. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 討論

本研究顯示，芬太尼暴露對斑馬魚幼魚造成的心臟毒性效應(yīng)和神經(jīng)毒性效應(yīng)與其濃度密切相關(guān)。芬太尼5，10 和20 mg·L-1均沒有產(chǎn)生致死效應(yīng)。主要的毒性表型為心臟毒性，包括心包水腫等表現(xiàn)。120 hpf，芬太尼10 mg·L-1抑制了幼魚的心率，但是對心臟的心包面積和SV-BA 距離沒有顯著影響，芬太尼20 mg·L-1造成了幼魚心率下降和心包水腫。Cooman等［14］對斑馬魚胚胎進(jìn)行4 d芬太尼染毒實驗（芬太尼濃度為100 μmol·L-1，即34.1 mg·L-1），結(jié)果顯示，斑馬魚胚胎產(chǎn)生明顯畸形，包括卵凝結(jié)、卵黃吸收延遲、心包異常、魚鰾膨脹。本研究進(jìn)一步證明芬太尼20 mg·L-1會導(dǎo)致斑馬魚幼魚的神經(jīng)毒性作用，表現(xiàn)為新生神經(jīng)元的密度和面積降低。Sales 等［12］通過24 h 藥物染毒實驗，發(fā)現(xiàn)阿片類藥物（嗎啡和可待因）10 mg·L-1誘導(dǎo)斑馬魚胚胎眼睛發(fā)育缺陷等畸形，同時通過行為學(xué)實驗證明，胚胎接觸阿片類藥物產(chǎn)生的特殊行為是基于神經(jīng)缺陷。

本研究結(jié)果表明，芬太尼誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚心臟毒性和神經(jīng)毒性與nkx2.5，npas4a和sox9b表達(dá)的下調(diào)和nppb表達(dá)的上調(diào)相關(guān)。nkx2.5是心臟發(fā)育相關(guān)基因，在斑馬魚早期傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育過程中起到維持正常心率的作用。Ren 等［19］利用nkx2.5的顯著下降作為關(guān)鍵指標(biāo)考查環(huán)境細(xì)顆粒物（PM2.5）對斑馬魚的心臟發(fā)育毒性，同時證明白藜蘆醇的處理可以部分抵消PM2.5對斑馬魚胚胎心臟的毒性。npas4a是前腦神經(jīng)發(fā)育的重要調(diào)控基因，Klaric等［20］證明斑馬魚npas4a的表達(dá)僅限于大腦，隨著響應(yīng)神經(jīng)元活動而被上調(diào)，是前腦發(fā)育標(biāo)志物。Gu等［21］利用斑馬魚模型開發(fā)了大范圍篩查評估擴(kuò)張型心肌病的模型，該模型的特點是心房和心室水腫、液體在心臟中沉積、心臟收縮力下降和心室面積擴(kuò)大等，這些表現(xiàn)與芬太尼引起的心臟毒性相似。nppb是一種心臟腔室分化特異性標(biāo)志基因，它可以編碼nppb 蛋白。研究表明，慢性心衰患者的血清中nppb 水平更高，這也是一種常用的心衰診斷標(biāo)志物。高劑量芬太尼和慢性心衰都可能會導(dǎo)致心肌功能下降，而nppbmRNA 水平的變化可能成為評估這些疾病的一個重要指標(biāo)。斑馬魚sox9b基因在心臟瓣膜、心內(nèi)膜細(xì)胞及動脈球中表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控對于心肌細(xì)胞的發(fā)育和功能是必需的。Hofsteen 等［22］報道二唑惡英類化合物誘導(dǎo)斑馬魚心臟畸形（心包水腫、心臟拉長和血液循環(huán)減少），其中sox9b為心外膜形成所必需，參與心肌細(xì)胞和新生心外膜細(xì)胞之間的信號。這些研究說明芬太尼造成的心臟毒性與心臟的發(fā)育和功能衰竭相關(guān)，神經(jīng)毒性與前腦發(fā)育相關(guān)，但有關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究結(jié)果表明芬太尼暴露會對斑馬魚胚胎產(chǎn)生心臟毒性和神經(jīng)毒性。雖并不能完全模擬人體，但仍具有一定的參考價值，特別可為孕婦和青少年接觸和使用芬太尼提供風(fēng)險預(yù)警。